专利名称：一种重组腺病毒及其应用的制作方法类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性系统紊乱疾病，其临床表现主要为对称性关节肿痛、侵蚀性滑膜炎，甚至进行性关节损伤、畸形、伤残，有时可累及眼、肺等关节外脏器。这种疾病困扰着全世界1-2%的人群，其中大多数是中年妇女，且大多数患者有慢性反复发作的病程。类风湿性关节炎的致残率很高，其治疗一直是人们关注的热点。目前，对类风湿性关节炎的治疗主要包括如非留体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、自体造血干细胞移植以及基因治疗等多种方法。随着对类风湿性关节炎发病机制的深入研究，人们提出了越来越多的治疗类风湿性关节炎的新策略，使许多患者病情得到缓解，但目前尚无根治方法。因此，研究新的治疗类风湿性关节炎的药物势在必行。对于类风湿性关节炎的治疗策略主要是控制相关炎症因子的平衡。目前以抑制促炎因子TNF-α和IL-I β的活性为重点，利用针对这两种促炎因子的抗体和其受体融合蛋白在临床应用上也取得了一定的效果，但是，还有一部分病人对于阻断这两种因子的治疗不敏感。因此，针对这一部分病人的治疗，需要研究其他的药物治疗策略。大量的研究表明，类风湿性关节炎病人的滑膜液中含有大量的Thl7细胞并高表达IL-17，这种促炎因子在关节炎的病理过程的上游起作用，能够刺激巨噬细胞分泌TNF-α和IL-I β，也能够诱导滑膜细胞产生IL-6，IL-8，GM-CSF，PSE2 (prostaglandin E2)等因子。已经有研究表明，用 IL-17抗体中和IL-17后，CIA小鼠早期关节炎症减轻或消失，晚期CIA小鼠的骨损伤能够有一定程度的恢复。Thl7细胞分泌的IL-17包括IL-17A和IL-17F。这两个炎症分子都是通过IL-17 受体家族传递信号，从而影响下游基因表达的。
本发明的一个目的是提供一种重组腺病毒及其应用。本发明提供的重组腺病毒，为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞，装配得到的重组腺病毒；所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞是通过重组载体实现的；所述重组载体为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体Ad-Track-CMV的Hind IIII和EcoR V识别位点间得到的质粒。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。所述宿主细胞为真核细胞。所述真核细胞为离体的哺乳动物细胞，优选为HEK-293细胞。本发明的另一个目的是提供一种重组载体。本发明提供的重组载体，为Ad-Easy和重组穿梭质粒经过同源重组得到的载体；所述重组穿梭质粒为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因插入到载体Ad-Track-CMV的Hind III和EcoR V识别位点间得到的质粒。所述重组腺病毒或所述重组载体在制备预防和/或治疗自身免疫疾病产品中的应用也是本发明保护的范围。所述自身免疫疾病为类风湿性关节炎。所述产品为药物。本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的疫苗。本发明提供的一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的疫苗，它的活性成分所述重组腺病毒或所述重组载体。本发明的实验证明，本发明构建和纯化Ad/hIL-17RD-E⑶-Fc的腺病毒载体，构建 CIA小鼠模型，用Ad-hIL-17RD-E⑶-Fc对CIA小鼠进行预防和治疗，最后通过He染色评价分析CIA小鼠关节炎症及骨损伤的减轻程度，从而为类风湿性关节炎的治疗提供一种新的有效的方法，并利用腺病毒介导的hIL-17RD受体的显性负突变体Ad/hIL-17RD-E⑶-Fe，开发能够通过抑制IL-17家族信号传导来治疗类风湿性关节炎的新候选药。图1 为 Ad-hIL-17RD-ECD_Fc 的酶切鉴定图2为重组腺病毒Ad-hIL17RD-E⑶-Fc以及对照腺病毒Ad-GFP在293细胞中的表达图3为Wfestern blot对重组腺病毒表达物进行检测图4为Ad-IL17RD-ECD_Fc对于CIA小鼠关节炎的预防作用图5为Ad-IL17RD-ECD_Fc对于CIA小鼠关节炎的治疗作用
盲实验。2、Ad/hIL-17RD-ECD-Fc对于CIA小鼠关节炎的预防和治疗将过敏后的小鼠分为如下两组处理，每组8只小鼠预防小组21天后，在小鼠腹腔注射注射弗氏不完全佐剂乳化的终浓度为lmg/ml 的CII，同时腹腔注射IO8Pfu的Ad/hIL-17RD-ECD-Fc，每3天注射1次共4次，预防阴性对照小组21天后，在小鼠腹腔注射注射弗氏不完全佐剂乳化的终浓度为lmg/ml的CII，同时腹腔注射108pfu的Ad/GFP，每3天注射1次共4次；实验重复三次，结果取平均值。注射后在第27、29、32、34天观察预防对照小组每只小鼠在第27、四、32、34天的鼠掌厚度分别为2. 6mm、3. 1mm、 3. 7mm,3. 8mm ；关节炎评分分别为 0、0. 6、1. 3,1. 5 ；预防小组每只小鼠在第27、四、32、；34天的鼠掌厚度分别为2. 6mm,2. 6mm,2. 7mm、 2. 8mm ；关节炎评分分别为0、0、0. 6、0. 5。将各组取1只小鼠采用断颈处死后，将其膝关节和踝关节分离并用10% (质量百分含量)福尔马林固定4天，用5% (质量百分含量)的甲酸脱钙后，样本进行石蜡包埋，组织切片(7um)根据HE染色分析CIA小鼠关节炎的预防结果，结果如图4所示，A为鼠掌厚度 (将上述数值作图)，B为关节炎评分(将上述数值作图)，从图C，D中可看出，预防组Ad/ IL-17RD-E⑶-FcHE染色中炎症细胞(蓝紫色，箭头所指的区域)明显少于预防对照组Ad/GFP，说明预防组病情好于预防对照组，预防组的小鼠炎症程度明显低于对照组。将上述二次致敏后产生关节炎的D B A-I小鼠根据其病情分组，进行如下分组处理，每组小鼠8只(1. 25分病情的小鼠进行注射108pfuAd/IL-17RD-E⑶-Fc治疗)治疗组将1. 25分病情小鼠腹腔注射IO8Pfu的Ad/IL-17RD_E⑶-Fc进行治疗，每 3天注射1次，共5次，治疗对照组将1. 25分病情小鼠腹腔注射IO8Pfu的Ad/GFP进行治疗，每3天注射1次，共5次，治疗对照小组每只小鼠在注射病毒后的第46、49、52、M、59、61天的鼠掌厚度分别为 3. 6mm、4. 25mm、4. lmm、4. 2mm、4. 15mm、3. 9mm ；关节炎评分分别为 1. 25,2. 25、2、2、 2. 25,1. 7 ；治疗小组每只小鼠在注射病毒后第46天、49天、52天、54天、59天、61天的鼠掌厚度分别为 3. 6mm、3. mm、3. 4mm,3. 35mm,3. 25mm、3. 2mm ；关节炎评分分别为 1. 25、1. 3、1. 1、 0. 9、0· 9、0· 8。将各组取1只小鼠采用断颈处死后，将其膝关节和踝关节分离并用10% (质量百分含量)福尔马林固定4天，用5% (质量百分含量)的甲酸脱钙后，样本进行石蜡包埋，组织切片(7um)根据HE染色分析CIA小鼠关节炎的治疗结果，作图如图5所示，A为鼠掌厚度 (将上述数值作图)，B为关节炎评分(将上述数值作图)，从C，D图中可看出，治疗组Ad/ IL-17RD-E⑶-FcHE染色中炎症细胞(蓝紫色，箭头所指的区域)明显少于治疗对照组Ad/ GFP,说明治疗组病情好于治疗对照组。


本发明公开了一种重组腺病毒及其应用。本发明提供的重组腺病毒，为将白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞，得到的重组腺病毒；所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。所述白介素17受体D胞外区Fc融合蛋白的编码基因转入宿主细胞通过重组载体实现；本发明的实验证明，本发明构建和纯化Ad/hIL-17RD-ECD-Fc的腺病毒载体，构建CIA小鼠模型，用Ad-hIL-17RD-ECD-Fc对CIA小鼠进行预防和治疗，最后通过He染色评价分析CIA小鼠关节炎症及骨损伤的减轻程度，从而为类风湿性关节炎的治疗提供一种新的有效的方法。