专利名称：基于被破坏的腺病毒的抗滥用药物疫苗的制作方法基于被破坏的腺病毒的抗滥用药物疫苗 相关申请的交叉引用本专利申请要求在2010年3月17日提交的美国临时专利申请US61/314，847以及2010年8月13日提交的美国临时专利申请US61/373，704的权益，其通过引用并入本文。 关于联邦政府资助的声明本发明在美国国立卫生研究院提供的基金号为R01DA025305、RC2DA028847和HHSN271200800585P的政府资助下进行。政府享有对本发明的某些权利。药物成瘾是世界范围的主要问题。虽然采取了多种策略来预防和治疗药物成瘾， 但巨大的经济和社会成本仍然与药物成瘾相关。尽管为了开发预防和治疗药物成瘾的策略，人们进行了数十年的努力，但是收效甚微。在尼古丁成瘾方面，积极的行为干预例如个体或群体咨询，或单独的认知治疗，或与药物治疗相结合，如尼古丁替代疗法(例如，通过嚼口香糖、透皮贴齐 、鼻腔喷齐 、吸入剂或锭剂)、安非他酮(ΖΥΑΒΝ )，和伐尼克林(CHANTIX )等，都提高了戒烟的成功率，但其成功率始终仅高于安慰剂组的I. 5到2倍，长期(I年)停止吸烟率仅为5%到20%。在治疗可卡因成瘾方面同样没有成功案例，目前还没有小分子、单克隆抗体或酶疗法被批准用于预防或治疗可卡因成瘾。疫苗代表了预防和治疗药物成瘾的另一种策略，抗尼古丁和其他小分子，例如可卡因和吗啡/海洛因，的疫苗方面的研究结果已有报道(Carrera等，Proc. Natl.Acad. Sci USA,98:1988-1992(2001) ；Anton 和 Leff, Vaccine,24:3232-3240(2006)；Carrera 等，Nature,378:727-730 (1995) ；Hat sukami 等，Cl in.Pharmaco I·Ther.,78:456-467(2005) ；Maurer 等，Eur.J. Immunol.，35:2031-2040(2005))。 但在有效疫苗的开发中最主要的障碍是，大多数的成瘾药物，就像大多数小分子那样，都是弱免疫原。可以通过将药物(或其类似物)与大分子，例如蛋白质，进行化学偶联，来提高成瘾药物的免疫原性，使用这种策略的疫苗已经在动物和人体中进行了测试(参见，例如，Bonese,等，Nature, 252:708-710 (1974) ；Killian,等，Pharmacol.Biochem. Behav.，9:347-352(1978) ；Carrera 等，Nature, 378:727-730(1995) ；Carrera等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 98:1988-1992 (2001) ；Carrera 等，Proc. Nat. Acad. Sci.USA, 97:6202-6206 (2000) ；Fox 等，Nat. Med.，2:1129-1132 (1996) ;Kantak 等，Psychopharmacology (Berl)，148:251-262 (2000);和 Moreno 等，Mol. Pharm.，7:431-441 (2010))。尽管这些方法取得了一定成功，但是通过将成瘾性药物的类似物偶联至大分子载体所激发的免疫的程度是有限的(参见，例如，Kantak等，参照前述；Keyler等，Int. Immunopharmacol.，8:1589-1594(2008);和 Kinsey 等，Immunol. Cell Biol.，87:309-314(2009))。直接针对某些成瘾药物的抗体也已有报道(参见，例如，Hardin等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,285:1113-1122 (1998) ；Proksch 等，J.Pharmacol.Exp.Ther. , 292:831-837 (2000);和 Byrnes-Blake 等,Int. ImmunopharmacoI. , 1:329-338 (2001))。因此，需要其他的组合物和方法来预防或治疗药物成瘾。本发明即提供了这样的组合物和方法。本发明下文中提供的详细说明能使本发明的上述以及其他优点更加清楚。 发明简述本发明提供了一种在人体内诱导针对抗原的免疫应答的方法。该方法包括给予人腺病毒-抗原偶联物，其含有(a)被破坏的带有外壳蛋白的腺病毒和(b)偶联至被破坏的腺病毒的外壳蛋白的抗原，其中所述抗原被呈递至人体免疫系统，从而在人体中诱导针对抗原的免疫应答。本发明还提供了一种腺病毒-抗原偶联物，其含有(a)被破坏的带有外壳蛋白的腺病毒和(b)偶联至被破坏的腺病毒的外壳蛋白的抗原。本发明提供了一种偶联物，其含有(a)分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白和(b)偶·联至分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白的抗原。本发明进一步提供了一种腺相关病毒载体，其含有编码直接针对可卡因抗体的核酸序列，且该核酸序列可操作地与启动子连接，其中所述核酸序列可以在人体内表达以产生所述抗体。 附图简要说明图IA举例说明了使用I-乙基-3-[3_ 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(S-NHS)将GNC偶联至腺病毒衣壳蛋白的步骤。图IB是免疫印迹的结果，显示了 GNC共价偶联至腺病毒衣壳蛋白(第I道Ad5LacZ,第2道偶联至GNC的被破坏的Ad5 (30:1),和第3道偶联至GNC的被破坏的Ad5 (100:1))。图IC是免疫印迹的结果，显示了在腺病毒-GNC偶联物中腺病毒衣壳蛋白的表达(第4道未偶联的Ad5LacZ，第5道偶联至GNC的被破坏的Ad5(30:1的比例)，和第6道偶联至GNC的被破坏的Ad5 (100:l))o图ID显示dAd5GNC缺乏感染能力，通过dAd5GNC疫苗无法介导其LacZ转基因的表达进行评价。图2A显示了如实施例I所述诱导的抗-GNC IgG抗体的总滴度随时间的变化。在第0、3和6周，肌内免疫接种给予BALB/c小鼠(n=20) 4 μ gdAd5GNC。在第0、2、7和13周用ELISA评价抗体滴度，ELISA针对偶联至BSA的GNC，结果以平均值土SEM表示。图2B显示了用实施例I所述方法诱导的抗-GNC抗体的免疫球蛋白同种型。用ELISA对血清进行评价，ELISA使用针对IgGl、IgG2a、IgG2b和IgM的同种型特异性二抗。抗体滴度以平均值土SEM表示。图2C显示了 dAd5GNC免疫血清与BSA-GNC结合的抑制，通过ELISA在存在浓度增加的GNC或可卡因的情况下进行检测。图2D显示了用3H-可卡因激发空白小鼠和经dAd5GNC免疫的小鼠后，所述BALB/c小鼠的脑和血清中可卡因的水平。图中显示了在空白小鼠和经免疫小鼠的脑(ng/g脑)和血清(ng/mL血清)中可卡因的水平，以及处理组中可卡因在血液中的水平与在脑中水平的比(g/mL)。图2E显示了用3H-可卡因(2. 5 μ g)激发Balb/c小鼠后,该Balb/c小鼠中结合至IgG的血清可卡因的分数。暴露于3H-可卡因I分钟后，收集血清，将其与蛋白G琼脂糖混合，评价结合的3H-可卡因(即，结合至IgG的3H-可卡因)相对于上清液中3H-可卡因的比。图3A为各组小鼠自主活动的可视化追踪的示意图，各组小鼠分别为用PBS激发的空白小鼠(第I列)、用25yg可卡因激发的空白小鼠(第2列)、用25yg可卡因激发的dAd5GNC-免疫小鼠(第3列)、用50 μ g可卡因激发的空白小鼠(第4列)，以及用50 μ g可卡因激发的dAd5GNC_免疫小鼠(第5列)。图3B显示了空白小鼠和dAd5GNC_免疫小鼠经PBS或50 μ g可卡因激发后的累积走动时间，其为时间的函数。各处理组的统计数据(Kolmogorov-Smirnov检验)如下(1)dAd5GNC+PBS组(对照)对比空白+PBS组(对照)(D=0. 18,p>0. 14)，(2)空白+可卡因组对比两个对照组，dAd5GNC+PBS 组(D=0. 8，ρ〈0· 0001)，和空白 +PBS 组(D=O. 9，ρ〈0· 0001)，(3)空白+可卡因组对比dAd5GNC+可卡因组(D=O. 7，p〈0. 0001)，(4) dAd5GNC+可卡因组对比两个对照组，空白 +PBS 组(D=O. 35，ρ〈0· 0005)，和 dAd5GNC+PBS 组(D=0. 21，ρ〈0· 0005)。 图3C的饼状图显示了空白小鼠或dAd5GNC_免疫小鼠在经PBS或50 μ g可卡因激发后，用于走动、直立、刻板活动和休息的时间的百分比。各处理组的统计数据(卡方检验)如下(l)dAd5GNC+PBS组(对照)对比空白+PBS组(对照)(X2=O. 53，p>0. 9)，(2)空白+可卡因组对比两个对照组，dAd5GNC+PBS 组(X2=28. 0，p〈0. 0001),以及空白 +PBS 组(p〈0. 0001),(3)空白+可卡因组对比dAd5GNC+可卡因组(X2=32. 5，p〈0. 0001),以及(4)dAd5GNC+可卡因组对比两个对照组，空白 +PBS 组(X2=O. 99，ρ>0· 8)，以及 dAd5GNC+PBS 组(X2=L 6，ρ>0· 6)。所有这些研究均在27cmx27cm Med Associates室(圣奥尔本斯，佛蒙特州)中进行。图4A显示了在连续数周每周一次的试验中(n=15只/组),用可卡因(25 μ g)或PBS激发空白和dAd5GNC-免疫Balb/c小鼠，在激发后10分钟内总的移动距离。各处理组的统计数据(重复测定方差分析)如下(l)dAd5GNC+可卡因组对比空白+可卡因组(F=40.9，ρ〈0· 0005)，(2) dAd5GNC+ 可卡因组对比 dAd5GNC+PBS 组(F=0. 83，ρ>0· 3)，(3) dAd5GNC+可卡因组对比空白+PBS组(F=0. 1，p>0. 7)，以及(4) dAd5GNC+PBS组对比空白+可卡因组(F=190，p<0. 0001);空白+可卡因组对比空白+PBS组(F=158，p〈0. 0001)。所有组内重复测定方差分析的统计表明，在各重复测定之间不具有显著性差异(F=O. 97，p>0. 4)。图4B显示了在连续数周每周一次的试验中(n=15只/组),用可卡因(50 μ g)或PBS激发空白和dAd5GNC-免疫Balb/c小鼠，在激发后10分钟内总的移动距离。各处理组的统计数据(重复测定方差分析)如下(l)dAd5GNC+可卡因组对比空白+可卡因组(F=14.4，p<0. 006), (2) dAd5GNC+ 可卡因组对比 dAd5GNC+PBS 组(F=O. 8，ρ>0· 4)，(3) dAd5GNC+ 可卡因组对比空白+PBS组(F=L 3，p>0. 2)，(4) dAd5GNC+PBS组对比空白+可卡因组(F=46. 2，p〈0. 0001)，以及(5)空白+可卡因组对比空白+PBS组(F=46. 2，p〈0. 0001)。所有组内重复测定方差分析的统计表明，各重复测定之间不具有显著性差异(F=O. 08，p>0. 9)。图5的示意图描述了腺病毒六邻体和含有非天然赖氨酸残基的纤维蛋白的产生。发明详述本发明是基于，至少部分基于，一个理解，即可以通过将成瘾药物的抗原或其衍生物偶联到腺病毒，特别是被破坏的腺病毒(例如，经加热和/或去垢剂处理的)，的衣壳上从而产生有效的成瘾药物的疫苗。腺病毒之所以是成瘾药物抗原的理想载体，是因为腺病毒与抗原呈递细胞(如树枝状细胞)间有很强的相互作用，因此可以作为佐剂诱导针对其自身的免疫应答。通过将成瘾药物的抗原偶联到一个或多个腺病毒的衣壳蛋白上(如，六邻体蛋白，五邻体基底蛋白，纤维蛋白，蛋白IX，或其他蛋白)，可以使免疫系统将成瘾药物的抗原认为是腺病毒的一部分，并对该药物产生免疫应答。并不一定是任何具体的理论，但可认为 ，由于腺病毒衣壳蛋白的固有性质，包括其大小、结合亲和力(包括内源的结合亲和力，和基因工程改造后增强的结合亲和力)，可以使成瘾药物(或其衍生物或类似物)具有高免疫原性。腺病毒(Ad)是一种36kb的双链DNA病毒，其可在体内将DNA高效地转移到多种不同的靶细胞类型中。本申请中使用的术语“腺病毒”，包括“腺病毒载体”以及从腺病毒载体增殖得到的“腺病毒粒”或者“腺病毒体”。因此，术语“腺病毒”、“腺病毒载体”、“腺病毒粒”和“腺病毒体”是同义词，并可以互换使用。在本发明所述方法中，来自多种来源、亚型或混合亚型的腺病毒都可以用作腺病毒载体的病毒基因组的来源。虽然非人类腺病毒(例如，猿腺病毒、禽腺病毒、犬腺病毒、绵羊腺病毒，或牛腺病毒)可以用于产生腺病毒载体，但是优选人类腺病毒作为腺病毒载体的病毒基因组的来源。例如，腺病毒可以是A亚群(如，血清型12,18和31),B亚群(如，血清型3、7、11、14、
16、21、34、35 和 50)，C 亚群(如，血清型 1、2、5 和 6)、D 亚群(如，血清型 8、9、10、13、15、17、
19、20、22-30、32、33、36-39 和 42-48)、E 亚群(如，血清型 4)、F 亚群(如，血清型 40 和 41)、未分类的血清型(如，血清型49和51)，或任何其他腺病毒血清型。腺病毒血清型I到51(即，Adl到Ad51)可以从美国模式培养物保藏中心获得(ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚)。优选地，在本发明的描述中，所述腺病毒载体是人类C亚群，特别是血清型2或者更优选地血清型5。非C群的腺病毒也可以用于本发明的描述。用于构建非C群腺病毒载体的优选腺病毒包括 Adl2 (A 群)、Ad7 和 Ad35 (B 群)、Ad28 和 Ad30 (D 群)、Ad4 (E 群)，和 Ad41 (F 群)。关于非C群的腺病毒载体，制备非C群腺病毒载体的方法，和使用非C群腺病毒载体的方法已有公开，例如在美国专利号5，801，030,5, 837，511和5，849，561，以及国际专利申请公开号 TO97/12986 和 W098/53087 中所述。腺病毒载体可以含有多个亚型的混合物，因此可以是“嵌合”腺病毒载体。嵌合腺病毒载体可以含有衍生自两个或多个(如，2、3、4等)不同腺病毒血清型的腺病毒基因组。在本发明的描述中，嵌合腺病毒载体或腺病毒载体可以包含大约不等量或等量的两个或多个不同腺病毒血清型中每种的基因组。为绕过人体中已有的抗腺病毒免疫力，已经开发出了基于非人类病原体的新腺病毒血清型的腺病毒载体，包括C7载体，其基于黑猩猩腺病毒(参见，例如 Farina 等，J. Virol.，75:11603-11613 (2001),和 Hashimoto 等，Infect.Immun.，73:6885-6891(2005))，以及猿腺病毒载体，包括sAd36载体(参见，例如Calcedo等，J. Virol.，83:2623-2631 (2009)，和 Roy 等，J. Gene Med.，13:17-25 (2011))。因此，腺病毒载体也可以基于非人类灵长类动物腺病毒。例如，这些腺病毒可以是AdC7或sAd36。非人类灵长类动物血清型不会在人群中流传，因此，人类不会具有可以中和抗体的已有血清。即使在已存在Ad5免疫力的情况下，基于非人类灵长类来源的血清型的疫苗也能产生有效的体液免疫应答，以对抗与多种病原体偶联的相关抗原。本发明的腺病毒是被破坏的腺病毒。“被破坏的”腺病毒指经加热和/或一种或多种去垢剂处理过的腺病毒，以便在哺乳动物中给予非感染性的腺病毒或腺病毒载体，借此改善其在体内的安全性。在这个方面，经温和去垢剂处理过的腺病毒显示出病毒衣壳被破坏，并释放出核蛋白核心、多组九个六邻体衣壳蛋白、游离的外周六邻体、五邻体基底以及纤维衣壳蛋白(参见，例如 Molinier-Frenkel 等,J. Virol. , 76:127-135 (2002), Boulanger 等，J. Gen. Virol.，44:783-800(1979)，Boulanger,等，FEBS Lett.，85:52-56(1978)，和 Nermut, The Architecture of Adenoviruses, pp. 5-34,in H. S. Ginsberg (ed.), “TheAdenoviruses, ”Plenum Press,纽约，纽约州(1984))。尽管能够生产出高浓度的被破坏的腺病毒，但其在相对较低的剂量下就能起作用，即使是在人体内已有抗腺病毒免疫力的情况下，而后者则需要非常大量的完整的、感染性腺病毒来与其对抗。可以采用本领域公知可以破坏病毒结构的任意适宜的去垢剂处理腺病毒。此类去垢剂的例子包括去氧胆酸钠(D0C)、十二烷基硫酸钠(SDS)。可以对腺病毒进行“加热”处理，即通过将腺病毒暴露于高于约50° C的温度，例如约50° C至约70° C。可以将腺病毒暴露于约50° C或更高、约55° C或更高、约60° C或更高或约65° C或更高的温度。或者，或此外，可以将腺病毒暴露于约70° C或更低、约65° C或更低、约60° C或更低或约55° C或更低的温度。这样，可以将腺病毒暴露于上述任意两点之间的温度。例如，可以将腺病毒暴露于约50° C至约55° C、约55。C至60。C、约60。C至约65。C、约65。C至约70。C的温度。优选地，在将成瘾药物(或其类似物)偶联至腺病毒的外壳蛋白之前，通过加热或使用去垢剂处理破坏腺病毒或腺病毒载体。·本发明的腺病毒载体可以是可复制型的。例如，所述腺病毒可以在腺病毒基因组中具有突变(如，缺失、插入或替换)，该突变不会抑制病毒在宿主细胞中的复制。所述腺病毒载体还可以是有条件的可复制型。但是，优选地，所述腺病毒优选在宿主细胞中是复制缺陷型的。“复制缺陷型”或“复制缺损型”是指腺病毒需要补充腺病毒基因组的一个或多个复制所需的区域，因为，例如，至少一个复制必需的基因功能带有缺陷(即，因此所述腺病毒载体不能在典型的宿主细胞中复制，特别是那些在本发明方法中可以被所述腺病毒载体感染的人类患者的细胞中)。基因、基因功能、基因或基因组区域中的缺陷，在本发明中被定义为病毒基因组中足以消除或削弱该基因功能的遗传物质的突变或缺失(如，所述基因产物的功能因此降低至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍)，该基因的核酸序列全部或部分地突变或缺失。破坏复制必需的基因功能通常不需要缺失整个基因区。但是，为了在腺病毒基因组中给一个或多个转基因提供足够的空间，可以优选地去除基因区的大部分。虽然优选利用遗传物质缺失的方式，但是通过插入或替换获得的遗传物质突变也适用于破坏基因功能。复制必需的基因功能是复制(如增殖)中需要的基因功能，并且由，例如，腺病毒早期区(如，E1、E2和E4区)、晚期区(如L1-L5区)、参与病毒包装的基因(如，IVa2基因)，以及病毒相关的RNA (如VA-RNAl和/或VA-RNA-2)所编码。复制缺陷的腺病毒或腺病毒载体优选地需要补充腺病毒基因组中一个或多个区域的至少一个复制必需基因功能用于病毒复制。优选地，所述腺病毒需要补充腺病毒基因组中病毒复制所需的ElA区、ElB区、或E4区的至少一个基因功能(称为El缺陷型或E4缺陷型腺病毒载体)。最优选地，所述腺病毒的El区的至少一个复制必需的基因功能(优选地所有的复制必需的基因功能)有缺陷，以及非必需的E3区的至少一个基因功能有缺陷(如，E3区的Xba I缺失)(称为E1/E3缺陷的腺病毒载体)。对El区而言，腺病毒可以在部分或全部ElA区和/或部分或全部ElB区有缺陷，如，ElA和ElB区的每个区的至少一个复制必需的基因功能有缺陷，因此，需要补充腺病毒基因组中的ElA区和ElB区用于复制。所述腺病毒也可以需要补充腺病毒基因组的E4区用于复制，例如在E4区的一个或多个复制必需的基因功能有缺陷。当腺病毒的腺病毒基因组中的一个区域的至少一个复制必需基因功能有缺陷时(如El-或E1/E3-缺陷型腺病毒载体)，该腺病毒被称为“单复制缺陷型”。特别优选的单复制缺陷型腺病毒是，例如，需要，最多需要，补充腺病毒基因组El区，就可以增殖该腺病毒(例如，形成腺病毒粒)的复制缺陷型腺病毒。
所述腺病毒可以是“多复制缺陷型”，这是指所述腺病毒在腺病毒基因组的两个或多个区的每个区的一个或多个复制必需的基因功能有缺陷，并且需要补充这些功能用于复制。例如，前述的El-缺陷型或E1/E3-缺陷型腺病毒可以进一步地在E4区(称为E1/E4-或E1/E3/E4-缺陷型腺病毒或腺病毒载体)，和/或在E2区(称为E1/E2-或E1/E2/E3-缺陷型腺病毒或腺病毒载体)，优选地在E2A区(称为E1/E2A-或E1/E2A/E3-缺陷型腺病毒或腺病毒载体)的至少一个复制必需基因功能有缺陷。优选地，所述腺病毒最多需要补充腺病毒基因组的El区、E2A区、和/或E4区的复制必需基因功能(即，增殖)用于复制。但是，可以根据操作者的需要修饰腺病毒基因组，从而破坏一个或多个复制必需基因功能，只要腺病毒仍保持缺陷且可以使用，例如，互补细胞(complementing cells)和/或编码被破坏的复制必需基因功能的外源DNA (如辅助腺病毒)，进行增殖。在这方面，腺病毒的复制必需基因功能的缺陷可以只在腺病毒基因组的早期区、只在腺病毒基因组的晚期区、在腺病毒基因组的早期区和晚期区、或者是所有的腺病毒基因(即，高容量腺病毒载体(Hc-Ad)，参见Morsy等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA,95:965-976(1998)，Chen 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94:1645-1650(1997)，和Kochanek等，Hum. Gene Ther. , 10:2451-2459 (1999) ) 适合的复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体，包括单和多复制缺陷型腺病毒载体，已在下述文献中公开美国专利号5，837，511、5，851，806,5, 994，106,6, 127，175,6, 482，616 和 7，195，896 ;美国专利申请公开号2001/0043922A1,2002/0004040A1,2002/0110545A1 和 2004/0161848A1 ;以及国际专利申请公开号 W094/28152、TO95/02697、TO95/16772、W095/3467U W096/22378、TO97/12986、W097/21826 和 W003/022311。除了编码复制必需基因功能的腺病毒序列有修饰(如，缺失、突变或替换)，所述腺病毒基因组还可以含有良性或非致死性的修饰，即不会使腺病毒复制缺陷的，或优选地，不会对病毒功能和/或病毒蛋白生产带来负面影响的修饰，即使这样的修饰是在含有复制必需基因功能的腺病毒基因组的区域中。这样的修饰通常由DNA操控所导致，或者用于协助表达载体的构建。例如，这可能有助于在腺病毒基因组中除去或引入限制性酶切位点。这样的良性突变通常对病毒的功能没有可检测的负面作用。复制缺陷的腺病毒载体通常在互补细胞系中生产，互补细胞系提供适当水平的基因功能，以产生高滴度的病毒载体储备，复制缺陷的腺病毒载体中不具有这些基因功能，但其却为病毒增殖所必需。优选地，互补细胞系含有腺病毒核酸序列，其整合到细胞基因组中，并编码腺病毒增殖所必需的基因功能。优选地，所述细胞系进一步的特征在于，它含有与腺病毒载体不重叠的互补基因，这减小了，并实际地消除了，载体基因组与细胞DNA发生重组的可能性。这样的互补细胞系的构建包括标准的分子生物学和细胞培养技术，例如在下述公开中所描述Sambrook 等，Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rdedition, Cold Spring Harbor Press,冷泉港，纽约州(2001),和 Ausubel 等，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,纽约，纽约州(1994)。用于制备腺病毒的互补细胞系包括，但不限于，293细胞(参见Graham等，J.Gen. Virol.，36，59-72 (1977)的描述)、PER. C6细胞(描述于，如国际专利申请公开号W097/00326和美国专利号5，994，128和6，033，908)，和293-0RF6细胞(描述于，如国际专利申请公开号 W095/34671 和 Brough 等，J. Virol. , 71:9206-9213 (1997))。其他对于互补细胞的描述，例如，美国专利号6，677，156和6，682，929和国际专利申请号W003/20879。在某些情况下，所述细胞基因组不需要含有这样的核酸序列，即其基因产物能补充复制缺陷型腺病毒或腺病毒载体的所有缺陷。在复制缺陷的腺病毒载体中缺少的一个或多个复制必需的基因功能可以通过辅助病毒来提供，辅助病毒例如腺病毒载体，其能跨位提供目标腺病毒载体复制所需的一个或多个必需基因功能。辅助病毒通常被改造以防止感染性的辅助病毒的包装。例如，通过互补细胞提供腺病毒基因组El区的一个或多个复制必需的基因功能，而通过辅助病毒提供该腺病毒基因组E4区的一个或多个复制必需的基因功能。 腺病毒的外壳蛋白(如，六邻体，纤维，和五邻体基底蛋白)可以被操控以改变特定宿主免疫系统对病毒的识别。对腺病毒来说，这样的操控可以包括纤维、五邻体或六邻体的区域的缺失，在外壳蛋白的某些部分插入多个天然或非天然的配体，等等。外壳蛋白的操控能够影响腺病毒与宿主中的抗原提呈细胞之间的相互作用，由此改变腺病毒的免疫原性。可以使用任何合适的技术改变腺病毒的外壳蛋白。例如，可以利用不同的纤维长度。可选地，这可以通过在五邻体基底或纤维突起添加结合序列来实现。结合序列的添加可以通过双特异性或多特异性结合序列来直接或间接地完成。在另一实施方式中，腺病毒纤维蛋白可以被改造，以减少在纤维茎中的氨基酸数目，由此制得“短茎的”纤维(例如，美国专利号5，962，311中所描述)。在另一个实施方式中，编码与腺病毒外壳蛋白的天然结构相关的氨基酸残基的核酸残基可以被改变、补充或缺失(参见，例如，国际专利申请公开号W000/15823，Einfeld 等，J. Virol.，75 (23):11284-11291 (2001)，和 van Beusechem 等，J.Virol.，76(6) :2753-2762(2002))，从而使得含有突变核酸残基的(或具有通过其编码的纤维蛋白的)腺病毒在哺乳动物中的免疫原性发生改变(与野生型腺病毒相比)。在这个方面，可以除去或破坏天然柯萨奇病毒与腺病毒受体(CAR)和整合素结合的腺病毒的位点，分别例如，腺病毒的纤维蛋白的突起结构域和位于腺病毒五邻体基底的Arg-Gly-Asp (RGD)序列。或者，可以在纤维突起加入氨基酸，只要纤维蛋白保持三聚化的能力就行。适合的残基包括，在血清型5纤维突起结构域的暴露环中的氨基酸，例如，AB环、DE环、FG环和HI环，其进一步描述见，例如，Roelvink等，Science, 286:1568-1571 (1999)，和美国专利号6，455，314。可以突变或去除五邻体基底蛋白中任何适合的氨基酸残基。适合的残基包括，例如，位于Ad5五邻体基底蛋白高变区的5个RGD氨基酸序列基序中的一个或多个(例如，美国专利号5，731，190中所描述)。在优选的实施方式中，本发明的方法包括腺病毒，其含有外壳蛋白和偶联到该外壳蛋白上的抗原。这些抗原可以被偶联到任何外壳蛋白上，例如，六邻体，纤维，或五邻体基底。“抗原”是指在哺乳动物中，引发针对病原体或化合物的免疫应答的分子，上述抗原即源自所述病原体或化合物。“免疫应答”可以包括，例如，抗体生成和/或免疫效应细胞(如T细胞)的活化。这些抗原可以含有其任意抗原表位，优选地，其在哺乳动物，特别是人体中，引起针对抗原的免疫应答。“表位”是指一种被抗体或抗原受体识别的结构。表位在本领域中也被称为“抗原决定簇”。在本发明所述的抗原可以含有任意亚基、片段或任意蛋白分子的表位，其包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、原生动物、朊病毒、细胞或细胞外来源的蛋白或肽，理想地，其在哺乳动物中激发免疫应答，优选地引起保护性免疫。抗原还可以是小分子。术语“小分子”是指分子量小于约1，000g/mol的物质或化合物。优选地，本发明的所述小分子是半抗原。“半抗原”是指只有在偶联至载体物质，如蛋白质时，才会引发免疫应答的小分子，载体物质可以被抗原呈递细胞处理并呈递给免疫系统。通常，半抗原是经过修饰的小分子，其可以连接至载体物质(例如，腺病毒衣壳蛋白)，并且通过免疫系统识别未经修饰的小分子的途径，其可以被呈递至宿主的免疫系统。进一步地，所述半抗原的特征在于其是半抗原-载体物质偶联物的特异性决定部分，即，半抗原在游离状态下能够与特异于该半抗原的抗体反应。在未免疫的成瘾对象中，不存在针对所述半抗原的抗体。
“病原体”指导致其宿主患病的致病原。适宜的病原体包括,例如,病毒、细菌、寄生虫、真菌(例如，曲霉)、原生动物或阮病毒。在一个实施方式中，病原体是病毒。抗原可以是分离自任意病毒的肽，病毒包括但不限于，来自下述任意病毒家族的病毒沙粒病毒、动脉炎病毒、星状病毒、杆状病毒、杆状DNA病毒、杆菌状核糖核酸病毒、双核糖核酸病毒、雀麦花叶病毒、布尼亚病毒、杯状病毒(例如，诺罗病毒(也称为“诺沃克样病毒”))、毛状病毒、香石竹潜病毒、花椰菜花叶病毒、环病毒、线性病毒、缸豆花叶病毒、冠状病毒(例如，冠状病毒，如严重急性呼吸综合征(SARS)病毒)、覆盖噬菌体、囊状噬菌体、δ病毒、香石竹病毒、碗豆耳突花叶病毒、丝状病毒(例如，马尔堡病毒和埃博拉病毒(例如，扎伊尔、莱斯顿、象牙海岸或苏丹毒株))、黄病毒(例如，丙型肝炎病毒、I型登革热病毒、2型登革热病毒、3型登革热病毒和4型登革热病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒(例如，乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如，1、2、3、4、5和6型人类疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒、和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、低毒病毒、虹彩病毒、光滑病毒、硫化叶菌病毒、微小噬菌体、正粘病毒(例如，流感病毒A和B)、乳多空病毒、乳头瘤病毒(例如，人乳头瘤病毒(HPV))、副黏液病毒(例如，麻疹、腮腺炎、和人呼吸合胞体病毒(RSV))、细小病毒、小核糖核酸病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、肝病毒、和口蹄疫病毒(例如，手足口病病毒))、痘病毒(例如，牛痘病毒)、(例如，轮状病毒)、逆转录病毒(例如，慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV) I和HIV 2)、弹状病毒和整体病毒。本申请中具体引用的抗原肽仅为了举例说明可以用于本发明中任意病毒蛋白的例子。或者，或另外，抗原可以是分离自细菌的肽。这些肽可以来源于任意细菌，包括但不限于，放线菌、项圈藻、杆菌、拟杆菌、蛭弧菌、茎菌、衣原体(例如，沙眼衣原体)、绿硫菌、着色菌、梭菌(例如，肉毒杆菌毒素)、棒状杆菌(例如，白喉毒素)、噬细胞菌、异常球菌、埃希氏杆菌、盐杆菌、幽门螺杆菌、生丝微菌、甲烷杆菌、微球菌、乳酸分支杆菌(例如，结核分支杆菌)、支原菌(、粘球菌、奈瑟氏菌、硝化菌、颤藻菌、原绿藻、变形杆菌、假单孢菌、光合菌、立克次体、沙门氏菌、志贺氏杆菌(例如，志贺氏杆菌)、螺旋菌、螺旋体、葡萄球菌、链球菌、链霉菌、硫化叶菌、热原体、硫杆菌和密螺旋体。在另一个实施方式中，抗原可以是分离自寄生虫的肽，寄生虫例如但不限于，孢子虫门(也称为顶复亚门)、纤毛亚门、根足亚纲或动物鞭毛虫门的寄生虫。抗原还可以是动物产生的毒素或其部分(肽或非肽)。毒素可以由任意动物产生。此类毒素的例子包括河豚毒素(由河豚鱼产生)、类毒素_a (由藻类产生)、树蛙毒素(由两栖类产生)、留体生物碱(由两栖类产生)以及蛇毒。或者，抗原可以分离自人，即抗原可以是能够刺激自身免疫的人自身组织的任意组成部分(即，“自身抗原”)。抗原还可以是肿瘤抗原。“肿瘤抗原”指由肿瘤细胞而非正常细胞表达的抗原，或在正常细胞中表达但在肿瘤细胞中过表达的抗原。适宜的肿瘤抗原的例子包括，但不限于，β -连环蛋白、BCR-ABL融合蛋白、K-ras、N_ras、PTPRK, NY-ESO-1/LAGE-2、SSX-2、TRP2-INT2、CEA, gplOO、激肽释放酶 4、前列腺素特异性抗原(PSA)、TRP-I/gp75、TRP-2、酪氨酸酶、EphA3、HER-2/neu、MUC1、p53、mdm_2、PSMA, RAGE-1、存活素、端粒酶和WT1。其他肿瘤抗原均为本领域所公知的，并且在下述公开中描述的，例如，由路德维格癌症研究所维护的T-细胞定义的肿瘤抗原的肽数据库(http://www. cancerimmunity.org/statics/databases, htm) ；Van den Eynde 等，Curr. Opin. Immunol.，9:684-93(1997)；Houghton 等，Curr. Opin. Immunol.，13:134-140 (2001)；以及 van der Bruggen 等，Immunol. Rev.，188:51-64(2002)。抗原还可以是激素或肿瘤生长所需的生长因子(例如，促黄体生成素释放激素(LHRH))。在另一个实施方式中，抗原是成瘾药物抗原。在这个方面，抗原可以是成瘾药物的一部分(即，表位)、成瘾药物的类似物或衍生物，或成瘾药物的模拟表位，其诱导针对成瘾药物的免疫应答。“模拟表位”是指大分子，例如肽，其模拟表位的结构并诱导与表位引发的抗体应答相同的抗体应答。“类似物”或“衍生物”是指在天然原子、基团或亚结构的位置上或以外具有一个或多个不同的原子、官能团或亚结构的抗原。“部分”指含有至少三个氨基酸(例如，约3个至约800个氨基酸)的氨基酸序列。优选地，“部分”包括3个或更多(例如，5个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、25个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多，或100个或更多)个氨基酸残基，但少于整个抗原(例如，800个或更少、700个或更少、600个或更少、500个或更少、400个或更少、300个或更少、200个或更少、或100个或更少的氨基酸残基)。优选地，部分为约3至约500个氨基酸(例如，约I O、100、300或500个氨基酸)，约3至约300个氨基酸(例如，约20、50或200个氨基酸)、或约3至约100个氨基酸(例如，约15、40、60、70或90个氨基酸)、或由任意两个前述值定义的范围。更优选地，“部分”包括不超过约300个氨基酸(例如，约3至约250个氨基酸、约10至约200个氨基酸，或约50至约100个氨基酸，或由任意两个前述值定义的范围)。使用成瘾药物的类似物、衍生物或其部分可以提供本发明的多个有益效果，例如，可促进与腺病毒外壳蛋白的偶联或增强所述免疫应答。优选地，所述类似物、衍生物或其部分所诱发的免疫应答，等于或大于其所来自的成瘾药物所产生的免疫应答。例如，对于成瘾药物的溶液构象而言，与针对含有原始成瘾药物的腺病毒的应答中所产生的抗体相比，含有成瘾药物类似物的腺病毒产生的抗体具有更高的滴度、特异性、亲和力和/或亲合性。所述抗原可以是任何成瘾药物，或其部分或类似物。适用于本发明的成瘾药物的示例类别包括，但不限于，阿片、吗啡衍生物、镇静剂、分离麻醉剂、大麻、迷幻剂、兴奋剂、处方药物、合成代谢类激素、吸入剂和俱乐部药物。在这些类别中的具体的药物例子包括，但不限于，尼古丁、可卡因、芬太尼、海洛因、吗啡、鸦片、羟可酮、氢可酮、氯胺酮、五氯苯酚(PCP)、巴比妥类、苯二氮卓类、氟硝西泮、丙种羟基丁酸盐(GHB)、甲喹酮、印度大麻、大麻、麦角酸二乙基酰胺(LSD)、三甲氧苯乙胺、裸盖菇素、安非他明、可卡因、二亚甲基双氧苯丙胺(MDMA )、甲基苯丙胺和哌醋甲酯。在一个实施方式中，抗原可以是尼古丁。多种尼古丁半抗原、载体物质以及偶联的方法都已有描述。可以使用本领域已知的任何适当的方法将尼古丁偶联到腺病毒上。例如，尼古丁可以在6-位或I-位通过连接基团偶联至腺病毒的外壳蛋白，如之前对尼古丁 -BSA偶联物和尼古丁 -KLH偶联物所述(参见，例如，Matsushita等，Biochem.Biophys. Res. Comm. , 57:1006-1010(1974);Castro 等,Eur. J. Biochem. , 104:331-340(1980) ; Noguchi 等,Biochem. Biophys. Res. Comm. , 83:83-86 (1978)；和 Isomura 等,J. Org.Chem.，66:4115-4121 (2001))。尼古丁还可以通过吡啶环偶联至腺病毒，如国际专利申请公开号W099/61054中所述，或通过吡咯烷环偶联，如美国专利号6，232，082中所述。
所述抗原还可以是尼古丁类似物。适宜的尼古丁类似物包括任何可以在哺乳动物中引发免疫应答(体液或细胞介导)的尼古丁类似物。尼古丁类似物在本领域中公知(参见，例如，Cerny 等,Onkologie, 25:406-411 (2002) ; Lindblom 等,Respiration, 69:254-260(2002);de Villiers 等,Respiration, 69:247-253(2002);Tuncok 等,Exp. Clin. Psychopharmacol. , 9:228-234(2001);Hieda 等，Int. J. ImmunopharmacoI. , 22:809-819 (2000);Pentel 等，Pharmacol. Biochem. Behav.，65:191-198(2000);Isomura 等，J. Org.Chem. ,66:4115-4121(2001)；和 Meijler 等，J. Am. Chem. Soc.，125:7164-7165 (2003))。例如，尼古丁类似物可以是N-琥珀酰基-6-氨基-(+/_)尼古丁(Castix)等，Biochem.Biophys. Res. Commun.，67:583-589 (1975) )、6_ (σ -氛基癸酸胺基)_(+/_)-尼古丁(Noguchi 等，Biochem. Biophys. Res. Comm.，83:83-86(1978))、O-玻拍酸基-3’ -轻甲基-尼古丁(Langone 等，Biochemistry, 12:5025-5030 (1973)；和 Meth.Enzymol. , 84:628-640 (1982)),或 3’-(轻甲基)_ 尼古丁半琥拍酸酯(Langone 等，参照前述，Abad等，Anal. Chem.，65:3227-3231 (1993))。其他适用于本发明的尼古丁类似物的例子如美国专利号6，232，082和6，932，971中所述。在一个优选实施方式中，所述尼古丁类似物是AM3。新的尼古丁类似物也可以用于本发明所述，新的尼古丁类似物的例子如国际专利申请公开号WO 2009/149252中所述。在另一个实施方式中，抗原可以是可卡因。例如，可卡因的游离酸、苯甲酰可卡因和苯甲酰芽子碱的重氮盐，或可卡因和去甲可卡因的对-亚氨基酯衍生物(例如美国专利号4，123，431 ;4，197，237 ;和6，932，971中所述)可以偶联至腺病毒。优选将可卡因类似物设计为化学偶联至腺病毒蛋白，以减小非可卡因样结构的形成，但仍保持可卡因部分的抗原决定簇(参见，例如，Carrera等，Nature, 378:727-730(1995))。适于用作本发明所述抗原的可卡因类似物的其他例子在美国专利号5，876，727中有描述。此外，所述抗原可以是酰化的芽子碱甲酯、琥珀酰化的芽子碱甲酯、琥珀酰化的去甲可卡因或苯甲酰芽子碱。优选地，所述抗原是可卡因类似物6-(2R，3S)-3-(苯甲酰氧基)-8-甲基-8-氮杂双环[3. 2. I]羊烧-2-擬酸氧基_己酸(GNC)或6- ((2R, 3S) -3-(苯甲酸氧基)-8-甲基-氮杂双环[3· 2. I]辛烷-2-甲酰胺基)己酸)(GNE)。将半抗原偶联至蛋白载体物质上的方法在本领域中公知，可以很容易地将其应用于抗原与病毒外壳蛋白的偶联。对于上述方法的描述参见，例如Samtoook等，参照前述，Ausubel 等，参照前述；和 Harlow 和 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory,冷泉港，纽约州(1988)。大量的官能团可以用于促进半抗原与腺病毒外壳蛋白的偶联。这包括功能性片段，例如羧酸、酸酐、混合酸酐、卤化酰基、酰基叠氮化合物、卤代烷基、N-马来酰亚胺、亚胺酯、异氰酸酯、胺、巯基、异硫氰酸酯，以及本领域公知的其他片段。这些片段能够与腺病毒外壳蛋白的反应性基团形成共价键。根据所使用的功能性片段，所述反应性基团可以是腺病毒外壳蛋白上的赖氨酸残基的游离氨基或半胱氨酸残基的游离巯基，它们在反应后生成酰胺、胺、硫醚、脒脲或硫Wong, Chemistry of Protein Conjugation andCross-Linking(CRC Press,Inc.,1991);Hermanson, Bioconjugate Techniques(AcademicPress, 1996) ;Dick和 Beurret, “Conjugate Vaccines, ^Contrib. Microbiol. Tmmunol · , I0:48-114 (Karger, Basal, 1989)中所述。
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抗原与腺病毒外壳蛋白的偶联可以使用同-双功能交联剂，例如戊二醛、DSG、BM[PE0] 4或BS3，其具有可与腺病毒外壳蛋白的胺基或羧基反应的官能团。优选地，所述抗原与腺病毒外壳蛋白的偶联是通过使用异-双功能交联剂进行化学交联。一般来说，在该方法的第一步(通常称为衍生化)，腺病毒与交联剂反应，由此得到含有一个或多个活化外壳蛋白的腺病毒。在第二步中，用例如凝胶过滤或透析的方法除去未反应的交联剂。在第三步中，抗原与活化的外壳蛋白反应或“偶联”。在可选的第四步中，除去未反应的抗原。本领域中已知多种异-双功能交联剂。例如，这些异-双功能交联剂可以含有官能团，这些官能团可以与腺病毒外壳蛋白的赖氨酸残基的游离氨基反应，或者这些官能团可以与抗原上存在的半胱氨酸残基或巯基反应并由此形成硫醚键。半胱氨酸残基或巯基可以是抗原上天然存在的，或者通过还原得到以用于上述反应，或者通过改造或接到抗原(如，半抗原)上，以及可选地通过还原反应而得到的。本领域已知多种这样的异-双功能交联剂，包括，例如，SMPH、Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB,Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB 和 SIA，它们可以通过商业途径获得，如 Pierce ThermoFisher Scientific (罗克福德,伊利诺伊州，美国)。一种优选的连接基团是琥珀酰官能团，其在抗原与腺病毒衣壳表面暴露的ε氨基之间形成琥拍酰亚胺酯交联(Leopold等，Hum. Gene Ther. , 9:367-378 (1998)和Miyazawa等，J. Virol.，73:6056-6065(1999))。含有琥珀酰官能团的连接基团的例子有，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)及其不带电类似物N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，它们用于将羧基转化成与氨基反应的Sulfo-NHS酯类。加入Sulfo-NHS酯类能提高碳二亚胺化合物介导的偶联反应的效率，碳二亚胺化合物例如EDAC (I-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)，其将羧基偶联到伯胺上，并可以用于与Sulfo-NHS的连接。与巯基结合的马来酰亚胺也可以用于将成瘾药物的抗原偶联到腺病毒的外壳蛋白上。每个腺病毒粒上偶联的抗原数目是调控抗原引发免疫应答的一个因素。可以根据本发明所述使用本领域已知的多种策略来优化偶联的抗原数目。例如，可以通过改变实验条件,例如每种反应物的浓度、一种反应物对另一种反应物过量、pH、温度和离子强度等，来影响所述腺病毒外壳蛋白与交联剂衍生化的程度。同样地，可以通过改变以上所述实验条件来调节偶联的程度，即每个腺病毒粒上的抗原数目，从而满足疫苗的需要。偶联的程度还可以表示为每个腺病毒壳粒上的抗原数目。“壳粒”是指由大的外壳蛋白形成的腺病毒衣壳的形态上的亚单位。腺病毒体的外部衣壳由252个壳粒组成(参见，例如，van Oostrum和Burnett, J. Virol.，56:439-448(1985))。用来制备本发明所述腺病毒-抗原偶联物的腺病毒壳粒与抗原分子的比例(即，Ad: Ag)可以是，例如1:1或更高，如，1:3或更高、1:10或更高，或1:30或更高。或者，或此外，Ad:Ag的比例可以是1:1000或更少，如1:500或更少、1:300或更少或1:100或更少。因此，AchAg的比例可以是在上述任意两个端值之间。例如，AchAg 的比例可以是 I:-1:1000,1:3-1:500,1:10-1:300,1:10-1:100 或 1:30-1:100。腺病毒衣壳蛋白一旦偶联到成抗原上，则可以通过对半抗原进行免疫印迹和质谱(例如，MALD-TOF MS)定量，或通过比色法检测腺病毒外壳蛋白上的游离官能团，来 测定偶联的相对程度。每个壳粒达到O. 3到2. O抗原分子的偶联率(或每个腺病毒粒上大约80到500个抗原分子)相当于(Leopold等，Hum. Gene Ther. , 9:367-378(1998))中所述的对于荧光团Cy3观察到的偶联水平。“过偶联”的腺病毒可以有利于半抗原介导的免疫接种。因此，在过偶联的腺病毒中每个腺病毒粒上的抗原分子数目可以是40或更多，例如，80或更多、120或更多，或200或更多。或者，或此外，在过偶联的腺病毒中每个腺病毒粒上的抗原分子数目可以是1000或更少，例如，750或更少、500或更少，或者300或更少。因此，每个腺病毒粒上的抗原分子数量可以在以上任意两个端值之间。例如，在过偶联的腺病毒中每个腺病毒粒上的抗原分子数目可以是40-1000、80-750、120-500、200-500，或200-300。假设抗原的亲和力相等，那么在抗体滴度和疫苗效力之间可能存在正相关。因此，增加偶联到腺病毒上抗原的数目可以增强其免疫原性。在腺病毒衣壳蛋白(如，六邻体)上暴露的赖氨酸残基提供了游离的氨基，可以作为含有羧酸盐基团的抗原的结合靶点，许多前述的交联反应剂优选地与赖氨酸残基反应。在所述腺病毒外壳蛋白上添加或去除一个或多个赖氨酸残基，以使偶联至腺病毒外壳蛋白上的抗原分子数目最大化可能是有益的。因此，腺病毒外壳蛋白优选地含有一个或多个非天然赖氨酸残基(例如，I个或更多、3个或更多、5个或更多，或7个或更多个赖氨酸残基)。或者，或此外，非天然赖氨酸残基的数目可以是25或更少，如20或更少，15或更少，或10或更少。因此，非天然赖氨酸残基的数目可以在上述任意两个端值之间。例如，非天然赖氨酸残基的数目可以是1-25、3-20、5-10、5-15，或7-10。含有至少一个非天然赖氨酸残基或缺失至少一个天然赖氨酸残基的外壳蛋白可以是任何腺病毒外壳蛋白(例如，纤维、五邻体基底、或六邻体)。优选地，含有至少一个非天然赖氨酸残基或缺失至少一个天然赖氨酸残基的外壳蛋白是六邻体蛋白。当在六邻体蛋白中增加非天然赖氨酸残基时，优选地将赖氨酸残基加入到六邻体蛋白的一个或多个弹性环中。可以使用本领域公知的标准分子生物学技术来产生如本发明所述的修饰的外壳蛋白(参见，例如，Sambrook等，参照前述，和Ausubel等，参照前述)。在本发明的另一个实施方式中，所述腺病毒可以含有一个或多个转基因，其中每个编码的蛋白能刺激免疫系统中一种或多种细胞。“转基因”是指可以通过腺病毒载体携带，并在细胞中表达的任意异源的核酸序列。“异源核酸序列”是指并非获得自、衍生自、或者基于腺病毒的天然核酸序列的任何核酸序列。腺病毒可以含有至少一个本申请所述的转基因，即，腺病毒可以含有如本申请所述的一个转基因或如本申请所述的多于一个的转基因(即，两个或多个转基因)。所述转基因优选地编码蛋白(即，编码一个或多个蛋白的一个或多个核酸序列)。普通技术人员可以理解，任意种类的核酸序列(例如，DNA、RNA和cDNA)都可以被插入到如本发明所述使用的腺病毒中。在优选的实施方式中，所述转基因编码可增强动物免疫应答的蛋白。例如，转基因可以编码这样的蛋白，其可以提高针对腺病毒衣壳上的六邻体的体液免疫应答。或者，转基因可以编码这样的蛋白，其可以增强针对腺病毒-抗原偶联物的细胞介导的免疫应答。上述一种或多种转基因可以编码，例如，树枝状细胞活化蛋白(如，CD40L), B细胞活化蛋白(如，B细胞活化因子(BAFF))，T细胞活化蛋白(如，IL-15)，或其组合。优选地，上述一个或多个转基因编码刺激B细胞活性的蛋白。更优选地，腺病毒含有编码BAFF的转基因。腺病毒中的一个或多个转基因优选地作为表达盒的一部分存在，所述表达盒即，一种特定的核苷酸序列，其具有促进核酸序列亚克隆和恢复的功能(例如，一个或多个限制性位点)或者具有表达核酸序列的功能(例如，多聚腺苷酸化或剪接位点)。上述一个或多个转基因可以位于腺病毒的任何适当的区域。优选地，上述一个或多个转基因位于El区(例 或者，或此外，一个或多个转基因可以位于E4区(例如，替换整个或部分E4区)。优选地，转基因可操作地连接于(S卩，受转录调控于)一个或多个启动子元件。将序列可操作地连接在一起的技术为本领域公知。“启动子”是DNA序列，其引导RNA聚合酶结合并由此促进RNA合成。当启动子能够引导核酸序列的转录时，该核酸序列便“可操作地连接”到启动子上。对与启动子可操作地连接的核酸序列来说，启动子可以是天然的或非天然的。任何启动子(B卩，不管是从自然分离得到，还是由重组DNA或合成技术生产得到)都可以用于本发明以提供异源核酸序列(例如，转基因)的转录。优选地，启动子能够引导在真核细胞(优选地哺乳动物)中的转录。任何合适的启动子序列都可以用于本发明所述。在这一方面，转基因可以可操作地连接于病毒启动子。合适的病毒启动子包括，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子(例如，美国专利号5，168,062和5，385，839，和GenBank登录号X17403中所描述)、衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子，例如HIV长末端重复序列启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，例如RSV长末端重复序列、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、HSV启动子，例如疱疫胸腺激酶启动子(Wagner 等,Proc. Natl. Acad. Sci. , 78:144-145 (1981))、衍生自SV40或爱波斯坦巴尔病毒的启动子等等。另外，转基因可以可操作地连接于细胞启动子上，即驱动细胞蛋白表达的启动子。优选地，可用于本发明的细胞启动子依赖于所需的转基因表达谱。在一方面，细胞启动子优选在多个细胞种类，例如免疫系统细胞(如树枝状细胞)中，起作用的组成型启动子。适宜的组成型启动子可以驱动编码转录因子的基因的表达、管家基因的表达或真核细胞共有的结构基因的表达。组成型活性细胞启动子为本领域所公知，并且包括，例如，阴阳I (YYl)启动子、JEM-I启动子、泛素启动子和延伸因子a (EFl α )启动子。除了组成型启动子以外，启动子还可以是可诱导的启动子，即可根据适当的信号而上调和/或下调的启动子。福射能量源或者压迫细胞的物质(substance thatdistresses cells)可以上调启动子。例如，可以通过药物、激素、超声波、光活化化合物、射频、化疗和低温冷冻上调启动子。因此，调控转基因表达的启动子序列可以含有至少一个异源调控序列，其可以对外源物质的调控起反应。适合的可诱导的启动子系统包括，但不限于，IL-8启动子、金属硫蛋白可诱导启动子系统、细菌IacZYA表达系统、四环素表达系统，和T7聚合酶系统。进一步地，还可以在不同的发育阶段选择性地活化的启动子(例如，球蛋白相关的启动子在胚胎中和成人中区别地转录球蛋白基因)。在另一个实施方式中，启动子可以是组织特异性的启动子，即启动子在给定组织中优选地被激活，并导致基因产物在被激活的组织中表达。普通技术人员可以根据靶组织或细胞种类，对适用于本发明的组织特异性的启动子进行选择。转基因与启动子的可操作地连接为本领域所公知，并且可以通过常规的重组DNA技术实现，重组DNA技术的描述参见,例如Sambrook等，参照前述,和Ausubel等，参照前述。为优化蛋白的生产，优选地，转基因进一步含有转基因编码序列的多聚腺苷酸化位点3’。可以使用任意适合的多聚腺苷酸化序列，包括合成的优化序列，以及BGH (牛生长激素)、小鼠球蛋白D (MGD)、多瘤病毒、TK (胸腺激酶)、EBV (爱波斯坦巴尔病毒)，以及乳头瘤病毒，包括人乳头瘤病毒和BPV (牛乳头瘤病毒)的多聚腺苷酸化序列。优选的多聚腺苷 酸化序列是SV40 (人肉瘤病毒-40)多聚腺苷酸化序列。此外，优选地，所有适当的转录信号(以及如果适合的话，翻译信号)都正确排列，使得每个核酸序列都适当地在其被引入的细胞中表达。如果需要的话，异源核酸序列还可以包含剪接位点(即，剪接受体和剪接供体的位点)从而促进mRNA的产生。本发明还提供了腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码针对可卡因的抗体的核酸序列，并且该核酸序列可操作地连接至启动子，其中核酸序列可以在人体内表达以产生抗体。AAV是DNA病毒，已知其不会导致人类疾病。为了进行有效复制，AAV需要与辅助病毒(即，腺病毒或疱疹病毒)共感染，或表达辅助基因。如有需要，递送AAV rep蛋白能够将包含AAV ITR的AAV载体整合至基因组的特定区域。包含整合的AAV基因组的宿主细胞，并未体现出细胞生长或形态学方面的改变(参见，例如，美国专利号4，797，368)。编码针对可卡因的抗体的核酸序列，能够编码本领域已知的任意此类抗体(或其部分)。例如，核酸序列能够编码与可卡因结合的单克隆抗体GNC92H2 (Redwan等，Biotechnol.Bioeng.，82(5) : 612-8 (2003))。在另一个实施方式中，可以使用编码抗体的核酸序列，该抗体分离自经本发明所述偶联物免疫接种的哺乳动物。不依赖于针对可卡因的抗体来源，编码抗体的核酸序列能够编码整个抗体分子，或其任意的抗原-结合片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链Fvs (scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs,或包含或Vh结构域的片段。而且，优选地，核酸序列编码单克隆抗体。在给予本发明所述腺病毒-抗原偶联物产生应答的哺乳动物中产生的抗体、包含腺病毒外壳蛋白和抗原的本发明所述的偶联物，或本发明所述的腺病毒-相关病毒载体均可以被分离，并用于多种用途。当从非人类的哺乳动物中分离所述抗体时，可以将抗体人源化以便用于随后的人体给药。非人类(如鼠源性)抗体的“人源化”形式是指嵌合抗体，其含有最少量的衍生自非人类免疫球蛋白的序列。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基被来自非人类物种，如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物，的高变区残基(供体抗体)替换，后者高变区具有所需的特异性、亲和力和容量。在某些例子中，人免疫球蛋白的框架区残基被对应的非人类残基替换。而且，人源化抗体可以包含在受体抗体或在供体抗体中不存在的残基。这些修饰是为了进一步改进抗体的表现。人源化的抗体可以基本包含下述全部情况至少一个可变结构域，和某些情况下两个可变结构域，其中全部的或基本全部的高变区对应于那些非人类免疫球蛋白的超变区，并且全部，或基本上全部的框架区是人类免疫球蛋白序列的框架区。可选地，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白恒定区，的至少一部分。更详细的描述参见Jones等，Nature, 321:522-525 (1986), Reichmann 等,Nature, 332:323-329 (1988)，和 Presta, Curr.Op. Struct. Biol. ,2:593-596(1992)。制备人源化抗体的方法通常为本领域所公知，可以很容易地应用到根据本申请所述方法制备的抗体上。本发明还提供了腺病毒-抗原偶联物，其包含带有外壳蛋白的腺病毒和偶联至腺病毒外壳蛋白的成瘾药物的抗原。上文中与本发明方法的实施方式相关的对于腺病毒、成瘾药物抗原、偶联等等的描述，也可用于前述腺病毒-抗原偶联物的相同方面。本发明进一步提供了偶联物，其包含分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白，以及偶联至分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白的抗原。“分离的”是指将核酸或蛋白从其天然环境中分离。“纯化的”是指对于给定的核酸或蛋白，无论其是从天然环境中分离(包括基因组DNA和·mRNA)或合成的(包括cDNA)和/或在实验室条件下扩增的，其具有增加的纯度，其中“纯度”是相对的术语，而不是“绝对纯度”。然而，可以理解的是，可以使用稀释剂或佐剂将核酸和蛋白制剂，并且仍可根据实用目的将其分离。例如，当用于引入细胞时，将核酸与可接受的载体或稀释剂混合。外壳蛋白可以是本文所描述的任意腺病毒外壳蛋白，如六邻体蛋白、纤维蛋白或五邻体基底蛋白。上文中与本发明方法和本发明腺病毒-抗原偶联物的实施方式相关的抗原、偶联等等的描述，也可用于前述包含分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白的偶联物的相同方面。如上文所讨论的，可以将抗原通过赖氨酸残基偶联至腺病毒外壳蛋白。当将抗原通过赖氨酸残基偶联至腺病毒外壳蛋白时，增加或去除腺病毒外壳蛋白上的一个或多个赖氨酸残基，对于使连接至腺病毒外壳蛋白的抗原分子数目最大化是有益的。因此，分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白优选含有一个或多个非天然的赖氨酸残基(例如，I个或更多、3个或更多、5个或更多、或7个或更多赖氨酸残基)。或者，或此外，非天然赖氨酸残基的数目可以是25或更少，如20或更少，15或更少，或10或更少。因此，非天然赖氨酸残基的数目可以在以上任意两个端值之间。例如，非天然赖氨酸残基的数目可以是1-25、3-20、5-10、5-15，或 7-10。本发明提供了组合物，其含有(a)腺病毒-抗原偶联物以及(b)其载体。本发明还提供了组合物，其含有(a)包含分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白和抗原的偶联物，以及(b)其载体。优选地，组合物是药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)组合物，其含有载体，优选药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)载体，以及腺病毒-抗原偶联物。如本发明所述可以使用任何适宜的载体，且这样的载体为本领域所公知。载体的选择可以取决于，部分取决于，组合物要给药的具体位点以及用于组合物给药的具体方法。组合物优选地不含有可复制型腺病毒。可选地，组合物可以是无菌的，除了本申请描述的腺病毒-抗原偶联物除外。组合物的适宜的制剂包括水性和非水溶液、等渗的无菌溶液，其可含有抗氧剂、缓冲剂和抑菌剂，以及水性和非水的无菌混悬剂，其可含有助悬剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以置于单剂量或多剂量的密封容器内，如安瓿和小瓶，可以在冷冻干燥(冻干)的条件下储存，只需在临用前加入无菌液体载体，例如，水。临用溶液和混悬液可以从无菌粉末、颗粒、片剂和已有描述的类似制备。优选地，载体是缓冲盐溶液。更优选地，偶联物是以组合物制剂给药，以便在给药前保护偶联物不受破坏。例如，组合物可以被制剂以减少偶联物在用于制备、储存或给药偶联物的装置，例如玻璃容器、针管或针头，上的损失。组合物可以被制剂从而降低偶联物的光敏性和/或温度敏感性。为实现这个目的，所述组合物优选地含有药学上可接受的液体载体，例如，上述的载体，以及选自下述的稳定剂聚山梨酯80，L-精氨酸，聚乙烯吡咯烷酮，海藻糖，及其组合。这样的组合物可用于延长偶联物的贮存寿命，有助于给药，并提高本发明方法的效果。关于含有腺病毒的组合物的制剂的进一步描述参见，例如，美国专利号6，225，289，美国专利号6，514，943，美国专利申请公开号2003/0153065A1，和国际专利申请公开号W000/34444中。还可以为提高转导效率而将组合物制剂。此外，本领域的普通技术人员可以理解，偶联物可以与其他的治疗剂或生物活性剂同处于组合物中。例如，控制炎症的因子，例如布 洛芬或留类，可以作为组合物的一部分用于减轻与偶联物体内给药相关的肿胀和炎症。免疫系统刺激剂或佐剂，如白介素、脂多糖和双链RNA，都可以给药用于增强或改善针对抗原的免疫应答。可以含有抗生素，即，杀微生物剂和杀真菌剂，以治疗已有的感染和/或减少可能被感染的风险，例如与基因转移操作相关的感染。偶联物优选地给药于哺乳动物(如，人)，并在其中弓I发针对抗原的免疫应答。这些免疫应答可以是体液免疫应答、细胞介导的免疫应答，或者，优选地，体液和细胞介导的免疫应答的组合。理想地，在接触抗原后的免疫应答提供临床益处。当抗原是成瘾药物或其类似物时，“临床益处”可以是，例如，减轻成瘾药物的生理作用，减轻与这些成瘾药物的使用相关的满足和快感，或降低对药物重新成瘾的可能性。但是根据本发明的描述，临床益处并不是必需的。本发明的方法还可以用于生产和获得抗体。例如，本发明的方法可以用于生产用于诊断的抗体(例如，用于检测血液中存在的成瘾药物或抗原)。偶联物的给药可以是在哺乳动物中引发免疫应答的多步治疗方案中的一个组成部分。特别地，本发明的方法可以在初次和增强免疫的治疗方案中作为一个治疗组。在这个方面，该方法进一步包括在给予哺乳动物包含本发明偶联物的组合物后，再给予哺乳动物增强组合物。在这个实施方式中，因此，给予含有本发明的腺病毒-抗原偶联物的组合物“启动” 了免疫应答，给予增强组合物则“增强”免疫应答。或者，本发明的方法进一步包含向哺乳动物给予含有本发明腺病毒-抗原偶联物的组合物之前给予哺乳动物初免组合物。在这个实施方式中，因此，给予初免组合物“启动” 了免疫应答，给予含有腺病毒-抗原偶联物的组合物则“增强” 了免疫应答。初免组合物或增强组合物可以包含本发明的偶联物(例如，本发明的腺病毒-抗原偶联物)，或含有编码目标抗原(或其类似物)的核酸序列的基因转移载体。可以使用任意基因转移载体，包括病毒或非病毒基因转移载体。适宜的病毒基因转移载体的例子包括，但不限于，逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体、疱疹病毒载体、副流感病毒-呼吸道合胞病毒(RSV)嵌合载体(PIV-RSV)以及腺病毒载体。适宜的非病毒载体的例子包括，但不限于，质粒、脂质体和分子偶联物(例如，转铁蛋白)。优选地，初免组合物或增强组合物包含质粒或腺病毒载体。或者，通过给予含有或不含适宜佐剂的抗原本身(或其类似物)能够启动或增强免疫应答。在一个实施方式中，初免组合物和增强组合物均包含腺病毒-抗原偶联物，该偶联物使用血清型5腺病毒(Ad5)。或者，初免组合物和增强组合物可分别含有不同血清型的腺病毒。例如，初免组合物可以包含使用了血清型5腺病毒的腺病毒-抗原偶联物，而增强组合物可以包含使用了非人类灵长类腺病毒(例如，C7或sAd36)的腺病毒-抗原偶联物。反之，初免组合物可以包含使用了非人类灵长类腺病毒(例如，C7或sAd36)的腺病毒-抗原偶联物，而增强组合物则包含使用了血清型5腺病毒的腺病毒-抗原偶联物。本领域的普通技术人员可以理解，腺病毒血清型的任意组合物均可以用于初免-增强方案中，以使针对特定抗原激发的免疫应答最大化。在另一个实施方式中，初免组合物和增强组合物均含有本发明的偶联物，该偶联物包含分离的或纯化的腺病毒外壳蛋白和抗原。在这个方面，初免组合物和增强组合物的偶联物可以含有相同或不同的腺病毒外壳蛋白，其可以来自相同的或不同的腺病毒血清型。例如，初免组合物可以包含偶联物，其含有来自人类腺病毒(例如，Ad5)或非人类灵长类 腺病毒(例如，C7或sAd36)的六邻体蛋白，而增强组合物可以包含偶联物，其含有来自相同的或不同腺病毒的六邻体蛋白。或者，初免组合物可以包含偶联物，其含有来自人类腺病毒(例如，Ad5)或非人类灵长类腺病毒(例如，C7或sAd36)的纤维蛋白，而增强组合物可以包含偶联物，其含有来自人类腺病毒(例如，Ad5)或非人类灵长类腺病毒(例如，C7或sAd36)的TK邻体蛋白。在另一个实施方式中，初免组