专利名称：生产天然杀伤细胞的方法天然杀伤细胞(NK细胞)是在免疫反应中发挥作用的淋巴细胞。由于天然杀伤细胞具有多种功能，特别是具有强的杀伤肿瘤细胞的活性，因而认为该细胞是免疫学监督机制的重要成员，所述机制用于去除在活体内已变得肿瘤性或正变得肿瘤性的异常细胞。因此，对于在肿瘤治疗中有效利用该细胞已进行了长时间的研究。例如，当向外周血单核细胞(PBMC)的培养基中添加大量的白介素(IL)_2 (—种淋巴因子)时，所谓的淋巴因子激活性杀伤淋巴细胞(LAK细胞)在人中增殖约一周。普遍已知LAK细胞包括许多NK细胞。在肿瘤的过继性免疫疗法中普遍使用LAK细胞。也已知LAK细胞在感染性疾病中有效，并作为治疗难以用抗生素治愈的感染性疾病的对策引起注意。迄今为止，已报道了多种离体培养NK细胞的方法(例如，非专利文献1)，其分为使用辅助细胞的方法和不使用辅助细胞的方法。不使用辅助细胞的方法是包括用IL-2或IL-15刺激PBMC的方法。然而，该方法通常导致低的细胞扩增率(cell expansion rate)和培养后低的NK细胞含有率，因此，可能不能获得根据PBMC供体的治疗必需量的NK细胞。此外，已报道当为了获得大量的NK细胞而延长培养期时，细胞毒性活性降低。另一方面，使用辅助细胞的方法是例如包括使用已经受放射线的K562细胞(其为B淋巴细胞株)、Daudi细胞(其为恶性淋巴细胞株)或HFWT细胞(其为肾母细胞瘤细胞株)的方法。此外，也已经报道了这样的方法，所述方法包括使用转染了细胞因子表达基因的上述肿瘤细胞作为辅助细胞。然而，由于这些辅助细胞是肿瘤细胞、异源细胞和基因转染的细胞，因而从向活体内注射与辅助细胞混合培养的NK细胞的观点出发，必需大量地注意来确保安全性。此外，也已经报道了包括使用放射线照射的PBMC作为辅助细胞的方法(专利文献1)。然而，该方法必需去除⑶3阳性细胞作为含有NK细胞的细胞群的步骤，并且还必需从供体制备大量的PBMC。在开始培养22天后，该方法的细胞扩增率最大是约140倍。生物应答修饰剂是调节活体的免疫机制的物质，预期对多种疾病具有治疗效果，且用于癌症的免疫疗法中。然而，已知所述试剂不活化淋巴细胞功能至预期的这种程度。出于该原因，在目前情况下，向需要活化淋巴细胞功能的患者直接施用所述试剂以活化该功能的这种治疗一般不进行，并且仅用于有限的情况。生物应答修饰剂的作用机制不包括对肿瘤细胞的直接作用，并且认为生物应答修饰剂活化施用该试剂的活体固有的免疫细胞，并通过免疫细胞的作用施加抗肿瘤效果。因此，施用生物应答修饰剂的效果受接受生物应答修饰剂施用的活体的天然免疫学状态的极大影响，并受活体的背景因子的影响。因而，认为通常存在个体之间的抗肿瘤效果差异以及取决于患者的临床状态的作用强度差异。引用列表专利文献专利文献 1 :W02007/103901非专利文献非专利文献 1 :Cho D 和 Campana D, Korean J Lab ]^(1，2009，第四卷，第 89-96 页。
发明要解决的问题对于预期具有高治疗效果的NK细胞，在目前的情况下尚未建立有效获得高纯度NK细胞的方法。因此，需要开发其他的细胞增殖方法用于制备NK细胞。解决问题的手段本发明人持续地深入研究各种培养条件，特别是淋巴细胞的扩增培养(expansionculture)，结果发现了有效扩增培养NK细胞的方法。因而完成了本发明。换言之，本发明涉及用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的细胞群的步骤，根据[1]的方法，其中生物应答修饰剂是细菌来源的制剂，根据[2]的方法，其中生物应答修饰剂是选自0K-432、BCG、化脓性链球菌(Streptcoccus pyogenes)、短棒杆菌(Corynebacterium parvum)及其细胞壁骨架白勺细菌来源的制剂，根据[1]_[3]的任一项的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是选自已经受消除增殖能力处理的外周血单核细胞、T细胞、T细胞子集和B细胞的细胞，根据W]的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是已经受消除增殖能力处理的人工扩增培养的T细胞，根据[1]_[5]的任一项的方法，其中已经受消除增殖能力处理的细胞是源自与天然杀伤细胞或者能够分化成天然杀伤细胞的细胞相同的个体的细胞，根据[1]_[6]的任一项的方法，其中在存在已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下扩增培养的步骤包括实施多次的细胞添加，根据[1]_[6]的任一项的方法，其中外周血单核细胞用作天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞，通过根据[1]_[8]的任一项的方法获得的细胞群，含有从根据[9]的细胞群分离的NK细胞的细胞亚群，含有根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群的药物，根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群在生产药物中的用途，治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用有效量的根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群的步骤，用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群和/或细胞亚群的方法，包括冷冻根据[9]的细胞群和/或根据[10]的细胞亚群、解冻冷冻的细胞群和/或细胞亚群、然后在存在细胞因子的情况下培养细胞群和/或细胞亚群的步骤，和用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在生物应答修饰剂的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的分离的和/或纯化的细胞群的步骤。发明的效果根据本发明，提供了用于制备NK细胞的新方法。由于本发明的方法可以提供具有高的细胞增殖率和强的细胞毒性活性的细胞，本发明获得的NK细胞可以优选用于例如过继性免疫疗法。因此，预期本发明的方法大大有助于医学领域。

如本文中使用的，“NK细胞”意指含有大颗粒淋巴细胞的细胞群，所述大颗粒淋巴细胞在没有抗原敏化的情况下非MHC限制性地损伤肿瘤细胞和感染病毒的细胞，并用于维持活体的稳态。NK细胞的代表性表面标志物已知⑶56、⑶94和⑶16。此外，NK细胞是⑶3阴性的。如本文中使用的，“外周血单核细胞(PBMC)”意指包含源自外周血的淋巴细胞和单核细胞的细胞群，并包括T细胞、B细胞和NK细胞。如本文中使用的，“具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽”意指在分子中含有源自纤连蛋白的氨基酸序列或其一部分的多肽，并且其实例包括纤连蛋白或纤连蛋白的片段。纤连蛋白或纤连蛋白的片段可以是天然来源的分离多肽、人工合成多肽或通过遗传工程制备的重组多肽中的任一种。纤连蛋白可以从天然存在的物质中以基本纯的形式制备，例如基于Ruoslahti E.等人，J. Biol. Chem. , vol. 256,No. 14，第7277_7沘1 页(1981)的公开内容。在本文中，用于本发明中的纤连蛋白或具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽基本不含自然界中与纤连蛋白共存的其他蛋白质。上述多肽在本发明中可以单独使用或作为多种的混合物使用。此外，有许多纤连蛋白的已知剪切变体。本发明中使用的多肽可以是具有源自任何变体的氨基酸序列的多肽，只要它产生本发明所需的效果。例如，在源于血浆的纤连蛋白的情况下，已知缺失了在细胞结合结构域上游存在的被称为ED-B的区域，和在细胞结合结构域与肝素结合结构域之间存在的被称为ED-A的区域。具有此类血浆来源的纤连蛋白的氨基酸序列的多肽也可用于本发明中。关于可用于本发明中的纤连蛋白片段和片段制备的有用信息可自J. Biochem.，vol. 110, p. 284-291 (1991)、EMBO J. , vol. 4, No. 7, p. 1755-1759 (1985)、Biochemistry, vol. 25, No. 17, p. 4936-4941 (1986)、W02007/142300 等获得。此外，编码纤连蛋白的核酸序列和纤连蛋白的氨基酸序列公开在Genbank登录号NM002(^6和NP002017 中。纤连蛋白的结构域结构分为7个结构域。纤连蛋白的氨基酸序列含有三种相似的序列，且其整体由每种这些序列的重复构成。三种相似序列分别被称为I型、II型和III型。其中，III型由71至96个氨基酸残基构成，且这些氨基酸残基的匹配率是17%至40%。纤连蛋白中有14个III型序列，其中，第8、第9和第10个序列(在后文中，分别被称为111-8、111-9和III-10)包含在细胞结合结构域中，且第12、第13和第14个序列(在后文中，分别被称为111-12、111-13和111-14)包含在肝素结合结构域中。此外，被称为IIICS的区域存在于肝素结合结构域的C端侧。在IIICS中，存在被称为CS-I的区域，该区域由25个氨基酸残基组成，且具有结合VLA-4的活性。可用于本发明中的纤连蛋白片段可以是包括III-7、8、9、11、12、13或CS-I的任何结构域的片段，或进一步地，可以是其中重复连接了复
5数个结构域的片段。可用于本发明中的纤连蛋白片段的实例包括含有细胞粘附结构域、肝素结构域或作为VLA-4的配体的CS-I结构域的片段，所述细胞粘附结构域包括VLA-5的配体。片段的实例包括在J. Biochem.，第110卷，第观4-291页(1991)中描述的CH-271、CH-296.H-271和H496，及其衍生物或修饰物。CH-296是以名称RetroNectin (注册商标)可商购的。在本文中，“生物应答修饰剂”也被称为生物学应答修饰剂(BRM)，意指一类改善活体内的非特异性免疫学应答能力的物质。作为生物应答修饰剂，已知细菌来源的制剂(0K-432、BCG (卡介苗)、化脓链球菌、短棒杆菌及其细胞壁骨架)、担子菌来源的多糖(香菇多糖、裂裥菌素、PSK等)、合成物质(吡喃共聚物、左旋咪唑)和细胞因子。“0K-432”意指通过用青霉素处理A类3型溶血性化脓链球菌的减毒天然突变菌株(Su菌株)而获得的细菌来源的制剂的一般名称。该制剂以Picibanil (注册商标)作为商标名销售。本发明具体说明如下。如本文中使用的，“消除增殖能力的处理”没有特别的限制，只要所述处理使细胞丧失或降低其增殖能力。处理的实例包括化学处理和/或物理处理。化学处理的实例包括用化学药物(福尔马林等)处理和用抗癌剂(有丝分裂抑制剂，例如丝裂霉素C等)处理。物理处理的实例包括放射处理、温和加热(加热/加温)处理、冷冻/解冻处理或超声处理。例如，当通过放射实施处理时，可以使用例如Y射线和X射线。由于已经受消除增殖能力的处理的细胞丧失或降低了涉及增殖的能力，例如细胞分裂和DNA合成，因而相比未处理过细胞，细胞的增殖能力是降低的。例如，虽然已经受放射处理的细胞降低了增殖能力，但细胞表现出与刚处理过的活细胞相同的形式和特征，并维持分泌例如细胞因子等蛋白质的代谢能力。1、制备NK细胞的方法
技术领域：
本发明的制备NK细胞的方法包括在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的步骤。根据本发明的制备NK细胞的方法，相比常规的方法，可以稳定地制备具有极高扩增培养率、极高NK细胞含有率和极高的NK细胞细胞毒性活性的细胞群。在本文中，扩增培养率意指相对于培养开始的时间的增殖率，并且该倍率是通过用培养结束时的细胞数除以培养开始时的细胞数、然后用所获得的值除以传代培养时使用的细胞数的比率来计算的。本发明方法的一个特征是使用已经受消除增殖能力处理的细胞。已经受消除增殖能力处理的细胞没有特殊的限制。在本发明的优选的方面，使用PBMC、T细胞、T细胞子集(例如，⑶4阴性T细胞、⑶8阳性T细胞等)、B细胞或通过培养这些细胞制备的细胞群。制备PBMC的方法没有特殊的限制。可以从血液或血细胞组分制备PBMC，所述血细胞组分是通过分离来自血液的血浆获得的，其通过已知的方法例如密度梯度离心法进行。可以通过已知的方法，从PBMC或另一种生物学样品(外周血、骨髓液、脐带血等)中分离B细胞、T细胞或T细胞子集。此外，通过培养上述细胞而增加细胞数所获得的细胞群也可用于本发明中。例如，还使用通过扩增培养含有T细胞或T细胞前体细胞的细胞群获得的T细胞群。在T细胞群配制中，通过共存具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽，改善了 T细胞的增殖效率。换言之，可以从少量的材料(血液或PBMC)中获得大量的T细胞。如下实施在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下T细胞的扩增培养。在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下培养的细胞群可以是含有T细胞或T细胞的前体细胞的细胞群，并可以使用体液，例如外周血、骨髓液、脐带血和淋巴液。可选地，可以使用从这些体液或各种身体部分或器官分离的细胞群，例如PBMC、T细胞、T细胞子集或其混合物。在制备用于治疗目的移植到活体中的NK细胞中，这些细胞或细胞群可以源自相同的个体，即，与后文所述的“NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞”相同的供体。特别优选地，期望“NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞”和“已经受消除增殖能力处理的细胞”都源自患者本身。在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下细胞群的培养可以参考WO 03/080817的详细描述来实施。当在存在具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的情况下培养细胞群时，扩增培养率变得极高，且可以容易地制备大量的细胞。用于T细胞扩增培养的培养开始时的细胞浓度是例如1-1 X IO8细胞/mL，优选10-5 X IO7细胞/mL，更优选1 X 102_2 X IO7细胞/mL，但并非特别限制于此。用于T细胞扩增培养的培养基可以是用于细胞培养的已知培养基，且培养基可进一步含有各种细胞因子、合适的蛋白质或其他组分。细胞因子的实例包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-Y等。优选地，使用含有IL-2的培养基。培养基中的IL-2的浓度没有特殊的限制，且培养基可优选含有0. 01-1 X IO5 U/mL,更优选1_1 X IO4 U/mL的IL-2。合适的蛋白质的实例包括抗CD3抗体和抗IL-4抗体。用于本发明的抗CD3抗体的实例包括但不限于优选地抗人CD3单克隆抗体，更优选0KT3(Science, 1979，第206卷，第347-349页)。还可以向培养基中添加淋巴细胞刺激因子，例如凝集素等。此外，可以使用包括下列的培养基基于双聚羧酸乙基次膦酸(bisphosphinic acid)的化合物例如帕米膦酸(pamidronate)或唑来膦酸(zoledronate)、基于焦磷酸单酯的化合物例如异戊烯焦磷酸或2_甲基_3_ 丁烯基-1-焦磷酸、磷酸卤代醇、磷酸环氧化物等。培养基中的组分浓度没有特别的限制，只要获得所需的效果。此外，还可以向培养基中添加血清或血浆。添加到培养基中的血清或血浆的量没有特殊的限制，为按体积计大于O至20%，优选大于按体积计0至10%。例如，可以使用自体来源的血清或血浆。用于培养的细胞培养仪器没有特殊的限制，可以使用例如培养皿、摇瓶、袋子、生物反应器等。袋子可以使用例如可渗透CO2气体的袋子用于细胞培养。当工业制备大量的淋巴细胞时，使用生物反应器是有利的。尽管培养可以在开放系统或密闭系统的任一中进行，从得到的淋巴细胞的安全性的观点看来，优选在密闭系统中进行培养。可以在已知的培养条件下实施培养，并且可以应用在正常细胞培养中使用的条件。例如可以在37°C、5% CO2等的条件下实施培养。可以通过在合适的时间间隔下向细胞培养液中添加新鲜的培养基来稀释细胞，培养基可以用新鲜的培养基交换，或者可以更换细胞培养仪器。如下文所述，根据制备的淋巴细胞的种类，可以恰当地选择所使用的培养基、同时使用的其他组分等。培养期是例如1至40天，优选2至35天，更优选3至30天，从实现更高的扩增培养率的观点出发，3至25天的培养期是优选的。用于培养中的包括具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的组分可以溶解并存在于培养基中，或者可以固定在合适的固相上，例如用于细胞培养的载体，如细胞培养仪器、珠子、膜或载玻片。例如，可以根据WO 97/18318描述的方法实施抗CD3抗体的固定，并且可以根据WO 00/09168描述的方法实施具有源自纤连蛋白的氨基酸序列的多肽的固定。对于消除增殖能力的处理，可以使用抗癌剂，例如丝裂霉素C。用于抗癌剂处理的条件没有特殊的限制，只要受处理细胞的增殖能力丧失或降低。丝裂霉素C的浓度是例如1至100 μ g/mL,优选2至50 μ g/mL,合适的是5至30 μ g/mL。处理温度是例如30至40°C，优选35°C至38°C。处理温度是例如0. 1至2小时，优选0. 5至1小时。当通过放射线(例如Y-射线或X-射线)照射实施消除增殖能力的处理时，放射线的照射量没有特殊的限制，只要受照射的细胞的增殖能力丧失，例如，所述量是100至20000R (0. 88 至 176 Gy)，优选 1000 至 8000 R (8. 8 至 70 Gy)。当消除增殖能力的处理是通过温热处理实施时，处理温度和处理时间没有特殊的限制，只要细胞的增殖能力丧失。处理温度是例如40至55°C，优选42至50°C，处理时间是例如0. 1至8小时，优选0. 2至4小时。在培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群中，已经受消除增殖能力处理的细胞的细胞浓度没有特殊的限制，是例如1至1 X IO8细胞/mL，优选1 X IO1至5 X IO7细胞/mL，更优选1 X IO2至2 X IO7细胞/mL。本发明的方法的特征是，在存在生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下，扩增培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群。在本发明中，使用含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群。在本文中，能够分化成NK细胞的细胞没有特殊的限制，只要细胞具有分化成NK细胞的能力。作为细胞群，本发明中可以使用体液，例如外周血、骨髓液、脐带血或淋巴液，或者从体液、或各个机体部分或器官分离的细胞群(例如，PBMC、脐带血单核细胞、骨髓细胞、造血干细胞等)。作为细胞或细胞群，可以直接使用或在冷冻保藏后使用从活体收集的细胞或细胞群。此外，本发明中还可以使用通过各种衍生操作或分离操作从该细胞群中获得的细胞群，例如基于特定的细胞表面标志物从细胞例如PBMC中分离的细胞子集，例如分离的NK细胞群或去除了 CD3阳性细胞的细胞群。此外，本发明中可使用纯化的NK细胞群或NK细胞株。本发明方法的特征是，例如，即使当从具有低含量NK细胞的PBMC直接开始培养时，也可以有效获得具有高的NK细胞含量和具有强的细胞毒性活性的细胞群。在本发明的方法中，含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的培养期是例如3至40天，优选5至35天，更优选10至30天，从实现更高的扩增培养率的观点出发，14至25天的培养期是优选的。在含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的培养中，NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的浓度没有特殊的限制，是例如1至1 X IO8细胞/mL，优选1 X IO1至5X IO7细胞/mL，更优选1 X IO2至2X IO7细胞/mL。含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群的细胞数与已经受消除增殖能力处理的细胞群的细胞数的比例没有特殊的限制，是例如1:0. 1至20，优选1:1至10。在开始培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群时，向培养基中添加已经受消除增殖能力处理的细胞群。此外，除开始培养时以外，通过一次或多次(例如在培养过程中1次、2次或3次)添加已经受消除增殖能力处理的细胞群，刺激含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群，从而可进一步改善扩增培养率。在没有特殊
8限制的情况下，例如，在开始培养含有NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞的细胞群后第5至第9天之间的优选时间和/或在第11至第15天之间的优选时间，可以再次添加已经受消除增殖能力处理的细胞。可以通过合适的方法冷冻保存已经受消除增殖能力处理的细胞群，直到使用为止。作为本发明方法的另一个特征的生物应答修饰剂没有特殊的限制，只要其具有所需的NK细胞增殖诱导活性。在优选的方面，用于本发明中的生物应答修饰剂可以是微生物来源的制剂，特别优选地，使用0K-432、BCG、化脓性链球菌(Sti^ptcoccus pyogenes)、短棒杆菌(Corynebacterium parvum)或其细胞壁骨架。添加到培养基中的生物应答修饰剂的量没有特殊的限制，其可以根据进行扩增培养的细胞的使用量和共同应用的已经受消除增殖能力处理的细胞群的量来恰当选择。当使用0K-432时，以终浓度0. 001至1 KE/mL、优选0. 005至0. 5 KE/mL、更优选0. 01至0. 2KE/mL将0K-432添加到培养基中，本发明中没有特殊的限制。一般地，生物应答修饰剂可以在培养开始时添加到培养基中。除了使用生物应答修饰剂和已经受消除增殖能力处理的细胞外，用于本发明方法中的培养基没有特殊的限制。可以使用已知适合培养淋巴细胞的培养基。例如，可以使用用于 NK 细胞的可商购的培养基(CellGenix 的 CellGro SCGM, TAKARA BIO INC.的 GT-T50等)。除本发明的活性组分外，培养基可含有合适的蛋白质、细胞因子或其他组分。优选地，含有IL-2的培养基用于本发明中。培养基中的IL-2的浓度没有特殊的限制，是例如0. 01至 1 X IO5 U/mL,优选 0. 1 至 1 X IO4 U/mL。培养基中可以添加血清或血浆。他们向培养基中添加的量没有特殊的限制，其按体积计大于0至20%，优选按体积计大于0至5%。当含有NK细胞的制备细胞群或从该细胞群分离的细胞亚群转移到活体中时，优选使用与NK细胞和/或能够分化成NK细胞的细胞具有相同来源(换言之，来自相同的个体)的血清或血浆。此外，可以向培养基中添加血液来源的蛋白质，例如血清白蛋白。在此情况下，优选使用分离的血液来源的蛋白质，即，基本不含其它源自血液的组分的血液来源的蛋白质。还可以使用可获得的重组的血液来源的蛋白质。在本发明方法的培养过程中，可以按合适的时间间隔或根据细胞数的增加实施细胞培养液的稀释、培养基的交换或细胞培养仪器的更换。此外，还可以根据培养NK细胞或LAK细胞的一般条件，实施本发明的方法。例如，该方法可以根据 Klin Padiatr，2005，第 217 卷，第 345-350 页 Journal of ExperimentalMedicine, 1982, 第 155 卷’ 第 1823-1841 页；Current Protocols in Immunology,Supplement 17，UNIT 7.7。本发明进一步提供了用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，特征是包括在存在生物应答修饰剂的情况下，扩增培养含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的分离的和/或纯化的细胞群的步骤。例如，提供了用于制备含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，包括在存在0K-432的情况下培养纯化的CD3阴性CD56阳性细胞。在该方法中，通过在存在已经受消除增殖能力处理的细胞的情况下培养细胞群，改善含有天然杀伤细胞的细胞群的扩增培养率。2、通过本发明的方法获得的含有NK细胞的细胞群、含有细胞群的药物、细胞群的用途、和使用细胞群的治疗方法或预防方法
此外，本发明提供了通过用于制备本发明的NK细胞的方法获得的含有NK细胞的细胞群，和从该细胞群分离的细胞亚群。此外，本发明提供了含有细胞群和/或细胞亚群作为活性成分的药物(治疗剂);细胞群和/或细胞亚群用于生产药物的用途；以及治疗或预防疾病的方法，包括向受试者施用有效量的细胞群和/或细胞亚群的步骤。相比通过常规方法获得的细胞群，通过本发明的方法获得的含有NK细胞的细胞群和/或细胞亚群(在下文中，简单称为本发明的细胞群)具有极高的NK细胞含量，极高的细胞毒性活性，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，和极高的多功能能力。特别是在本发明的细胞群中，CD3阴性(NK细胞表面标志物)CD56阳性(NK细胞表面标志物)细胞占至少50%或更多。本发明的细胞群含有高比例的具有高细胞毒性活性的CD16阳性CD56 阳性细胞。⑶16阳性⑶56阳性细胞占细胞群的至少50%，优选60%或更多，更优选70%或更多。此外，本发明的细胞群含有高比例的CD94和CD56阳性的细胞，所述细胞是成熟的NK 细胞。⑶94阳性⑶56阳性细胞占细胞群的至少50%，优选60%或更多，更优选70%或更多。 本发明的细胞群是高度功能化的NK细胞群，含有高比例的表达下列的细胞被认为涉及NK 细胞的细胞毒性活性的NKp44和NKG2D，NK细胞常见的表面抗原标志物NKp46，在活化的NK 细胞中表达的⑶25，涉及淋巴细胞归巢的⑶62L，也已知作为活化诱导分子(AIM)、在白细胞活化初期阶段表达并涉及NK细胞中的靶向细胞溶解作用的CD69，或者是趋化因子CXCL9 和CXCLlO的配体并被认为表现出向表达这些趋化因子的癌细胞迁移或在癌细胞中积累的高能力的CXCR3。NK细胞的多功能能力一般允许生产细胞因子例如干扰素(IFN) - γ或肿瘤坏死因子(TNF) - α，或通过细胞表面抗原例如CD107a评估细胞群的免疫应答。含有通过本发明制备的NK细胞的细胞群含有高比例的生产多数细胞因子或者表现出多种细胞表面抗原的细胞，并且在细胞免疫疗法中作为具有多功能能力的多功能细胞群非常有效。可以通过本发明的细胞群与合适的细胞因子例如干扰素α (IFN-α)的共存来增强本发明的细胞群的细胞毒性。此类处理的细胞群可以对多种癌细胞施加细胞毒性。可以将基因转移到本发明的细胞群中。例如，可以导入编码对靶物质具有亲和力的蛋白质(例如，T细胞受体(TCR)、抗体、受体等)、细胞表面抗原、酶、信号转导分子(例如， 细胞因子)、其功能结构域(例如，抗体或TCR的可变区、单链抗体、受体的信号结构域)、或具有功能结构域的嵌合蛋白的基因。转移基因的方法没有特殊的限制，合适的方法可选自并可使用已知的基因转移方法。作为基因转移方法，本发明中可使用使用病毒载体的方法或不使用载体的方法。关于此类方法的细节，许多文献都已公开。本发明的细胞群可以冷冻保存。当本发明的细胞群冷冻/解冻时，通过在解冻后再培养细胞群，细胞可以恢复为保留冷冻前的细胞毒性活性的细胞。细胞群的培养可以实施例如一天(过夜)。通过在再培养中共存细胞与合适的细胞因子、例如IL-2，可以进一步增强细胞毒性能力。从本发明的含有NK细胞的细胞群分离的细胞亚群的实例包括使用NK细胞的至少一种表面标志物作为指标从NK细胞分离的细胞亚群，所述表面标志物选自CD16、CD56、 NKp44、NKG2D、NKp46、CD25、CD62L、CD69、CXCR3 和 CD94。含有本发明的细胞群的药物(治疗剂)适合用于过继性免疫疗法。在过继性免疫疗法中，适合患者治疗的本发明的细胞群例如向患者静脉内施用。该药物非常有效地用于后文所述的疾病和供体淋巴细胞输注。可以根据制药领域已知的方法制备药物，例如通过混合作为活性成分的本发明的细胞群与已知的适合胃肠外施用的有机或无机载体、赋形剂、 稳定剂等。可以根据已知的过继性免疫疗法，恰当确定本发明的细胞群在药物中的含量、药物的剂量和关于药物的各种条件，并且没有特殊的限制。例如，药物剂量优选是本发明的细胞群每个成人1 X IO5至1 X IO12细胞/天，更优选5 X IO5至5 X IO11细胞/天，更优选1 X IO6 至1 X IO11细胞/天。一般地，含有NK细胞的细胞群可以通过注射、输注等施用到静脉、动脉、皮下、腹腔、肿瘤等中。本发明的药物还可以与例如可作为针对待治疗疾病的疫苗发挥作用的成分一起施用，没有特殊的限制。例如，对于治疗癌症，还可以施用肿瘤抗原、能够呈递抗原的细胞、 抗原呈递细胞、源自肿瘤组织的通过人工操作而丢失了增殖能力的细胞、来自肿瘤组织的提取物等。与药物施用组合，还可以恰当地施用淋巴细胞刺激因子，例如抗CD3抗体、抗 ⑶沘抗体、细胞因子(IL-2、IL-15、IL-7、IL-12、IFN- y、IFN- α、IFN-β 等)、趋化因子等。 本发明的药物可含有用这些淋巴细胞刺激因子处理的本发明的细胞群作为活性成分。如本文中使用的，淋巴细胞刺激因子包括淋巴细胞生长因子。对其施用本发明的细胞群的疾病的实例包括但不特别限于恶性肿瘤病例如癌症和白血病、肝炎、流感，和由病毒例如HIV、细菌或真菌(例如，结核、MRSA、VRE或深部真菌病) 引起的感染性疾病。含有通过本发明方法制备的NK细胞的细胞群可以与常规治疗方法组合利用，例如在骨髓移植或放射线照射后的感染性疾病预防、出于缓解复发性白血病目的的供体淋巴细胞输注、抗癌剂治疗、放射治疗、抗体治疗、温热治疗、其他免疫疗法等。本发明的细胞群用于生产药物的用途，例如生产用于治疗癌性疾病或感染性疾病的药物的用途，也包括在本发明中。用于治疗疾病的本发明的细胞群也包括在本发明中。本发明的另一个方面提供了使用药物治疗疾病的方法。治疗疾病的方法的特征是使用本发明的细胞群，并且根据已知的过继性免疫疗法或本文的施用药物的公开内容，可以确定施用药物的各种条件。下面通过实施例将进一步具体、详细地解释本发明，但本发明并不限于此。 实施例实施例1 使用0K-432和自体照射细胞(AIC)培养NK细胞 (I)PBMC的分离和保存
在已获得知情同意书的健康人供体中，实施组分血液收集(在本文中，组分血液收集是出于收集单核细胞的目的的血液收集)。在用Dulbecco PBS (由hvitrogen公司生产或由 NISSUI PHARMACEUTICAL CO. , LTD.生产；在后文中称为DPBS)或含1%人血清白蛋白(产品名Buminate，由Baxter生产；在后文中称为HSA)的生理盐水(在后文中称为1% HSA/生理盐水)稀释组分收集的血液后，每30 mL稀释的组分收集的血液在15 mL的Ficoll-Paque PREMIUM或Ficoll-Paque PLUS(都由GE Healthcare Bioscience生产)上分层，再在700Xg 和室温下离心20分钟。在离心后，用移液器回收分离的层中的PBMC层，并用RPMI1640培养基或1% HSA/生理盐水补充至45 mL。在650 X g和4°C下离心10分钟后，去除上清液。相似地，顺序实施离心操作，同时逐步降低离心G，例如600 X g、然后500 X g，重复洗涤共计 3次，收集PBMC。将收集的PBMC悬浮在由等量的包含8% HSA的CP-1 (由Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co. , Ltd.生产)和 RPMI1640 培养基(由 hvitrogen 公司、Sigma 公司或 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生产)组成的储液(在后文中称为CP1/HSA)中，并保存在液氮中。为了扩增培养NK细胞，在37°C水浴中快速解冻保存的PBMC，并用包含10 μ g/mL DNase (由Calbiochem生产)的RPMI1640培养基或含0. 5%人AB型血清(由Lonza生产)的 GT-T551 (由TAKARA BIO INC.生产，在后文中称为0. 5HGT-T551)洗涤，并通过台盼蓝染色方法计算活细胞数。该细胞用于每个实验中。(2)制备 PBMC AIC
将必需量的实施例I-(I)中制备的PBMC悬浮在含5%人AB型血清、0. 1 mM NEAA混合物、1 mM丙酮酸钠和2 mM L-谷氨酰胺(都由Lonza生产)以及1%青霉素-链霉素(由 Gibco BRL生产)或100 μ g/mL硫酸链霉素(由Meiji Co. , Ltd.生产)的RPMI1640培养基(在后文中称为5HRPMI)中，然后使用X射线照射装置用3400 R (29. 8 Gy)的X射线照射(在后文中，X射线照射后的细胞被称为PBMC AIC)0将制备的PBMC AIC悬浮在5HRPMI 中至2 X IO6细胞/mL。(3)扩增培养NK细胞
在将实施例1- (1)中制备的PBMC (源自与PBMC AIC相同的供体)悬浮在5HRPMI中至 2X IO6细胞/mL后，将其用作响应细胞。将响应细胞和PBMC AIC以各自0. 5 mL/孔的量添加至1J 24 孑L细胞培养板(由 Becton, Dickinson and Company 生产，或由 Corning Incorporated 生产)中，达到共计1 mL/孔(AIC刺激组)。此时，制备不添加PBMC AIC的组(非AIC刺激组)。向每个孔添加 0K-432 (产品名称 Picibanil ；由 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.生产)，终浓度为0.05 KE/mL。向所有孔添加IL-2 (产品名称ftx)leukin ；由Chiron 生产，或由Novartis生产)，终浓度为500 U/mL。在37°C存在5% CO2的情况下开始培养这些平板(培养第O天)。在第二天，向每个孔添加各1 mL的5HRPMI，以500 U/mL终浓度添加 IL-2。在第四天，以500 U/mL终浓度向每个孔添加IL-2。在第七天和第九天，使用 5HRPMI将每个孔的细胞液3倍稀释，以500 U/mL终浓度向每个孔添加IL-2，之后将2 mL 的稀释细胞液转移到新的M孔细胞培养板中。在开始培养后第11天，将细胞液4倍稀释， 将4 mL的稀释细胞液转移到新的12孔细胞培养板(由Becton, Dickinson and Company 生产，或由Corning Incorporated生产)中，之后，以500 U/mL终浓度添加IL-2。继续培养直到开始培养后第14天为止。在开始培养后第14天，通过台盼蓝染色方法测量活细胞数，并将该数目与开始培养时的细胞数比较，以计算扩增培养率。结果显示在表1中。在下表中，“_”意指无添加，“ + ”意指添加。在实施例中，AIC添加与AIC刺激具有相同的含义， 并且AIC无添加与AIC无刺激具有相同的含义。[表1]


生产含有天然杀伤细胞的细胞群的方法，其特征是涉及在存在生物应答修饰剂和已经受处理而丧失增殖能力的细胞的情况下，对含有天然杀伤细胞和/或能够分化成天然杀伤细胞的细胞的细胞群进行扩增培养的步骤等。