一种用生物技术生产中药材原料丹参酮的方法【技术领域】:[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体说，是涉及一种利用基因工程技术，用双关键酶基因共转化提高丹参毛状根丹参酮含量的方法。[0002]心脑血管疾病与糖尿病、癌症等是目前对人类威胁最大的三大类疾病，其中心脑血管疾病位于这三大疾病之首。据统计，全世界每年大约有1700万人死于心脑血管疾病，约占全球总死亡人数的1/3 ;我国每年大约有260万人死于心脑血管疾病，心脑血管疾病已成为威胁人们健康的“头号杀手”。因此研究开发高效、低毒和廉价的治疗心脑血管疾病药物具有十分重要的意义。[0003]中药丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，因其色红且形状似参而得名“丹参”，是一种主治心血管系统疾病的常用中药。丹参作为一种传统中药材在我国沿用已久，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦、养血安神的作用，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、痛经等病症。研究表明丹参活性成分主要分为两大类:即月旨溶性二萜类化合物(丹参酮1、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮等)和水溶性酚酸类化合物(丹酚酸A、丹酚酸B、紫草酸、丹参素等)，还含黄酮类，三萜类留醇等其他成分 。[0004]现代研究表明丹参对心血管系统疾病疗效比较显著，以丹参为主的多种复方制剂如复方丹参注射液、复方丹参片、复方丹参胶囊等，被广泛用于治疗心血管疾病、肾病、肝病及抗感染等。最新科学研究还表明丹参所含的丹参酮类物质具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗动脉粥样硬化等多种药理活性，在临床上用途广泛。[0005]但是由于丹参为多年生草本植物，生长周期较长，药用活性成分含量较低，品质退化，而且选育成本很高，野生资源日益减少。丹参酮的结构复杂，化学合成过程十分繁琐，成本较高且易造成环境污染；在离体条件下的细胞培养获得的细胞活性成分积累量低而且稳定性较差。以上种种原因，造成丹参丹参酮药源紧缺，而基因工程的快速发展与毛状根培养技术的日益成熟，为提高丹参毛状根中丹参酮成分的含量和产量，提供了一条崭新的途径。[0006]丹参酮类化合物(如丹参酮1、丹参酮IIA、二氢丹参酮及隐丹参酮等)属于二萜类化合物，最新研究表明不论是甲羟戊酸(MVA)途径还是1-去氧木糖-5-磷酸(DXP)途径都可以为萜类物质(包括丹参酮)的生物合成提供前体物质。3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶基因(SmHMGR)和1_脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(SmDXR)是丹参酮生物合成途径中的两个关键限速酶基因，它们分别位于细胞质的MVA途径以及细胞质体内的DXP途径中，是丹参酮代谢工程的重要靶点。本发明采用基因工程手段，将上述的两个关键酶基因SmHMGR和SmDXR插入植物表达载体，通过发根农杆菌转化丹参毛状根。通过上述工艺优化丹参酮生物合成途径，获得高产丹参酮的毛状根，并进行大规模培养，大大提高了丹参酮产量。

[0008](I)将丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR和1_脱氧_D_木酮糖-5-磷酸还原酶基因SmDXR插人植物表达载体，构建重组载体；
[0009](2)将含有丹参3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR和1_脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因SmDXR基因的重组载体转入发根农杆菌，构建含有重组载体的发根农杆菌；
[0010](3)用所得含有重组载体的发根农杆菌介导丹参3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因SmHMGR和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因SmDXR转化丹参。将含有重组载体的发根农杆菌与丹参外植体幼嫩叶片共培养，长出毛状根后除菌；
[0011](4)收获的转基因丹参毛状根经烘干研磨，萃取，超声，离心，真空干燥，过滤等步骤处理后，取样加入高效液相色谱仪。通过高效色谱法测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量，筛选获得含量高的株系。

[0012]下面结合具体实施例详细阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆建议的条件。
[0013]实施例1
[0014]SmHMGR和SmDXR双基因片段的构建
[0015]1.1丹参总RNA的提取及cDNA第一链的合成
[0016]将鲜重量0.1g丹参转基因毛状根用RNA试剂盒提取总RNA并在分光光度计上测定相关的吸光值，计算所提取RNA的纯度及浓度。以0.5ug RNA为起始量，用反转录酶进行第一链cDNA的合成。
[0017]1.2SmHMGR和SmDXR双基因片段的获得
[0018]根据SmHMGR基因的编码序列和SmDXR基因的编码序列，分别设计扩增出完整编码框的上下游特异引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，构建表达载体。以第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。
[0019]实施例2
[0020]含丹参SmHMGR及SmDXR双基因的表达载体的构建
[0021]2.1表达载体pCAMBIA1304的构建
[0022]以pBI121质粒和pCAMBTA1304质粒为材料，构建表达载体pCAMBTA1304，载体包含CaMV35S启动子和终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点；
[0023]2.2 表达载体 pCAMBIA1304-SmHMGR 的构建
[0024]用从丹参中克隆到的SmHMGR基因替换掉⑶S基因，构建表达载体pCAMBIA1304-SmHMGRo
[0025]2.3 表达载体 pCAMBTA1304-SmHMGR-SmDXR 的构建
[0026]以上述的pCAMBIA1304-SmHMGR为基础，用从丹参中克隆的SmDXR基因替换pCAMBIA1304-SmHMGR 的 hygromycin 基因，构建表达载体 pCAMBTA1304-SmHMGR-SmDXR。具体地，两个XhoI同时双酶切pMD18T-SmDXR和pCAMBIA1304_SmHMGR ;连接转化，挑取单克隆菌落筛选阳性克隆；提取质粒进一步酶切验证。结果表明，SmDXR基因被成功构建到表达载体pCAMBTA1304-SmHMGR中，从而获得含SmHMGR和SmDXR双基因的表达载体pCAMBTA1304-SmHMGR-SmDXR。
[0027]实施例3
[0028]发根农杆菌介导SmHMGR和SmDXR双基因转化丹参获得转基因毛状根
[0029]3.1发根农杆菌工程菌的获得
[0030]将表达载体pCAMBTA1304-SmHMGR-SmDXR转入发根农杆菌pBiA4中，构建含有重组载体的发根农杆菌，进行培养。
[0031]3.2外植体的培养
[0032]剪取丹参健壮无菌苗叶片，与农杆菌接种到预培养培养基上，25°C暗培养2d。再将丹参叶片外植体放入含活化好的发根农杆菌工程菌悬液中充分浸泡15min后，取出叶片用无菌吸水纸吸干表面菌液，转到共培养培养基中，暗培养3d。
[0033]3.3毛状根的诱导和继代培养
[0034]共培养的丹参外植体接到除菌固体培养基培养可从外植体伤口处长出毛状根。将已发根的丹参外植体转接到除菌固体培养基上，25°C暗培养2周。待毛状根长至3cm以上时，剪取单一毛状根作为一个无性系，继续接种于除菌培养基暗培养两周，之后再转至除菌培养基暗培养两周左右。
[0035]实施例4`
[0036]利用高效液相HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量
[0037]4.1HPLC色谱条件及标准品曲线制作
[0038]色谱柱为C-18反相硅胶柱，流动相为乙腈:水(65: 35)，检测波长270nm，柱温30°C,流速 lml/min。
[0039]精密称取二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮I，丹参酮IIA标准品分别配置成浓度为300ug/ml标准品，分别取5ul, IOul, 20ul, 30ul, 40ul进样,记录图谱及色谱参数,分别以峰面积对标准品浓度进行回归分析。
[0040]4.2转基因毛状根丹参酮含量的提取及测定
[0041]将收获的转基因丹参毛状根烘干，放入研钵中充分研磨，取300mg加入甲醇:二氯甲烷(3: I，v/v) 25ml，超声破碎60min，室温放置过夜，次日离心，吸取上清液真空干燥，残余物重新用2ml甲醇溶解，用0.22um的滤膜过滤后取20ul，加入高效液相色谱仪，记录各组分峰面积，代入线性回归方程，计算得样品丹参酮含量。
[0042]本发明利用现代基因工程技术将丹参酮合成途径中的关键酶基因导入表达载体，介导到丹参中，获得转基因的毛发根，再筛选高表达株系，进行大规模的培养。这就大大提高了丹参中丹参酮的含量和产量，为解决丹参酮药源紧缺性问题提供了一条较佳途径。对于解决心血管疾病等病人痛苦，提高人们的生活水平，必将产生深远的影响。