一种治疗脑胶质瘤的药物组合物的制作方法[0002]脑胶质瘤约占颅内肿瘤的46%。恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35~54岁患者死亡的第3位原因。胶质瘤偏良性者生长缓慢，病程较长，自出现症状至就诊时间平均两年；恶性者瘤体生长快，病程短，自出现症状到就诊大多数在3个月内，70%~80%在半年以内。常规治疗癌症的化疗药物毒性大，复发率高，且大部分不能透过血脑屏障。寻找低毒、高效、廉价且能穿透血脑屏障并可用于治疗脑胶质瘤的药物具有重要价值。[0003]蒿甲醚(Artemether，ART)为青蒿素的脂溶性衍生物，临床上已用于治疗疟疾，更为重要的是利用该药具有透过血脑屏障的特性，用于治疗脑型疟疾并具有显著疗效。近年的研究发现，青蒿素及其衍生物如蒿甲醚在体内外有明显的抗肿瘤和抑制肿瘤细胞生长的作用，且不产生赖药性及不良反应。其主要的作用机制如下所述:[0004]1、细胞周期阻滞:青蒿素及其衍生物青蒿琥酯可诱导Kaposi’ s肉瘤细胞周期时间明显缩短，青蒿素及其衍生物二氢青蒿素可使人乳腺癌MCF-7细胞阻滞在GcZG1期；[0005]2、诱导细胞凋亡:青蒿琥酯可诱导Kaposi’ s肉瘤细胞凋亡,且具剂量依赖性,对正常细胞无损伤；[0006]3、抗血管生成作用:青蒿素类药物可以通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达而阻止肿瘤血管的生成；[0007]4、青蒿素类药物可以调节肿瘤相关基因的表达，从而实现抑瘤的作用，如可抑制脑胶质瘤细胞U87增殖及凋亡，并导致细胞内癌症相关基因的表达发生变化。[0008]5、铁离子介导的细胞损伤:恶性肿瘤细胞中的铁离子含量较正常细胞大很多，青蒿素类药物可通过铁离子介导形成内过氧化桥，产生活性氧离子(ROS)和以碳为核心的自由基，进而使细胞发生分子损伤和死亡。[0009]替莫唑胺(Temozolomide)是治疗脑胶质瘤的口服制剂,具有针对性强、特异性高，可透过血脑屏障等特性，临床上用于治疗脑胶质瘤及转移瘤。替莫唑胺是一种新型的口服二代烷化剂一一咪唑四嗪类衍生物，口服后迅速吸收，具有近100%的生物利用度及广谱的抗肿瘤活性。替莫唑胺进入体内不经肝脏代谢广泛分布于全身，并可透过血脑屏障，进入脑脊液，在中枢神经系统达到有效的药物浓度。
[0010]蒿甲醚用于治疗脑胶质瘤的优势在于该药能够透过血脑屏障，诱导脑胶质瘤细胞凋亡、抑制血管内皮生长因子(VEGF)的表达而阻止肿瘤血管的生成。该药具有毒副作用低，价格低廉，不产生赖药性，可长期服用等优点；唯一的不足在于该药单用的疗效较替莫唑胺略差。
[0011]替莫唑胺用于治疗脑胶质瘤的优势在于该药能够透过血脑屏障，疗效显著，但该药单用的最大缺点在于毒副作用大。其毒副作用主要是使中性粒细胞减少、血小板减少，食欲下降、头痛、便秘、脱发、疲乏、腹泻和视力模糊，因而肿瘤患者难于耐受，并且易产生耐药性而不能够长期使用。此外，替莫唑胺价格高，患者经济负担重。


[0012]本发明的目的在于克服现有药物的缺点，提供一种治疗脑胶质瘤的药物组合物，该药物组合物不但能穿透血脑屏障，疗效显著，而且毒副作用低，价格低廉，可长期使用。
[0013]本发明药物组合物是以蒿甲醚和替莫唑胺为活性组分，组合物中所含上述活性组分之间的相对重量份额为蒿甲醚40~70份，替莫唑胺0.5~4.0份。进一步优化的相对重量份额为蒿甲醚65~67份，替莫唑胺0.5~2.0份。 [0014]本发明药物的剂型以胶囊为首选，但也可以是其他剂型，如糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、颗粒剂、冲剂、散剂、混悬剂等。
[0015]本发明药物的临床使用剂量推荐为:按蒿甲醚与替莫唑胺的总量计、每天每千克体重使用40~74mg。
[0016]试验研究结果显示:本发明药物组合物对体外培养的SD大鼠脑胶质瘤C6细胞株抑制作用明显。蒿甲醚和替莫唑胺联用或单用的效应均为时间和浓度的依赖关系，两药合用为协同关系。两药联用时的IC50值低于二者单用时；动物实验充分证实，蒿甲醚与替莫唑胺联用表现出良好的抑瘤效果，效果强于二者单用时；病理切片结果显示，蒿甲醚与替莫唑胺联用时，脑胶质瘤的微血管数量明显减少，抗血管生成作用强于二者单用时。
[0017]本发明组合物的优点:价格低廉，疗效显著，毒副作用低。



[0018]图1为实例3中对照组模型SD大鼠脑胶质瘤H.E染色病理切片(HEX 200)。
[0019]图2为实例3中蒿甲醚组模型SD大鼠脑胶质瘤H.E染色病理切片(HEX 200)。
[0020]图3为实例3中替莫唑胺组模型SD大鼠脑胶质瘤H.E染色病理切片(HEX 200)。
[0021]图4为实例3中本发明两药联用组模型SD大鼠脑胶质瘤H.E染色病理切片(HE X200)。
[0022]图5为实例3中对照组模型SD大鼠脑胶质瘤免疫组化病理切片(X200)。
[0023]图6为实例3中蒿甲醚组模型SD大鼠脑胶质瘤免疫组化病理切片(X200)。
[0024]图7为实例3中替莫唑胺组模型SD大鼠脑胶质瘤免疫组化病理切片(X 200)。
[0025]图8为实例3中本发明两药联用组模型SD大鼠脑胶质瘤免疫组化病理切片(X200)。

[0026]下面结合实例对本发明进一步阐述。
[0027]实例1:测定蒿甲醚与替莫唑胺单用与联用对C6脑胶质瘤细胞的抑制作用。
[0028]实验试剂:RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司，噻唑蓝(MTT)购自美国SIGMA公司，DMSO购自美国SIGMA公司。
[0029]主要仪器:二氧化碳培养箱(美国Forma公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；无菌操作台(美国Forma公司)。[0030]细胞株及细胞培养:SD大鼠脑胶质瘤细胞株C6用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基于37 °C，5%C02恒温培养箱中常规培养。
[0031]药物:蒿甲醚(昆明制药集团股份有限公司，50mg)。
[0032]替莫唑胺(江苏天士力帝益药业有限公司，50mg)o
[0033]试验方法:四甲基偶氮唑盐法(MTT法):
[0034]长期C6细胞，调整细胞悬液为I X IO5个/ml。取三个96孔板，在细胞板的外周各孔均加入200 μ I的生理盐水，其它各孔每孔用移液器加入细胞浓度为IX IO5个/ml的细胞悬液200 μ 1，使每孔细胞数2.0 X IO4个，其中设置空白对照组I个包括6个复孔、实验组9个在此后的实验中依次用于加入不同浓度的药液(200、100、50、25、12.5,6.25,3.125 μ g/ml),每个浓度的药物组均设6个复孔，置37、V 5%C02培养箱中培养24h ;取出96孔板，用移液器小心吸去上清液，实验组每孔分别加入用完全培养液配制的相应浓度的药物溶液200 μ 1，每个浓度6个复孔。空白对照组加200 μ I的完全培养液，置37，°C 5%C02培养箱中分别培养24h、48h、72h ;称取IOmgMTT溶于2ml PBS中，过滤，取滤液1.5ml与13.5ml完全培养基混匀；取出已培养到相应时间的培养板，用25ml注射器吸干孔内的液体，每孔加入200 μ IMTT溶液，放入培养箱内继续孵育4h，去除MTT，每孔加入150 μ I DMSO,暗处振荡15min，450型ELISA-Reader酶标仪(Bio-Rad公司)490nm主波长，630nm副波长检测吸光度。以对照组细胞活力为100%，按公式计算不同浓度蒿甲醚对C6细胞增殖的抑制率:细胞抑制率(％) = (I 一药物组吸光度/对照组吸光度)X 100%。借助SPSS17.0软件求的IC50 值。
[0035]实验结果:两药单用及合用时不同浓度的效应:两药单用及合用时随着药物浓度增加对细胞抑制率也增加，见表1。
[0036] 表1:不同浓度的药物单用及合用对C6细胞的抑制率
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