专利名称：一种能快速分解棉秆的复合菌剂及其制备方法棉花收获后会残留大量副产物ー棉杆。棉杆的主要成分是天然木质纤维素(由纤维素、半纤维素和木质素等组成)，是具有开发潜力的木质纤维素生物质资源，通过生物分解转化，可开发生物燃料(如こ醇、氢气和沼气等)、动物饲料、有机肥和用作食用菌栽培料坐寸ο 在农作物秸杆中，棉杆比水稻秸杆、小麦秸杆和玉米秸杆等质地更加坚硬，更难分解。目前，由于缺乏对棉杆具有高效分解能力的微生物(或酶)，其生物转化(包括能源化、饲料化等)效率很低，棉杆的生物利用多局限于直接还田利用。然而，棉杆直接还田也存在问题，即因棉杆本身极难分解，自然腐熟度低，很难当年成肥，还田后不仅对土壌培肥效果不明显，还因携帯病虫害而影响来年作物种植。大部分未被利用的棉杆，农民只能采用直接露天焚烧的方法处理，其释放的烟尘严重影响环境和公共交通。因此，亟待开发棉杆的转化利用途径。棉杆极难分解是其生物转化高附加值产品的瓶颈，其关键环节就是获得能高效分解棉杆木质纤维素的微生物。现在多利用単一菌种分解，単一菌种分解能力弱，适应性不强，难以培养，发酵周期较长，容易被杂菌污染。
本发明的目的是针对上述技术现状，g在提供一种发酵分解时间短、的能快速分解棉杆的复合菌剂及其制备方法。本发明目的的实现方式为，ー种能快速分解棉杆的复合菌剂，由菌株保藏编号为ATCC 27405的热纤梭菌、菌株保藏编号为ACCC 00424脱硫肠状菌、菌株保藏编号为CCREMSDMCC120012嗜热地衣芽孢杆菌、菌株保藏编号为DSM 3071溶纤维丁酸弧菌、菌株保藏编号为ACCC 01179枯草芽孢杆菌和菌株保藏编号为ACCCl 1073嗜热乳杆菌复合成，热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在复合菌剂中的细胞数含量分别为10-20%、5-15%、5-35%、5-20%,25-35%和I0-20%ο菌株在复合菌剂中的细胞数含量的含义是指复合菌中各菌株细胞数占复合菌总细胞数的百分含量。ー种快速分解棉杆的复合菌剂的制备方法，制备的具体步骤如下I)棉杆堆肥的制备①风干棉杆粉碎成1-1. 5 cm的小段；②将猪粪、牛粪和鸡粪在阴凉通风处晾至含水量为40-60% ；③将畜禽粪便和棉杆混合均勻，混合比例为猪粪牛粪鸡棉杆=1-2:0. 5-1. 5:0. 5-1. 5:4-6 ;堆制，调节堆体起始水分含量在50% 60%，调节起始碳氮比为30 ；④堆制前7-60天，每天翻堆1-3次,31-45天时,每4-10天翻堆I次；⑤堆制过程中每1-3天测定堆体温度、pH值和棉杆分解量指标；2)棉杆快速分解复合菌系的筛选①根据堆体的温度、pH和棉杆分解量的测定结果，取堆肥20-30 g加入到500 mL三角瓶中，加200-400 mL已灭菌的生理盐水或O. 2M PBS缓冲液置摇床中震荡30min ；PBS 缓冲液为用 8g NaCl,O. 2g KCl，1.44g NaH2PO47O. 24g KH2PO4，加蒸馏水水至800 mL,用HCl调节pH值至7. 0，再加蒸馏水至1000 mL所制备出的缓冲液；②将三角瓶从摇床中取出静置20-30 min，取上层液体10_20 mL作为接种菌液接种到500 mL盛有250-350 mL培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱50_60°C黑暗静止培养；所述培养基为改良PCS培养基、Mandels培养基或梭菌增殖培养基；改良PCS 培养基含 NaCl 5 g，CaCO3 2. 5 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 I g，K2HPO4 Ig，MgSO4 ·7Η20 O. 35 g，干棉杆 I. 5-2. 5 g、蒸馏水 I L ；pH 7. 0，经 121°C灭菌 20 min 所得的培养基；Mandels 培养基含蛋白胨 2. 5g，(NH4)2SO4 I. 4g，MgSO4 · 7H20 O. 3g，KH2PO4 2g，FeSO4 ·7Η20 5mg, MnSO4 I. 6mg, ZnCl2 I. 7mg, CoCl2 I. 7mg, CaCO3 2g,干棉杆 I. 5-2. 5 g，蒸馏水I L，pH 7. 0的培养基；梭菌增殖培养含胰蛋白胨10. 0g，酵母提取物3g，NaCl 5. 0g，半胱氨酸盐酸盐O. 5g,醋酸钠3. Og,碳酸I丐3g,干棉杆I. 5-2. 5 g,蒸懼水I L, pH 7. O的培养基；③培养过程中每天观测分解现象，并每隔2-3天测定棉杆分解量，即时淘汰分解差或无分解现象的重复，保留分解旺盛的重复，并作为下一次继代培养的菌种，如此循环往复继代培养30-60次，直至分解能力稳定，最终获得稳定复合菌系；④将分解能力保持稳定的重复，即时用甘油或真空冻干保存；3)制备棉杆快速分解复合菌剂，载体为棉杆、水稻秸杆和/或小麦秸杆，制作步骤是①复合菌发酵准备混合菌原种和PCS培养液，将相当于培养液体积3-5%的菌种原液接种于PCS培养液中，保温50-60°C静止培养3-5天；热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和 嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为10-20%、5-15%、5-35%、5-20%, 25-35%和10-20% ；②载体制备将80°C烘干的棉杆、水稻秸杆或小麦秸杆粉碎后过O. 4 mm筛子备用；③吸附发酵在棉杆粉中加入占棉杆重量2-3%的尿素、O. 1-0. 5%的鱼粉、O. 1-0. 3%的酵母粉和45-55%的自来水，边搅拌边喷洒占棉杆粉1-2%的预发酵好的复合菌液置于发酵缸内于50-60°C保温培养，每天搅拌1-2次，每3-4天喷洒I次同样的菌液，第5次喷洒菌液量为棉杆粉重的10-20%，喷洒后立即60-70°C烘干，当总体水分含量为20-25%时即刻停止干燥，即成制品并包装。本发明复合菌剂所选择的6株菌中任何菌株在同样条件下单独培养均没有分解功能，只有将它们组合在一起才能通过它们之间的协同功能发挥整体分解活性。由于复合菌剂的菌株均是从棉杆堆肥中筛选而来，因此对棉杆具有很好的适应能力，对棉杆能实现快速分解，特别能对棉杆天然木质纤维素中的纤维素和半纤维素实现高效分解。分解6天，棉杆总分解率达34. 7%，其中半纤维素分解64. 2%，纤维素分解43. 1%，木质素损失11. 2% ；经12天分解，棉杆总分解率达51. 7%，其中半纤维素分解84%，纤维素分解67%，木质素损失21%。本复合菌剂可用于对棉杆进行预分解处理后制作食用菌培养料、用于棉杆能源转化和饲料化等用途，也适于棉杆有机肥生产的发酵エ艺中，提高棉杆制作有机肥的质量。(I)棉杆的粉碎处理将自然风干的棉杆用棉杆专业粉碎机粉碎成1-1. 5 cm左右的小段；
(2)畜禽粪便的准备将猪粪、牛粪和鸡粪在阴凉通风处晾至含水量为40-60% ；(3)设计总堆肥为200 kg，将畜禽粪便和棉杆混合均匀，干物质混合比例分别为猪粪牛粪鸡粪棉杆=1:0. 5: 0.5: 4;调节堆体起始水分含量在50%，调节起始碳氮比为30 ；(4)堆制开始后，前7-10天，每天翻堆2-3次；10-20天，每天翻堆1_2次；20_30天时,每2-3天翻堆I次；31-45天时,每4-6天翻堆I次,46天-60天，每7_10天翻堆一次；(6)堆制过程中每1-3天测定堆体温度、pH值和棉杆分解量等指标，根据测定指标进行适时调节。
2、棉杆快速分解复合菌系的筛选。(I)根据堆体的温度、pH和棉杆分解量的测定结果，适时取实例I制作的20g堆肥加入到500 mL三角瓶中，再加200 mL已灭菌的O. 2M PBS缓冲液，置摇床中震荡30 min ；,摇床转速为120转/min。PBS 缓冲液 NaCl 8g，KCl O. 2g, NaH2PO4 I. 44g, KH2PO4 O. 24g，加蒸馏水水 800 mL,调节PH值至7. 0，最后用蒸馏水至1000 mL所得缓冲液。(2)将三角瓶从摇床中取出静置20 min，取上层液体10 mL作为接种菌液接种到500 mL盛有250 mL改良PSC培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱50°C黑暗静止培养。改良PCS培养基NaCl5 g, CaCO3 2. 5 g，蛋白胨5 g，酵母粉 I g，K2HPO4 I g,MgSO4 · 7H20 O. 35 g，干棉杆 I. 5 g、蒸馏水 I L, pH 7. 0,121°C灭菌 20 min。(3)培养过程中每天观测分解现象，并每隔2-3天测定棉杆分解量，即时淘汰分解差或无分解现象的重复，保留分解旺盛的重复并作为下一次继代培养的菌种，如此循环往复继代培养40次，直至分解能力稳定，最终获得稳定复合菌系。(4)将分解能力保持稳定的重复即时用甘油或真空冻干保存。3、棉杆快速分解复合菌剂的制作。所述复合菌中，热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、脱硫肠状菌(Desulfotomaculum putei)、嗜热地衣芽抱杆菌(Geobacillus thermoIeovo)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)和嗜热乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的细胞数含量具体为 10%、5%、35%、5%、35% 和 10%。制作载体，载体为棉杆，制作方法是(I)复合菌发酵准备混合菌原种和PCS培养液，将相当于培养液体积3%的混合菌种原液接种于PCS培养液中，保温50°C，静止培养3天；热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为10%、5%、35%、5%、35%和10%。菌混合菌原种和PCS培养液，将相当于培养液体积3%的菌种原液接种于改良PCS培养液中，保温50°C静止培养5天；(2)棉杆载体制备将80°C烘干的棉杆粉碎后过0. 4 mm筛子备用；(3)吸附发酵在棉杆粉中加入占棉杆重量3%的尿素、0. 1%的鱼粉、0. 1%的酵母粉和45%的自来水，边搅拌边喷洒占棉杆粉1%的预发酵好的复合菌液置于发酵缸内50°C保温培养，每天搅拌1-2次，每3-4天喷洒I次同样的菌液，第5次喷洒菌液量为棉杆粉重的15%，喷洒后立即60°C烘干，当总体水分含量为20%时即刻停止干燥，即成制品并包装。
实例ニI、水稻秸杆堆肥的制备。除干物质混合比例分别为猪粪牛粪鸡粪水稻秸杆=1.5:1:1:4. 5，调节堆体起始水分含量在60%，其余同实例一。2、棉杆快速分解复合菌系的筛选。适时取30 g堆肥加入到500 mL三角瓶中，再加400 mL已灭菌的生理盐水。将三角瓶从摇床中取出静置30 min，取上层液体20 mL作为接种菌液接种到500mL盛有350 mL改良PSC培养基的三角瓶中，置于恒温培养箱60°C黑暗静止培养。
培养基为Mandels培养基。Mandels 培养基组成蛋白胨 2. 5g，(NH4)2SO4 I. 4g，MgSO4 ·7H20 O. 3g,KH2PO4 2g，FeSO4 · 7H20 5mg, MnSO4 I. 6mg, ZnCl2 I. 7mg, CoCl2 I. 7mg, CaCO3 2g,干棉杆 2 g，蒸懼水 IL, pH 7. O0循环往复继代培养30次。3、水稻秸杆快速分解复合菌剂的制作。(I)复合菌发酵准备混合菌原种和Mandels培养液，将相当于培养液体积4%的菌种原液接种于Mandels培养液中,保温60°C,静止培养5天；热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为15%、20%、5%、20%、25%、20%。菌混合菌原种和Mandels培养液,将相当于培养液体积4%的菌种原液接种于Mandels培养液中，保温60°C静止培养3天；(2)吸附发酵在棉杆粉中加入占棉杆重量2. 5%的尿素、O. 35%的鱼粉、O. 2%的酵母粉和50%的自来水，边搅拌边喷洒占棉杆粉2%的预发酵好的复合菌液置于发酵缸内保温60°C培养，每天搅拌1-2次，每3-4天喷洒I次同样的菌液，第5次喷洒菌液量为棉杆粉重的17%，喷洒后立即70°C烘干，当总体水分含量为25%时即刻停止干燥，即成制品并包装。其余同实例一。实例三I、小麦秸杆堆肥的制备。设计总堆肥为200 kg，将畜禽粪便和小麦秸杆混合均匀，干物质混合比例分别为猪粪牛粪鸡粪棉杆=2: 1.5: 1.5: 6。其余同实例一。2、小麦稻杆快速分解复合菌系的筛选。培养基为梭菌增埴培养基胰蛋白胨10. Og,酵母提取物3g, NaCl 5. Og,半胱氨酸盐酸盐O. 5g,醋酸钠3. Og,碳酸韩3g,干棉杆2. 5 g,蒸懼水I L, pH 7.0。循环往复继代培养60次，直至分解能力稳定。第5次喷洒菌液量为小麦秸杆粉重的10%。其余同实例一。3、棉杆快速分解复合菌剂的制作。(I)复合菌发酵准备混合菌原种和PCS培养液，将相当于培养液体积5%的菌种原液接种于梭菌增殖培养液中，保温60°C，静止培养5天；热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为20%、15%、10%、15%、25%、15% ；菌混合菌原种和梭菌增殖培养液，将相当于培养液体积5%的菌种原液接种于梭菌增殖培养液中，保温50-60°C，静止培养5天；(3)吸附发酵在棉杆粉中加入占棉杆重量2%尿素、O. 5%的鱼粉、O. 3%的酵母粉和55%的自来水，边搅拌边喷洒占棉杆粉2%的预发酵好的复合菌液置于发酵缸内保温60°C培养，每天搅拌1-2次，每3-4天喷洒I次同样的菌液，第5次喷洒菌液量为棉杆粉重的20%，喷洒后立即70°C烘干，当总体水分含量为25%时即刻停止干燥，即成制品并包装。其余同实例一。实例四热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢 杆菌和嗜热乳杆菌在混合菌种中的细胞数含量分别为15%、7%、30%、12%、25%和11%。将相当于培养液体积3%的混合菌种原液接种于改良PCS培养液中，保温55°C静止培养4天。第5次喷洒菌液量为棉杆粉重的20%，喷洒后立即60°C烘干，当总体水分含量为23%时即刻停止干燥。其余同实例一。本发明以上述实例一方法制备的复合菌剂为例说明复合菌剂对棉杆的分解性能。利用该复合菌剂分解棉杆6天后棉杆总分解率达34. 7%，其中半纤维素分解64. 2%，纤维素分解43. 1%，木质素损失11. 2% ;经12天分解，棉杆总分解率达51. 7%，其中半纤维素分解84%，纤维素分解67%，木质素损失21%。本发明的微生物吸附载体主要为棉杆、小麦秸杆等木质纤维素废弃物，它们对本复合菌剂具有很高的吸附性能，吸附后经冷冻、干燥后均能保持稳定、高效的分解功能。由于组成本发明的菌株均是从棉杆堆肥中筛选而来，因此对棉杆具有很好的适应能力和显著分解效果。本复合菌剂曾用于对棉杆进行预分解处理后制作食用菌培养料，与未经本菌剂处理的棉杆相比，经本菌剂处理后，食用菌菌丝生长更快，形成子实体的时间更短。该复合菌剂还可用于对棉杆、水稻秸杆、小麦秸杆进行适当分解后用于棉杆能源转化和饲料化等其他用途，棉杆经该菌剂适当分解处理后，天然木质纤维素结构被打破，有利于棉杆能源转化过程中纤维素酶的水解，也使棉杆饲料质地更加柔软，适口性增强；该菌剂也适于棉杆有机肥生产的发酵工艺中，在棉杆堆肥发酵过程中添加该菌剂后，可使堆体温度提升更快，棉杆分解更迅速，有机肥腐熟速度加快，质量提高。


本发明涉及一种能快速分解棉秆的复合菌剂及其制备方法，菌剂由热纤梭菌、脱硫肠状菌、嗜热地衣芽孢杆菌、溶纤维丁酸弧菌、枯草芽孢杆菌和嗜热乳杆菌构成，各细胞数含量分别为10-20%、5-15%、5-35%、5-20%、25-35%和10-20%。制备方法是粉碎风干棉秆，猪、牛、鸡粪等晾至含水量40-60%，混合堆制并翻堆，测定温度、棉杆分解量等指标；适时取堆肥至三角瓶中，加生理盐水或PBS缓冲液置摇床中震荡，取出静置，按混合量接种菌液置培养基中恒温黑暗静止培养；将分解旺盛的重复作为下一次继代培养的菌种，循环往复继代培养30-60次，获得稳定复合菌系；棉秆粉中加入酵母粉等，喷洒菌液，烘干数次即得。本菌剂能对棉杆中的纤维素和半纤维素实现高效分解，用于棉秆能源转化和饲料化等用途。