专利名称：一种咖啡酰酒石酸及其制备方法和应用的制作方法咖啡酰酒石酸是制备抗菌、抗病毒药物的原料。目前已有从紫维菊中提取咖啡酰酒石酸的报道，其方法是按原料比水为1 :2-5的比例加水溶解，滤液加到装有酸性大孔吸附树脂层析柱中，依次用三种梯度的洗脱液洗脱，收集洗脱液，调至酸的体积份数为 0. 05%-10%，用95%乙醇解吸，减压蒸干，即得咖啡酰酒石酸。目前尚未有从抱茎苦荬菜中提取咖啡酰酒石酸的方法。
本发明的目的是提供一种咖啡酰酒石酸。本发明的另一目的，是提供一种咖啡酒石酸的制备方法和用咖啡酰酒石酸对抱茎苦荬菜及其制剂的质量控制以及对咖啡酰酒石酸制剂的质量控制。采用的技术方案是一种用咖啡酰酒石酸，其特征是由抱茎苦荬菜提取、分离制备成。一种用咖啡酰酒石酸的制备方法，是将抱茎苦荬菜药材常规加水煎煮两次，合并煎煮液，浓缩，加盐酸调节PH值为3 4，加乙醇至含醇量60% 70%，静置12小时，离心， 分取上清液，减压回收乙醇至浓缩液无醇味，过滤，滤液调节PH值4 5，通过预先处理好的大孔树脂柱纯化，用水洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩，用盐酸调节PH值3 4，用正丁醇萃取4 6次，再用盐酸调节pH值1 2，用正丁醇萃取4 6次，合并正丁醇液，用1%碳酸氢钠溶液萃取4 6次，合并萃取液，用盐酸调节PH值1 2，用醋酸乙酯萃取8 10次，合并萃取液，减压浓缩至干，加醋酸乙酯溶解，溶液通过预先处理好的硅胶柱，分别用醋酸乙酯、醋酸乙酯-甲醇(1 :1)、甲醇洗脱， 收集甲醇洗脱液减压浓缩至干，得白色粉末，在甲醇中重晶2次，得到无色针状结晶咖啡酰酒石酸。用从抱茎苦荬菜中提取的咖啡酰酒石酸，其特征在于能制备成注射液、粉针剂、片剂、胶囊剂和颗粒剂以及缓控释剂。用从抱茎苦荬菜中提取的咖啡酰酒石酸，其特征是用于测定抱茎苦荬菜的方法为色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0. 4%磷酸溶液，乙腈与0. 4%磷酸溶液配比为10 90,为流动相；检测波长为；理论板数以咖啡酰酒石酸峰记算应不低于3000 ；对照品溶液的制备精密称取咖啡酰酒石酸对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img 的溶液，摇勻，即得；供试品溶液制备取本品粉末过40目筛，精密称定0.5g，置50ml聚塞锥形瓶中，精密加入5% 10%的甲酸甲醇溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟 1小时，再称定重量，用5% 10%的甲酸甲醇溶液补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 20μ 1，注入液相色谱仪，测定， 即得。用从抱茎苦荬菜中提取咖啡酰酒石酸，其特征在于测定抱茎苦荬菜制剂的质量控制方法为
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0. 4%磷酸溶液，乙腈与0. 4%磷酸溶液配比为10 :90，为流动相；检测波长为；理论板数以咖啡酰酒石酸峰记算应不低于3000 ；
对照品溶液的制备精密称取咖啡酰酒石酸对照品适量，加甲醇制成每Iml含0. Img 的溶液，摇勻，即得；
供试品溶液制备取相应制剂，提取，定容，制备成供试品溶液； 测定法分别精密吸取对照品溶液5 20 μ 1、供试品溶液5 20 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明公开了从抱茎苦荬中提取咖啡酰酒石酸的方法，提取的咖啡酰酒石酸能作为主要活性成制备抗菌、抗病毒药物；用于抱茎苦荬菜及其制剂的质量控制、咖啡酰酒石酸制剂的质量控制。

1、取抱茎苦荬菜，水煎煮提取二次，第一次加水8倍量，提取1-2小时，第二次加水6倍量提取1小时，合并滤液，浓缩至相密度在60°C温度下为1. 10 1. 20，加盐酸调节PH值为 3-4，再加乙醇至含醇60—70%，静置12小时，离心过滤(转速3000 4000转/分)，分取上清液，减压回收乙醇至浓缩液无醇味，过滤；滤液调节PH值为4-5，通过预先处理好的AB8 型大孔树脂柱纯化，用水洗脱(每一体积树脂上6体积样品；吸附流速为4体积/小时；洗脱剂量为4体积树脂)，收集洗脱液，洗脱液浓缩至相对密度在60°C温度下为1. 10 1. 20，用盐酸调节PH值至3-4，用正丁醇萃取4-6次(每次用量为十分之一目标溶液
体积)，弃去正丁醇萃取液，再用盐酸调节PH值为1-2，再用正丁醇萃取4-6次(每次用量为十分之一目标溶液体积)，合并萃取液，用1%碳酸氢钠溶液萃取4 6次(每次用量为十分之一目标溶液体积)，合并萃取液，用盐酸调节PH值为1-2，用醋酸乙酯(每次用量为十分之一目标溶液体积)萃取8-10次，合并萃取液，减压浓缩至干，加醋酸乙酯适量使溶解，溶液通过预先处理好的硅胶柱(层析硅胶200 300目，6倍目标样品质量)，分别用醋酸乙酯 (4倍层析硅胶体积)、醋酸乙酯-甲醇(4倍层析硅胶体积)、甲醇(4倍层析硅胶体积)洗脱， 收集甲醇洗脱液减压浓缩至干，得白色粉末，在甲醇中重晶2次，即得。下列实验表明本发明咖啡酰酒石酸在抗菌、抗病毒方面的药理作用。1抑菌效果试验 1. 1方法及结果
1. 1. 1方法精密称取咖啡酰酒石酸适量，加注射用水分别制成0. 5μ g/ml、l. 0μ g/ml, 5. 0 μ g/ml, 20 μ g/ml, 35 μ g/ml 5 个浓度，121 °C，20 min 灭菌，放入直径 0. 5cm 灭菌
滤纸片浸润后备用。用划线法将金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、副伤寒杆菌的菌株接种在制作好的培养基中，置37°C恒温培养箱中培养Mh，取出后放入4°C冰箱中保存备用。分别取上述菌株的新鲜培养物，在无菌操作条件下，用涂布棒均勻涂抹在琼脂培养基上。再用无菌镊将在各不同浓度药液中浸润的纸片均勻间隔贴于各琼脂培养基表面，轻压纸片使接触良好，放入37°C恒温培养箱中(各样品重复3次)。24h后取出，用卡尺准确测量各培养皿中滤纸片有效抑菌圈的直径。1.1. 2 结果见表 1。
表1 咖啡酰酒石酸抑菌效果试验
菌株浓度(μ g/ml)抑菌圈(cm)
金葡菌 SA0. 50. 75 0. 75 0. 76
1 0. 81 0.82 0.82 50. 96 0.98 0.97
201.09 1.08 1.08
351. 14 1. 12 1. 12
大肠杆菌 EC0. 50. 76 0. 76 0. 76
1 0.80 0.81 0.80 50.94 0.94 0.94
201.06 1.07 1.08
351.09 1.10 1.10
绿脓杆菌 BA0. 50. 73 0. 73 0. 72
10.84 0.85 0.83
50.98 0.97 0.97
201.06 1.06 1.05
351.08 1.08 1.08
副伤寒杆菌 BP 0. 50.81 0.81 0.80
1 0. 86 0.86 0.88 51. 00 0.99 0.97
201. 05 1.07 1.05
351. 08 1.08 1.09
1.2结论从表1可以看出，咖啡酰酒石酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、副伤寒杆菌均有较好的抑菌作用。随着浓度的增高，抑菌效果也随之增高。2咖啡酰酒石酸对猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)的作用 2. 1方法
2. 1. 1 咖啡酰酒石酸对H(-15细胞的安全浓度测定先将咖啡酰酒石酸稀释成适宜浓度，然后取500 μ 1咖啡酰酒石酸稀释液用细胞维持液倍比稀释后，加到长成单层的 ΡΚ-15细胞的96孔细胞培养板上，0. Iml /孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照，置5% CO2培养箱37°C培养96h，每天观察CPE情况，测得咖啡酰酒石酸对冊_15细胞的最大安全浓度为45yg/ml。2. 1. 2病毒毒力测定(TCID5tl)按常规方法，将细胞进行消化传代，细胞数调整至IXlO6个/ml，加至96孔细胞培养板中，0. Iml/孔，CO2培养箱中37°C培养。待细胞长成单层后，接种稀释度分别为10—1 10—11的病毒液，0. Iml/孔，每个稀释度接种4孔，5% CO2培养箱37°C培养96h，每天观察CPE情况。按Reed-Muench公式计算TCID5tl，测得PPV TCID50 为 l(T6/ml。2. 1. 3 细胞培养与细胞病变(CPE) H(-15传代细胞加入96孔板，24 3 后可长成致密的单层，正常细胞呈三角形、多角形、圆形等多种形态，细胞轮廓清晰。接种PPV 96 120h后，细胞多角形轮廓逐渐失去棱角，脱落、变圆、团缩，聚集成堆。
2. 2. 1咖啡酰酒石酸对PPV的阻断作用在安全浓度的基础上将咖啡酰酒石酸分别倍比稀释成9个稀释度，加到长至单层的Η -15细胞的96孔培养板
上，0.1ml/孔，每个稀释度重复4孔。37°C作用4h，弃去药液，每孔加入 IOOTCID5ci病毒液0. Iml,另设细胞对照和病毒对照，5%0)2培养箱37°C培养，每天观察CPE，当病毒对照组的细胞病变达到75以上时，记录各组CPE情况。观察细胞生长情况， 其结果见表2。表2咖啡酰酒石酸对PPV的阻断作用
药物浓度(yg/ml) 45 22. 5 11. 3 5.7 2.8 1.4 0. 7 0. 35 0. 18
病毒对照空白对照
孑Li~-----
++ +++ +++ +++ -
孑L 2------
+ +++ +++ +++ -
孑L 3------++
+++ +++ +++ -
孔 4-------++
+++ +++ +++ -
试验结果表明，咖啡酰酒石酸在体外对PPV的阻断作用比较明显，咖啡酰酒石酸的最小阻断浓度为1. 4 μ g/ml，可见咖啡酰酒石酸与H(-15细胞作用后，再接种PPV，与病毒和细胞对照组相比，咖啡酰酒石酸浓度为1. 4 45 μ g/ml时均能影响PPV对细胞的致病变作用。2.2.2咖啡酰酒石酸对PPV的抑制作用测定将 IOOTCID50病毒液接种至长成单层H(-15的96孔细胞培养板上，0. Iml/孔，5% CO2培养箱 37°C培养4h，再加入倍比稀释的咖啡酰酒石酸，0.1ml /孔，每个稀释度重复4孔，另设细胞对照和病毒对照。5% CO2培养箱37°C培养，每天观察CPE，当病毒对组的细胞病变达到 75%时，记录各组CPE情况，记录方法同2. 2. 1。观察细胞生长情况，其结果见表3。
表3咖啡酰酒石酸对PPV的抑制作用
药物浓度(μ g/ml) 45 22. 5 11. 3 5.7 2.8 1.4 0. 7 0. 35 0. 18
病毒对照空白对照


一种咖啡酰酒石酸，其特征是由抱茎苦荬菜提取分离制备成本发明公开了从抱茎苦荬中提取咖啡酰酒石酸的方法，提取的咖啡酰酒石酸能作为主要活性成制备抗菌、抗病毒药物；用于抱茎苦荬菜及其制剂的质量控制、咖啡酰酒石酸制剂的质量控制。