专利名称：增加必需氨基酸的低蛋白婴儿配方奶的制作方法认识到(早产)婴儿对必需氨基酸的需要是重要的，因为过量或不足的摄入均可能导致长期的病态，例如肥胖(Singhal et al. (2002) Am JClin Nutr 75 :993-9)或者生长欠佳和神经发育受损的后果(Stephens etal (2009) Pediatrics 2009;123:1337-43)。支链氨基酸(BCAA)亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)占体内蛋白质中饮食必需氨基酸的35% -40%,占骨骼肌总氨基酸的14%。婴儿营养一直使用母乳制定，母乳被认为是最理想的组成。但是，由于用于婴儿营养品生产的蛋白质源的不同氨基酸组 成，其蛋白质水平普遍高于母乳中的蛋白质水平，以确保BCAA的充足摄入。现在越来越清楚，由婴儿摄取的早期营养对婴儿期及以后的生活均有代谢效应，即代谢印迹。例如WO 2008/054200公开了代谢印迹是规划未来健康时的一种重要机制并且特别地设计食物以通过给予低蛋白饮食来阻止以后生活中的肥胖。因此，饮食中蛋白质太高或太低对婴儿均是有害的。但是，足月婴儿和早产婴儿对必需氨基酸的精确需要量是未知的。
历史上，已经使用描述性的或粗的测量值，像生长和氮平衡来研究氨基酸需求。尚未使用稳定同位素技术来进行研究以测量恰当地肠内喂养婴儿的必需氨基酸需要量。本发明人因此通过使用这项优选技术研究了肠内喂养婴儿的必需氨基酸需要量，以便测定营养组合物中所述氨基酸的最佳比例并且测定所述三种必需的BCAA缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的绝对需要量。现在这些研究的结果根本上颠覆了已知的氨基酸需要量的观念。这与具有低蛋白质浓度旨在预防婴儿中有害代谢印迹效应的配方奶尤其相关。本发明人惊奇地发现缬氨酸需要量，其目前设定在87mg/kg/天，应该在100-175mg/kg/天，优选的范围为110_160mg/kg/天。对于异亮氨酸和亮氨酸，本发明人也已经确定了了其需要量增加。对于异亮氨酸，已发现其为100-160mg/kg/天，优选地在105-150mg/kg/天，而目前的推荐为88mg/kg/天。由于亮氨酸需要量似乎与目前推荐值相当，本发明发现的最突出的结论是必须改变这三种必需支链氨基酸的比例。优选地，Leu He Val的重量比为(I. 1-1. 5) (O. 9-1. I) 1.0，而不是目前推荐的1.9 1.0 I. O的Leu He Val重量比。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种包括蛋白质、可消化的碳水化合物和脂肪的营养组合物，其中所述蛋白质包括所述的氨基酸——亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，其中亮氨酸异亮氨酸缬氨酸的重量比为(I. 1-1. 5) (O. 9-1. I) 1.0。优选地，所述Leu He Val 的重量比为(I. 3-1. 5) (O. 9-1. I) 1.0，优选为(I. 3-1. 5) (O. 9-1. O) 1.0，优选为在I. 3 I. O L O 和 L 5 O. 9 I. O 之间。因此本发明的一种优选的组合物包括，每IOOml中，40_120mg缬氨酸，优选为55-120mg缴氨酸，优选为70-1 IOmg缴氨酸；40-120mg异亮氨酸，优选为55-1 IOmg异亮氨酸，优选为70-100mg异亮氨酸；以及70-180mg亮氨酸，优选为90_170mg亮氨酸。本发明的组合物意在用于0-36个月的婴儿。当具有优选的能量含量每100ml60-70kcal时，本发明的一种优选的组合物包括，90-180mg缴氨酸/IOOkcal所述总组合物,优选地100_150mg缴氨酸/lOOkcal,优选地105_121mg纟颜氨酸/IOOkcal ;90-180mg异亮氨酸/IOOkcal所述总组合物，优选地95-170mg异亮氨酸/IOOkcal,优选地100-150mg异亮氨酸/IOOkcal ；和120-260mg亮氨酸/IOOkcal所述总组合物，优选地120_180mg亮氨酸/IOOkcal,优选地130-160mg亮氨酸/IOOkcal。优选地，所述亮氨酸异亮氨酸缬氨酸的重量比为(I. 3-1. 5) (0. 9-1. I) I. O。包括上述范围的氨基酸的组合物优选地用于婴儿的肠内或肠胃外喂养。具体地，所述组合物用于阻止婴儿在婴儿期或其以后生活中的肥胖，同时在所述婴儿主要依靠所述组合物来摄入蛋白质的时期维持最佳生长。 蛋白质含量本发明所使用的术语“蛋白质含量”可以由氮含量计算，使用公式氮含量X6.25。所述氮含量可以根据本领域技术人员已知的标准程序来测量。婴儿本发明的术语“婴儿”意指年龄在0-36个月，优选为0-18个月，甚至更优选为0-6个月的人。所述婴儿越小，则所述婴儿就更加依赖所述婴儿配方奶以摄入蛋白质。因此，所述配方奶优选地供给小于12个月的年龄组的婴儿或由于消化问题或过敏而依靠所述婴儿配方奶以摄入蛋白质的婴儿。早产婴儿和/或小于胎龄儿早产婴儿是指在标准怀孕期完成前，在母亲怀孕37周时或37周之前出生的婴儿，即从母亲最后一次月经期的开始起37周时或37周之前。小于胎龄儿(SGA infant)是出生体重在该胎龄体重的第十个百分位以下的婴儿。他们通常是受到宫内生长限制(IUGR)。早产婴儿和/或SGA婴儿包括低出生体重婴儿(LBWinfant)、极低出生体重婴儿(VLBW infant)和超低出生体重婴儿(ELBW infant)。LBW婴儿定义为体重低于2500g的婴儿。VLBW婴儿为体重低于1500g的婴儿，ELBW婴儿为体重低于IOOOg的婴儿。婴儿配方奶是包括蛋白质、脂肪、碳水化合物和微量营养素(例如维生素和矿物质)的完全营养的配方奶。优选地，所述婴儿配方奶包括膳食纤维、核苷酸和脂肪酸花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)。所述术语婴儿配方奶排除母乳。好的营养对于早产婴儿和足月出生婴儿的最佳生长和发育是必需的。蛋白质是充足营养的重要成分，因为它可以提供关键蛋白质合成和生长所需要的必需氨基酸。在生命早期营养尤其重要，因为在生命最初4周内的蛋白质摄入可以对以后的认知功能和血压具有主要影响。儿童中肥胖的发病率和严重程度的惊人增长已经进一步引起了对婴儿期喂养方式的关注。在生命最初1-2年内高的早期体重增加与以后的有害健康后果相关，所述有害健康后果例如血压上升、超重和身体脂肪积贮增加、和糖尿病风险增加。相比母乳喂养的儿童，婴儿配方奶喂养的婴儿中较高的蛋白质摄入可能起了作用，因为配方奶喂养的儿童在I岁年龄时达到更高的体重和体重身高比。降低婴儿食物中蛋白质含量可能是一个可以有助于降低这些有害效应的策略。好的蛋白质质量，即营养上可用的氨基酸的正确量变得更关键。经典地9种氨基酸被认为是膳食必需的；如果这些氨基酸没有以正确的比例给予，蛋白质合成将会减少。所述必需氨基酸的需要量已经由若干不同方法测定。历史上，已经使用过描述性的或粗的测量值，像生长和氮平衡。尚未使用稳定的同位素技术来进行研究以测量恰当地肠内喂养婴儿必需氨基酸需要量的研究。对于例如新生儿这样的脆弱人群，长期维持缺陷的膳食是不能接受的。Brunton et al. (1998) Curr Opin Clin Nutr Metab Care, I (5) :ρ· 449-53确认了一种在婴儿和儿童中使用指示氨基酸氧化(IAAO)技术的微创方案。该方案最近已用于在健康学龄儿童中测定总的支链氨基酸需要量。儿童中的需要量评估与成人中的评估类似，这表明实验方法得出的值主要反映维持的需要量，不考虑所有生长需要。·0-6个月婴儿目前的推荐量是基于人乳中的氨基酸含量，这可能是不充足的，因为母乳喂养的婴儿有相当不定的乳摄入并且母乳喂养的婴儿自己在很大程度上可以调节他们需要的摄入量。欧洲食品安全局(EFSA)法规要求婴儿配方奶每IOOkcal含有88mg缬氨酸、92mg异亮氨酸和167mg亮氨酸,且每IOOml配方奶最低60kcal最高70kcal,即每IOOml配方奶中含有52. 5-62. Omg缴氨酸、55-64. 9mg异亮氨酸和100_118mg亮氨酸。根据本发明所述这些范围是不充足的。根据本发明，所述婴儿配方奶中总蛋白质含量优选为，以所述组合物的总热量计，I.3-1. 9g蛋白质/IOOkcal,甚至更优选为I. 3-1. 8g蛋白质/IOOkcal,得到的婴儿配方奶包括5. 2% -7. 6%的蛋白质。一种优选的组合物每IOOkcal热量包括90_180mg缬氨酸、90-180mg异亮氨酸和每IOOkcal热量包括130_260mg亮氨酸。对于基于氨基酸或蛋白质水解产物的组合物，本发明的优选的范围是每IOOkcal热量105-120mg缬氨酸、100-120mg异亮氨酸和每IOOkcal热量130-160mg异亮氨酸，因为这是与实验测定的平均氨基酸需要量(见实施例1-2)最接近的范围。对于基于非水解(完整的)蛋白质的组合物，这些后面的窄范围优选约低10%,优选地低10% -20%。因此在一个实施方案中，对于基于非水解(完整的)蛋白质的组合物，本发明的优选的范围是每IOOkcal热量105-120mg缬氨酸、100-120mg异亮氨酸和每IOOkcal热量130_160mg异亮氨酸。在本发明另一个优选的实施方案中，一种营养组合物包括脂类、蛋白质和可消化的碳水化合物成分，其中为制造营养组合物，所述蛋白质成分提供总热量的5. 0% -7.6%,所述脂类成分提供总热量的35% _55%，所述可消化的碳水化合物成分提供总热量的30% -60%,并且其中所述组合物每IOOml包括,40-1 IOmg纟颜氨酸,优选为40_70mg纟颜氨酸，和40-110mg异亮氨酸。优选地，所述亮氨酸缬氨酸的重量比在I. I I. O到I. 5 I. O范围内，更优选地在I. 3 I. O到I. 5 1.0范围内，并且所述异亮氨酸缬氨酸的重量比在O. 9 I. O到I. I I. O范围内，优选为约I. O I. 0，这意味着异亮氨酸和缬氨酸的量不一定必须精确地相同，但是在第二位小数的四舍五入界限内。因此，优选地，所述亮氨酸异亮氨酸缬氨酸的重量比在(I. 1-1. 5) (O. 9-1. I) I. O范围内，优选地在(I. 1-1. 5) : I. O : I. O 范围内。优选地，本发明所述组合物用于喂养主要依靠本发明所述组合物以摄入蛋白质的婴儿。这些婴儿的年龄范围优选为0-36个月，优选为0-18个月，甚至更优选为0-6个月。通过使用基于水解蛋白或氨基酸的配方奶，所述组合物还可以用于患有(多种)食物过敏的婴儿，所述食物过敏正常地会限制所述婴儿对完整蛋白质的摄入。另外，所述组合物可以用于疾病(如苯丙酮尿症(PKU)、槭糖尿病(MSUD)或酪氨酸血症(tyrosinaemia))的膳食治疗。通常，给婴儿喂食150ml婴儿配方奶/kg体重/天。优选地，使用这种喂养方案，婴儿摄取了本发明确立的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的量。因此，在一个实施方案中，本发明涉及婴儿配方奶用于喂养婴儿的非医疗用途，或用于喂养婴儿的非医疗方法，该方法包括给予一种婴儿配方奶，其中所述婴儿配方奶包括以(I. 1-1.5) (0.9-1. I) I. O比例提供亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的蛋白质，并且在给婴儿喂食150ml所述营养组合物/kg体重/天时，所述婴儿配方奶提供100_175mg缬氨酸/kg体重/天，和100-160mg异亮氨酸/kg体重/天。蛋白质
以所述组合物的总热量计，蛋白质优选地以低于8%的量存在于所述组合物中。以总热量计，优选地所述营养组合物包括5. 0% -8. O %的蛋白质，更优选5. 5% -8. 0%，甚至更优选5. 7% -7. 6%的蛋白质。所述组合物的总热量计为所述组合物的脂肪、蛋白质和可消化的碳水化合物释放的热量的总和热量。低蛋白浓度确保较低的胰岛素反应，因而防止婴儿体内脂肪细胞，尤其是内脏脂肪细胞的增殖。所述营养组合物的蛋白浓度是通过蛋白质、多肽和游离氨基酸的和确定的。所述蛋白浓度是通过测定氮的量，将其乘以因子6. 25而确定的。I克蛋白质相当于4kcal。以干重计,所述组合物优选地包括少于12wt. %蛋白质，更优选地包括6-llwt. %蛋白质，甚至更优选地包括7-10wt. %蛋白质。以即饮的或重溶粉末得到的液体产品计，所述组合物优选地包括少于I. 5g蛋白质/100ml,更优选
O.8-1. 35g 蛋白质 /IOOml0优选地，所述蛋白质源的选择方式是，满足必需氨基酸含量的最小需要量并确保良好生长。因此基于牛乳蛋白的蛋白质源(例如乳清、酪蛋白及其混合物)和基于大豆的蛋白质是优选的。在使用乳清蛋白的情况下，所述蛋白质源优选地是基于酸乳清或甜乳清、乳清蛋白分离物或其混合物，并且可以包括α-乳白蛋白和β_乳球蛋白。更优选地，所述蛋白质源是基于酸乳清或已经去除酪蛋白糖巨肽(caseino-glyco-macropeptide, CGMP)的甜乳清。从甜乳清中去除CGMP或使用酸乳清有利地降低了苏氨酸含量。优选地，使用富含α-乳白蛋白的乳清蛋白以便优化氨基酸谱。使用具有更接近人乳的优化氨基酸谱的蛋白质源使得能够以低的蛋白质浓度提供所有必需氨基酸并且仍然确保良好生长，所述低的蛋白质浓度以由蛋白质、脂肪和可消化的碳水化合物提供的总能量含量计在8%以下，优选地以所述总能量含量计在5. 5%到8. O %之间。为确保可以达到低水平的总蛋白质，本发明所述的营养组合物优选地包括这样一种蛋白质来源，其中亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的总和提供总氨基酸含量的至少20wt%。如果使用改性的甜乳清作为蛋白质来源，则优选地补充以总蛋白质计0. l-3wt. %的量的游离精氨酸和/或0. 1-1. 5wt. %的量的游离组氨酸。所述蛋白质可以是完整蛋白或水解蛋白或完整蛋白与水解蛋白的混合物，但是完整蛋白通常是优选的。优选地，所述组合物包括水解酪蛋白和/或水解乳清蛋白。已发现，与给予包括完整酪蛋白和完整乳清蛋白的组合物相比，给予其中蛋白质包括水解酪蛋白和水解乳清的组合物导致了胰岛素和葡萄糖的饭后水平降低。在配方奶喂养的婴儿中胰岛素和葡萄糖水平的增加指示了一种形式的胰岛素不敏感和/或抗性。以蛋白质干重计，本发明组合物优选地包括至少25wt. %的链长为2-30个氨基酸的肽。链长为2-30个氨基酸的月太的量例如可以按照 de Freitaset al, (1993), J. Agric. Food Chem. 41 :1432-1438 描述的来测定。本发明组合物可以包括酪蛋白水解产物，或本发明组合物可以包括乳清蛋白水解产物，或本发明组合物可以包括酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物。本发明组合物优选地包括酪蛋白水解产物和乳清蛋白水解产物，因为牛酪蛋白的氨基酸组成与人乳蛋白中发现的氨基酸组成更相似，而乳清蛋白更容易消化，并且乳清蛋白在人乳中占较大比例。以蛋白质的总重量计，本发明组合物优选地包括至少50wt. %,优选地至少80wt. 最优选地约IOOwt. %的蛋白水解产物。所述组合物优选地包括蛋白质水解度在5% -25%，更优选地在7. 5% -21%，最优选地在10% -20%的蛋白质。水解度定义为已被酶促水解作用切断的肽键的百分数，100%是存在的全部可能肽键均被切断。制备水解产物的适合方式记载于W001/41581。当使用基于氨基酸的蛋白质源时，可以更好地预测有多少氨基酸实际上为婴儿可 用的。因此，本发明的一种优选的组合物包括氨基酸作为蛋白质源。在本发明组合物的一个实施方案中，所述蛋白质基本上由游离氨基酸组成。一个优选的实施方案显示在实施例3中。膳食纤维儿童中粪便微生物群组成的早期差异可以预测超重(Kalliomaki etal. (2008)AmJ Clin Nutr 87(3) :534-538)。作者证实，在生命的第一年中影响微生物群数量和质量的双歧杆菌属(Bifidobacterium spp)在正常体重的7岁儿童中的数目要高于发育超重的儿童。不受理论限制，本发明人相信除低的蛋白质摄入外，使用能够刺激双歧菌群的膳食纤维将会对婴儿中的肥胖的防止或治疗有额外的效果。所述膳食纤维选自可以刺激双歧杆菌属生长的纤维。优选地，非消化性低聚糖具有2到60的聚合度。优选地，所述非消化性低聚糖选自低聚果糖(包括菊糖)、低聚半乳糖(包括反式低聚半乳糖)、低聚葡萄糖(包括低聚龙胆糖、低聚黑曲霉糖和环糊精低聚糖)、低聚阿拉伯糖、低聚甘露糖、低聚木糖、低聚岩藻糖、低聚阿拉伯半乳糖、低聚葡萄甘露糖、低聚半乳甘露糖、包括低聚糖的唾液酸和糖醛酸低聚糖。优选地，所述本发明组合物包括低聚果糖、低聚半乳糖和/或半乳糖醛酸低聚糖，更优选地低聚半乳糖，最优选地β键连接的低聚半乳糖。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括β键连接的低聚半乳糖和低聚果糖的混合物，更优选地重量比为20-2 1，更优选12-7 I。优选地，所述本发明组合物包括聚合度为2-10的低聚半乳糖和/或聚合度为2-60的低聚果糖。优选地，所述低聚半乳糖选自β键连接的低聚半乳糖、反式低聚半乳糖、低聚半乳糖、乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(neo-LNT)、岩藻糖乳糖、岩藻糖基化的 LNT 和岩藻糖基化的 neo-LNT。例如有以 Vivinal (Borculo Domo Ingredients,Netherlands)商标销售的β键连接的低聚半乳糖。优选地，所述低聚半乳糖的糖是 连接的，因为这也是人乳中低聚半乳糖的情况。低聚果糖是包括β键连接的果糖单元链的ND0，其聚合度或平均聚合度为2-250，更优选为10-100。低聚果糖包括菊糖、果聚糖和/或多聚果糖的混合型。一种尤其优选的低聚果糖是菊糖。适合用于所述组合物的低聚果糖也已经是市售的，例如Raftiline HP(Orafti)。糖醛酸低聚糖优选地从果胶降解产物中获得，更优选为从苹果果胶、甜菜果胶和/或柑橘果胶中获得。优选地，所述组合物包括的β键连接的低聚半乳糖低聚果糖糖醛酸低聚糖的重量比为20-2 I 1-3，更优选为12-7 I 1-2。优选地，所述组合物包括80mg到2g非消化性低聚糖/100ml,更优选150mg到
I.50g,甚至更优选300mg到lg。以干重计,所述组合物优选地包括O. 25wt. %到5. 5wt. %,更优选地O. 5wt. %到4wt. %，甚至更优选地I. 5wt. %到3wt. %的非消化性低聚糖。较低量的非消化性低聚糖在刺激微生物群中的有益细菌方面不太有效，然而太高的量会导致胃胀和腹部不适的副作用。已经完成一项确定对配方奶喂养婴儿中双歧菌群的刺激的研究，显示与只有一种
膳食纤维的配方奶相比，低聚半乳糖和长链菊糖在组合给予时其具有更高的促双歧杆菌效应。给予9-10个月龄的婴儿500ml配方奶/天，持续I个月，所述配方奶包括I. 2gβ-低聚半乳糖加上长链菊糖(组Α)。对照组接受没有低聚半乳糖和长链菊糖的配方奶(组B)。总共138个儿童参加所述研究。通过FISH分析检查这段时间前后的粪便菌群。在干预时间后，组A中的双歧杆菌/总细菌的比例显著地高于组B。因此本发明的一种优选的组合物包括β-低聚半乳糖和长链菊糖的组合。脂肪如上所说明的，所述婴儿配方奶的蛋白质含量对婴儿的脂质代谢和脂肪沉积有效果。并且，已经证实婴儿配方奶中脂肪的脂质组成对肥胖，尤其是躯干性肥胖或内脏肥胖的预防有重要的影响，例如参见W02008/054208。所述术语“内脏肥胖”是指内脏脂肪量增加的病症。所述术语内脏肥胖还称为躯干性肥胖。内脏肥胖一般是由过多的内脏脂肪量(累积)引起的。与位于皮肤下面的皮下脂肪和散布于骨骼肌中的肌肉内脂肪不同，内脏脂肪，还称为器官脂肪、腹内脂肪、腹膜脂肪或躯干脂肪，通常位于腹膜腔内。内脏脂肪包括肠系膜脂肪、肾周脂肪和腹膜后脂肪。在W02008/054208中公开的在先研究证实，中链脂肪酸(MCFA)有助于降低以后生活的脂肪量。因此，除了本发明权利要求中的具体蛋白质和氨基酸含量之外，所述组合物有利地包括MCFA。当使用包括⑴比例在2到6之间的LA/ALA和(ii)低LA含量(以总脂肪酸计
<14.5% )和任选地LC-PUFA(尤其是DHA)的营养组合物时，具体地证实了对内脏脂肪沉积的效果。该组合物导致了以后生活中内脏肥胖的降低。因此，一种优选的营养组合物包括蛋白质、可消化的碳水化合物和脂肪，其中所述蛋白质包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸，所述亮氨酸异亮氨酸缬氨酸的比例范围为(I. 1-1.5) (0.9-1. I) 1.0;并且所述脂肪包括比例在2到6之间的亚油酸和α亚油酸，并且以总脂肪酸计，所述亚油酸含量少于14. 5wt. %。优选地，该组合物可以用于婴儿的肠内喂养以预防以后生活中的肥胖。应用所述本发明营养组合物有利地被早产婴儿或小于胎龄儿摄取或被给予早产婴儿或小于胎龄儿，并因此意在用于早产婴儿或小于胎龄儿的肠内或肠胃外治疗。本发明营养组合物及其优选地其中蛋白质基本上由游离氨基酸组成的形式还可有利地用于患有选自PKU,MSUD和酪氨酸血症的代谢疾病的婴儿的治疗，或用于患有食物过敏的婴儿的治疗。优选地，本发明营养组合物有利地被0-36个月优选0-24个月的婴儿摄取，或被给予0-36个月优选0-24个月的婴儿。本发明还涉及本发明营养组合物用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗a)年龄在0-24个月的婴儿和/或b)早产婴儿或c)小于胎龄儿或d)患有选自PKU、MSUD和酪氨酸血症的代谢疾病的婴儿或e)患有食物过敏的婴儿。在一个优选的实施方案中，本发明涉及本发明营养组合物用于制造预防以后生活中肥胖的药物的用途。 本发明还涉及本发明营养组合物用于制造用于喂养年龄范围在0-36个月的婴儿的组合物的非医疗用途。本发明还涉及一种婴儿配方奶用于喂养婴儿的非医疗用途，其中所述婴儿配方奶包括以(I. 1-1.5) (O. 9-1. I) 1.0的比例提供亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的蛋白质，并且当婴儿被喂食150ml所述营养组合物/kg体重/天时，所述婴儿配方奶提供100到175mg缴氨酸/kg体重/天，和100到160mg异亮氨酸/kg体重/天。实施例实施例I.婴儿的缬氨酸和异亮氨酸需要量实验设计足月男婴(η = 28)登记加入该研究。他们的胎龄为37_43周，出生体重多于2500g，并且他们的出生后年龄为· 28天。使用IAAO技术(Zello et al. (1993)Am J Physiol 264 :E677_85)测定缬氨酸的需要量，并在一个单独的实验中测定异亮氨酸的需要量。该方法使用当一种必需氨基酸受限制时会被氧化的指示剂，因为不储存氨基酸，氨基酸必须在合并到蛋白质中或氧化之间分配。如果所检测的氨基酸在膳食中缺乏，这将限制蛋白质合成并且所述指示剂氨基酸将被氧化。如果所述要检测氨基酸的膳食摄入增加，所述指示剂的氧化将降低直到满足所述要检测氨基酸的需要量。当摄入满足了需要量时，蛋白质合成以最佳能力发生，并且所有其他必需氨基酸的氧化降解到达平稳阶段。要检测的氨基酸的需要量由这个分界点鉴定。在该研究期间，受试者被随机分配以接受5到236mg/kg/天的缬氨酸分级摄入或5到216mg/kg/天的异亮氨酸分级摄入。在适应所述研究用膳食24小时后，获得基线呼吸样本并且开始示踪剂方案。每天在所述示踪剂方案之前和结束时称重受试者，并在研究当日测量头围。研究用配方奶本发明人使用一种与正规的Neocate相同的研究用配方奶，Neocate是一种基于氨基酸的配方奶，设计用来满足婴儿的氨基酸需要量(SHS，Liverpool, UK)，但是没有所要检测的氨基酸并且苯丙氨酸的量降低。缬氨酸的量独立地按照L-缬氨酸的形式调整。异亮氨酸的量独立地以L-异亮氨酸的形式调整。在适应时间和[13C]碳酸氢盐注入期间，补充L-苯丙氨酸以在整个研究期间获得稳定的166mg/kg/d的总摄入量。为使所述配方奶含氮量相等，本发明人独立地加入了 L-丙氨酸。因为苯丙氨酸用作指示剂并且在氧化发生前苯丙氨酸会被羟基化为酪氨酸，酪氨酸摄入被确信高于目前的要求。过于受限的酪氨酸摄入可能会降低呼出空气中13C标记的回收。为使喂食对[13C]碳酸氢盐平稳阶段的作用最小，在[13C]碳酸氢盐注入期间给予持续的滴液喂食。为使受试者的不适最小，在[I-13C]苯丙氨酸注入期间他们可以每小时喝一瓶。示踪剂方案在研究日受试者接受最初的(15 μ mol/(kg),持续的(10 μ mol/(kg · h))的[13C]碳酸氢盐(灭菌无热原，99% 13C同位素原子超额百分数(APE);剑桥同位素，沃本，MA)的肠内注入3小时以定量个体的CO2产生量。在注入经标记的碳酸氢钠后，直接由注入泵通过鼻胃管进行最初的(30 μ mol/(kg),持续的(30 μ mol/(kg · h)) [I-13C]苯丙氨酸(99% 13CAPE;剑桥同位素，沃本，MA)肠内注入5小时。带有示踪剂的注射器在注入之前和之后称重以测定研究期间给予的示踪剂的精确量。样本收集在适应日使用直接采样方法在前8位患者中收集呼吸样本以测定获得稳定背景富集所需要的时间，对该方法的描述见于Van der Schooret al. (2004)Pediatr Res 55:50-4。在研究日在开始示踪剂注入前15和5分钟获得基线样本。实验中，在[13C]碳酸氢盐注入的同位素稳定状态开始I. 75小时后，每10分钟收集两份13C富集的呼吸样本；并且在[1」3C]苯丙氨酸注入的同位素稳定状态开始3小时后，每15分钟收集两份13C富集的呼吸样本。
分析和计算呼出空气中的13CO2同位素富集是由同位素比值质谱法(ABCA ；EuropeScientific, Van Loenen Instruments,莱顿,荷兰)测量的并且表示为基线之上的同位素原子超额百分数(APE)。稳定状态定义为三个或三个以上的斜率不为O的连续点(P
<O. 05) ο 按照在先的描述(Riedijket al. (2005) Pediatr Res 58 :861-4)对每个婴儿计算估计的身体CO2产生量(πιπιοΙ/Ο^·!!))。[I-13C]苯丙氨酸的分步氧化比率使用如下方程式计算苯丙氨酸的分步氧化(％) = [IEphe X iB]/[iPHE x IEb]x 100%其中 IEphe 是在[I-13C]苯丙氨酸注入(APE)期间呼出空气中的13C同位素富集，iB是[13C]碳酸氢盐的注入率(μ mol/(kg · h))，iPHE 是[I-13C]苯丙氨酸的注入率(μ mol/(kg · h))，IEb 是在[13C]碳酸氢盐注入期间呼出空气中的13C同位素富集(van der Schoor et al. (2004)Gut 53:38-43)。统计分析描述性数据表示为均值土SD。当斜率的线性因子没有显著地不同于O时(P · 0.05)，就达到了 [I-13C]苯丙氨酸期间呼出气息中13CO2的稳定状态。缬氨酸需要量是通过在分步氧化(fractional oxidation)上应用两阶段线性回归交叉模型(Ball andBayley(1984)J Nutr 114 :1741-6 ;Seber GAF. Linear Regression Analysis. New York John Wiley, 1977)来确定的。摄入的安全水平(95%置信区间以上)是使用Fieller’s定理(Seber GAF. Ibid.)确定的。所有统计分析均使用SPSS完成(SPSS版本15. 0，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。结果
所有的受试者在[13C]碳酸氢盐和[I-13C]苯丙氨酸注入时达到了同位素稳定状态(到达平稳阶段)，这是由平稳阶段时任何两个数据点之间没有显著的斜率而确定的。缴氨酸摄入和分步氧化之间的Spearmen’ s秩相关系数是O. 63 (p = O. 000)。使用两阶段回归分析，并且以所述缬氨酸摄入作为独立变量，以所述[i-13c]苯丙氨酸示踪剂的分步氧化作为因变量，测定的分界点为110mg/kg/d。通过95%置信区间以上所测定的安全人口摄入为164. 6mg/kg/d。异亮氨酸摄入和分步氧化之间的Spearmen’s秩相关系数是O. 74 (p = O. 000)。从以所述异亮氨酸摄入作为独立变量，以所述[i-13c]苯丙氨酸示踪剂的分步氧化作为因变量的两阶段回归分析中，可以确定分界点为105mg/kg/d。按照95%以上的置信区间所确定的人口安全摄入量为152mg/kg/d。实施例2.婴儿的亮氨酸需要量按照与实施例I相同的方法，测定了婴儿的亮氨酸需要量。·足月男婴(η = 33)登记加入该研究。他们的胎龄为37_43周，出生体重大于2500g，他们的出生后年龄为· 28天。结果所有的受试者在[13C]碳酸氢盐和[I-13C]苯丙氨酸注入时达到了同位素稳定状态(到达平稳阶段)，这是由平稳阶段时任何两个数据点之间没有显著的斜率而确定的。使用两阶段回归分析，以所述亮氨酸摄入作为独立变量，以所述[I-13C]苯丙氨酸示踪剂的分步氧化作为因变量，确定的分界点为140mg/kg/d。按照95%以上置信区间所确定的安全人口摄入量为245mg/kg/d。实施例3.适合治疗过敏婴儿的基于氨基酸的营养物


本发明涉及婴儿配方奶中必需支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的改进的配重。