专利名称：制备适用于生物组织的器件、尤其是治疗受损组织贴片的方法及根据该方法获得的器件的制作方法医学领域中认为，需要通过诱导组织再生来治疗受损组织，如糖尿病性溃疡导致的组织损伤或具有梗塞后遗症的心壁。可有效用于本目的的材料能够提供适用于细胞成分生长和迁移的细胞外基质，以能够形成生物组织。人们的兴趣尤其集中在天然聚合物上，因为天然聚合物(如纤维蛋白) 可被其嵌入的生物环境再吸收。其中，纤维蛋白是一种涉及如血液凝固的生物过程的蛋白质，经过被称为纤维蛋白溶解的自然降解过程能够被再吸收。施用各种有效成分，如抗生素、抗发炎制剂和特定生物活性分子(被称为生长因子)也有利于这些受损组织的功能恢复。促血管新生生长因子尤其重要，因为它们通过诱导软组织的血管再生，而有助于软组织的再生。这些因子中最知名的有血管内皮生长因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肾上腺髓质素原N端20肽(PAMP)，它们适用于治疗心脏缺血后遗症和慢性糖尿病性溃疡后遗症。其它生长因子可有助于修复具体组织。例如，转化生长因子-i3 1(TGF_i3 1)及 bFGF通过促进软骨细胞的增殖和细胞外基质的形成来促使关节软骨的再生。可以以溶液的形式局部给予生长因子，但在这种情况下，生长因子易于与组织分离和/或被快速降解，而导致其治疗效果急剧下降。因此需要按照可控动力学给予生长因子。纳米纤维基质(如纤维蛋白的纳米纤维基质)提供了一种能够稳定(即保持并逐渐释放)生长因子以及其它治疗剂(如抗菌剂和抗发炎制剂)的理想介质。天然存在的纤维蛋白为柔软凝胶状的无定形物质，这意味着纤维蛋白不具备使其易于操作且能抵抗很多生理环境中的动态应力的机械特性和结构特性，如具有弹性模量和抗张强度。为了因各类疾病而受损的组织的功能性恢复，需要有用于保持组织与纳米纤维基质接触的生物相容性介质，以有利的贴片形式涂敷于所述组织上；其中，纳米纤维基质能够支持促进再生的细胞过程。同样地，还需要一种贴片，该贴片能够保持有助于所述组织再生过程的治疗剂，且在被治疗的组织中逐渐释放该治疗剂。现今已知的结构，如US 6，762，336或W02008/019128中描述的结构，其用途局限于创伤的止血治疗。所述文献中描述的一些结构包括与受损组织接触的凝血酶和纤维蛋白原的交替邻接层，以及起支撑作用的聚合物层。所述结构的一些实施例包含插入一层生物相容性粘合材料，或向其中一层添加有效成分。在低温(0°c -40C )条件下制备上述绷带，且在每一层沉淀后都进行深低温冷冻步骤(_8(TC )；在这些条件下，凝血酶不促进纤维蛋白原形成纤维蛋白。因此，绷带内不包含纤维蛋白，而仅在绷带敷于创伤后才形成纤维蛋白，从而发挥敏锐的止血功能。除了无法确保在可预期的施用时间内将结构保持在一起的足够的粘合力或保证动态环境(如在心壁的动态环境中发生强应力/变形循环)中结构的稳定性之外，使用该方法结合两层使该结构制备过程变得相当复杂，同时还限制了其止血功能。US 2006/0204783描述一种用于涂敷医疗器件的组成物，所述组成物包括分散在基质中的多种纳米结构(硅、镍或二氧化钛(Ti02)的纳米纤维)；其中，在构成基质的很多可能的材料中包括纤维蛋白。所述组成物以粉末或膏状形式涂敷于各种类型的医疗器件上，以便构成纳米结构涂层。因此，本发明的一个目的是提供一种制备生物相容性结构的方法，所述生物相容性结构能够稳定地施用于细胞外基质的生物组织上，所述生物相容性结构对所述组织具有治疗效果，适用于促进细胞成分生长和迁移。本发明的另一个目的是制备一种结构，尤其是制备一种器件，所述器件能够按照预定的动力学将有效成分释放至所述组织中。本发明的一个特别目的是制备一种结构，以便所述结构以受控的释放速度将生长因子、尤其是促血管新生生长因子释放至受损组织中，从而促进所述组织以例如血管再生或治疗性血管生成过程的方式进行恢复。本发明的另一个目的是制备一种器件，尤其是制备一种贴片，所述贴片具有适用于组织或器官重建术的结构，尤其具有适用于心脏重建术、或适用于修复易受相当大应力的组织的任何情况的结构。本发明的另一个目的是提供一种制备需要有限时间和成本的所述生物相容性结构的方法。
本发明通过一种用于生物组织的贴片结构达到上述和其他目的，所述贴片结构包括支撑层，由生物相容性合成聚合物材料构成，且所述支撑层具有微孔非织物结构；生物交互层，由纤维蛋白纳米纤维网构成，所述生物交互层固定于第一层，且在使用时与所述组织接触；所述结构的主要特点是通过将纤维蛋白原涂敷于所述生物相容性聚合物上，并将凝血酶防护性地分散在所述生物相容性聚合物中，从而将所述纳米纤维网固定于所述生物相容性聚合物材料上。换而言之，构成本发明目的的器件是固定在所述微孔非织物上且受其支撑的交联纳米纤维蛋白，所述微孔非织物由生物相容性合成聚合物材料制成。因此，这种情况中的纤维蛋白不能止血，且其坚度、形态和机械强度源自用于所述纤维蛋白固定的支撑物，而不是通常以柔软凝胶状的无定形物质形式存在的纤维蛋白。根据本发明，受支撑的纤维蛋白比没有任何支撑的纤维蛋白要花费更长的时间来进行纤维蛋白溶解(即几天，而不是几小时)。有利地是，在所述生物交互层中分散有有效成分，尤其是用于治疗由外伤、烧伤、 糖尿病性溃疡、褥疮等而导致组织损伤的生长因子；所述生物交互层用于保持有效成分并将所述有效成分释放至所述组织中。例如所述器件有助于促进例如生物组织的体外或体内细胞生长。本发明还有一个目的是提供一种制备上述涂敷于生物组织上的贴片结构的方法; 其中，所述贴片结构包括支撑层，包括生物相容性聚合物材料；生物交互层，包括纤维蛋白纳米纤维网，所述纳米纤维网从前体即纤维蛋白原开始直接在支撑层上制备。所述方法包括以下步骤制备支撑层的底面(backing surface)；制备包含生物相容性聚合物材料的第一溶液以及包含凝血酶的第二溶液；其中， 所述凝血酶是一种用于促进从前体开始形成生物交互层的制剂；将所述第一溶液和所述第二溶液同时分布在底面上，以得到第一溶液与第二溶液的原位混合物，经在所述底面上直接沉淀形成所述支撑层，这样得到的所述支撑层由所述生物相容性聚合物材料构成并且浸渍有凝血酶；将纤维蛋白原涂敷于所述支撑层上，经所述支撑层中包含的所述凝血酶作用使所述纤维蛋白原发生改性，以形成与所述支撑层牢固结合的纤维蛋白层；将所述前体涂敷于所述支撑层的涂敷步骤如下使所述支撑层与包含所述前体的第三溶液接触，并且在给定温度下保持所述接触以给定的时间。换而言之，由生物相容性聚合物材料形成支撑层，并且包含(尤其是接近暴露面， 即与所述底面相对的一侧)分散的凝血酶；其中，所述凝血酶是一种促进纤维蛋白纳米纤维网形成的制剂。当纤维蛋白原(纳米纤维网的前体)在适宜时间和温度的条件下与所述制剂接触时，开始形成纳米纤维网，形成的纳米纤维网牢固地锚固(或固定、或交织、或相互连接)在所述支撑层的聚合物材料上。将所述制剂分散在支撑层中为以下过程创造了适当条件使所述纳米纤维网加固于所述支撑上，从而在过程结束时获得与所述支撑层牢固结合的生物交互层；也就是说，所述纤维蛋白层直接在所述支撑层内形成，且至少表面上固定于支撑层的厚度中。所述第二溶液由生物相容性聚合物材料的非溶剂液体构成。在所述第一溶液与第二溶液原位混合的过程中，由于所述非溶剂液体的作用使得生物相容性聚合物沉淀在所述底面上。所述方法优选通过在底面上原位混合两种溶液来实现；其中，所述底面由沿着旋转轴线转动和/或滑动的轴提供。所述方法能够快速制备支撑层，且所述支撑层浸渍有用于促进纳米纤维网形成的制剂。得到的支撑层具有微孔且硬质的(mechanically resistant) 非织物材料的结构。本发明的详细说明纤维蛋白是一种自然来源的聚合物，参与很多生物修复过程，尤其参与到血液的凝固过程中。纤维蛋白通过已知为纤维蛋白溶解的方式被再吸收。由于从支撑层的内部形成，包含在根据本发明的器件中的纤维蛋白编织成交联纳米纤维结构，从而使生物组织的形成能够实现；其中交联纳米纤维结构提供适于细胞成分生长和迁移的细胞外基质。因此， 本发明提供了一种适用于受损组织再生治疗和体外细胞培养的基质。要注意的是，因为包含在根据本发明的器件中的纤维蛋白已经交联，所以所述纤维蛋白在与受损生物组织接触时不具备止血功能，而是用作三维细胞外基质和载体，以用于药物有效成分的控释。纳米纤维横向尺寸的优选范围为50nm-300nm、范围尤其是100nm-200nm。除了为促进组织再生的细胞过程提供理想的细胞外基质外，所述纳米纤维结构可以结合例如有效成分(尤其是生长因子)的物质，并将所述物质的可动性(mobility)限制在生物交互层中，以便根据纳米纤维的尺寸(尤其是直径)按照更易控制的较慢动力学，缓慢将所述物质扩散或迁移及随后释放至组织中使其再生。在特定加工条件下，即在特定的温度条件(大约37°C )下使用特定的酶(凝血酶) 处理纤维蛋白原预定时间(至少6小时)，从而得到所述交联纳米纤维结构。这样能够完全控制引起从纤维蛋白原开始形成纤维蛋白的条件。通过特定的酶(被称为因子XIII或纤维蛋白稳定因子)使得形成纤维蛋白大分子间的交联成为可能。连同纤维蛋白原，第三溶液还包含一定量的因子XIII，其浓度范围为5国际单位 (IU)/ml-60IU/ml、优选的浓度范围为 5IU/ml_30IU/ml。尤其是，纤维蛋白原可与纤维蛋白溶解抑制剂混合使用，以便延长贴片的有效寿命，尤其是延长有效成分的施用时间。连同纤维蛋白原和因子XIII，第三溶液优选还包含一定量的抑肽酶 (aprotinin)，其浓度范围为1000KIU(胰激肽原酶失活单位)/ml-5000KIU/ml、优选浓度为 2000KIU/ml-4000KIU/ml 之间。纤维蛋白原和凝血酶优选是来源于人的、或者可来自其它哺乳动物。优选地，第二溶液中包含的凝血酶的浓度范围为10IU/ml-500IU/ml、尤其为 15IU/ml-50IU/mL·连同凝血酶，第二溶液还包含一定量的氯化钙，其浓度范围为5nM-30nM、尤其是 10nM-20nM 之间。有利地，前体涂敷于支撑层上的涂敷步骤可根据选自下列的方法完成将包含前体的溶液喷射在支撑层上；将固结的支撑层从底面上移除，以将所述支撑层浸入前体中，且维持在预定温度；特别在纤维蛋白的实例中，所述浸入方法优选在接近37°C的温度条件下进行，如 320C _42°C的范围内或者更好是在35°C _39°C的范围内，所述浸入方法能够获得非常均勻的生物交互层。有利地，水溶液中包含的纤维蛋白原的浓度范围为10mg/ml-50mg/ml、尤其为 15mg/ml-25mg/ml。有利地，在同时分布步骤中，存在选自以下一种物质的浓度发生变化的步骤第一溶液中的生物相容性聚合物材料；用于促进从前体开始形成生物交互层的制剂；或者上述两种物质。特别地，在同时分布第一溶液和第二溶液的步骤中，用于促进纳米纤维网形成的制剂浓度从最低水平(如0IU/ml)增至最高水平(如10IU/ml-50IU/ml)。该制剂集中在更接近支撑层表面的区域，在该区域发生与纤维蛋白原的相互作用。从而能够容纳使用的一定量的凝血酶。而通过选择用于制备支撑层的合成材料也能达到相同目的，且通过所选择的合成材料使制剂显示出分子扩散的有限趋势。这是例如与由芳香族聚氨酯和硅树脂制成的材料相关的凝血酶的情况。通过根据本发明的方法，能够制备优选将有效成分施用于生物组织的贴片结构， 例如，将生长因子施用于受损组织以促进后者恢复；这种情况下的生物交互层的制备过程中，前体和有效成分一起在混合物或溶液中使用，即生物交互层中包含有效成分。有效成分尤其是促血管新生生长因子，用于诱导受损组织的血管再生；例如，促血管新生生长因子选自于VEGF ；bFGF ；PAMP ；或者上述生长因子的组合物。可选择地，生长因子可以是松弛素或源自血小板溶解液(血小板源生长因子 (PDGF))的一种或多种有效成分，或者松弛素和所述有效成分的组合物。可选择地，生长因子可以是胰岛素样生长因子(IGF-1或IGF-2)、或表皮生长因子 (EGF)，或转化生长因子TGF-β、成骨素、肝素结合生长因子(HBGF)-l、HBGF-2。此外，根据本发明的结构可包含选自上述生长因子的组合物，还包含上述生长因子的有生物活性的衍生物，且所述衍生物与另一和/或所述生长因子混合。除生长因子之外，有效成分可以是氧化氮，或抗微生物和/或抗菌、和/或防腐、 和/或抗病毒、和/或止痛、和/或抗发炎特性的制剂，或维生素。根据本发明的特定实施例，贴片结构可包含纳米粒子，尤其是包含有效成分的聚合物纳米粒子，用于在预定时间段内将有效成分释放至组织中。这使得可延长有效成分受控施用的时间，以使其超过贴片结构在生物环境中降解所带来的限制。纳米粒子可以分散在支撑层的厚度范围内和/或生物交互层的纳米纤维网中。在前一种情况中，纳米粒子添加在包含生物相容性聚合物材料的第一溶液中；在后一种情况中，纳米粒子添加在包含纳米纤维网前体的第三溶液中。所述纳米粒子可选自于可生物降解的聚酯，尤其是聚乳酸(PLA)；聚乙醇酸(PGA)；包含PLA和PGA的共聚物(聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA))；线型或分枝状聚己内酯(PCL)和/或其共聚物。生物相容性聚合物材料可包含合成聚合物，如选自以下的合成聚合物PGA、PLA及其共聚物；聚羟基丁酸酯(PHB)；聚对二氧杂环己酮；聚氨基酸；聚乙二醇(PEG)；芳香族聚氨酯或脂肪族聚氨酯(PU)，优选为聚醚型聚氨酯(PKU)；芳香族聚酯型聚氨酯(PhU)或脂肪族(PhU)；或其共聚物和/或混合物；硅树脂，优选是二乙酰氧基甲硅烷端聚二甲硅氧烷(PDMS)；上述聚合物的组合物，优选为共聚物。如果根据本发明的贴片要用于具有刚度和强度特征的组织(如骨头或韧带)，则支撑层的材料可选自于如PGA、PLA、及其共聚物；PHB、聚对二氧杂环己酮；聚氨基酸、PEG/ PLA 的嵌段共聚物(PELA) ；PLGA-PEG-PLGA 的嵌段共聚物[PLGA-PEG-PLGA] ；PLA-PEG-PLA 的嵌段共聚物[PLA-PEG-PLA]。如果根据本发明的贴片要用于具有弹性特征的组织(如心血管系统或表皮)，则支撑层的材料可选择属于弹性体类的聚合物，如芳香族PEtU或脂肪族PKU、芳香族PEsU 或脂肪族PEsU、或其共聚物和/或混合物；硅树脂及其共聚物和/或混合物；线型或分枝状 PLC、和/或其共聚物和/或混合物。在最后的情况中，弹性成分使得根据本发明的结构具有机械强度和弹性特征，这对于在具有一定弹性的组织上施用是必须的。事实上，选择支撑层材料使结构的弹性模量与大部分生物组织的弹性模量相似；尤其是，当弹性模量达到范围为0. 3MPa-l. 5MPa时，该弹性模量的值与人心肌的值类似。可根据本领域技术人员公知的方法，基于要治疗的组织和要释放的有效成分的需求，通过使用上述材料的组合物调节支撑物的生物可降解性。事实上，很多聚氨酯都具有非常高的生物可降解性可通过聚氨酯与硅树脂的共聚作用降低该特性，使获得的共聚物在体内仍可降解但具有较慢的动力学特性，以便延长贴片在组织中的停留时间。尤其是，聚氨酯与硅树脂的组合物包含15-40重量份的硅树脂、尤其包含25-35重量份的硅树脂。通过参考附图对在此作为实例给出的实施例进行说明，使得本发明的其他特征更加清楚的表现出来，其中图1示意性示出了根据本发明器件的层；图2示意性示出了制备根据本发明器件过程中某一步骤所使用的“喷雾机 (spray-machine) ” ；图3示意性示出了根据本发明结构的支撑层11，其中支撑层11厚度的表面部分浸有凝血酶；图4示出了贴片10的图像和支撑层11的图像的对比；其中贴片10的图像示出了由纤维蛋白构成的生物交互层12的暴露面；所述暴露面经红色的丽春红(Ponceau)(纤维蛋白对其有特殊的亲和力)染色呈现浓重均勻的着色；作为对照，支撑层11不包含纤维蛋白，因此不能保留染色剂，而呈白色；图5示出了从根据本发明支撑层中分离纤维蛋白的质量测试；图6和图7为形成于根据本发明支撑层上的纤维蛋白层表面的两张扫描电子显微镜(SEM)图像，两张SEM图像分别具有两种不同的放大倍数；图8示出了从采用两种不同浓度的纤维蛋白原获得的两个根据本发明的贴片结构中释放生长因子VEGF和bFGF的曲线图；图9为嵌入有纳米粒子的本发明器件的示意图。


本发明涉及一种器件，所述器件由支撑和固定在微孔非织物上的交联纳米纤维蛋白构成；其中，微孔非织物由生物相容性合成聚合物材料构成。有效成分有利地分散在纤维蛋白层中。纤维蛋白层不具备止血功能，但适用于保持且通过受控的动力学释放有效成分。构成本发明目的的器件优选为贴片形式，用于体外细胞培养或治疗因创伤或坏死而受损的组织，如遭受梗塞后遗症的心壁或由糖尿病性溃疡而受损的组织。可在适宜的条件下，直接在支撑层上通过诱导纤维蛋白的聚合反应来制备根据本发明的贴片；其中，支撑层适当地(至少在其厚度的表面部分)浸渍凝血酶，并且支撑层是由便捷的喷雾相转化技术制备而成。