专利名称：一种制备热稳定的包含氧载体的组合物的方法血红蛋白在大多数脊椎动物中对于血管系统和组织之间的气体交换具有重要作用。其负责经由血液循环将氧从呼吸系统运送至体细胞，并且还将代谢废物二氧化碳从体细胞运离至呼吸系统，在呼吸系统二氧化碳被呼出。由于血红蛋白具有此氧运输特性，因此如果其在离体状态下可以被稳定并且可以在体内使用，则其可以被用作有效的供氧器。天然存在的血红蛋白是四聚体，当其存在于红细胞内时通常是稳定的。然而，当天然存在的血红蛋白移出红细胞中时，其在血浆中变得不稳定，并且分裂成两个α-β 二聚体。这些二聚体的每一个的分子量为约32kDa。这些二聚体当通过肾脏过滤和分泌时可能导致实质性的肾损伤。四聚体键的断裂也负面地影响了功能性血红蛋白在循环系统中的持久性。为了解决所述问题，近年来在血红蛋白加工方面的发展已经引入了多种交联技术来形成四聚体内的分子内键以及四聚体之间的分子间键，从而形成聚合血红蛋白。现有技术教导聚合血红蛋白是增加血红蛋白的循环半衰期的优选形式。然而，本发明人确定，聚合血红蛋白在血液循环中更容易转变成为高铁血红蛋白。高铁血红蛋白不能结合氧因此不能氧合组织。因此，现有技术教导的导致形成聚合血红蛋白的交联作用是有问题的。在本领域中存在着对允许分子内交联从而形成稳定的四聚体而不同时形成聚合血红蛋白的技术的需求。现有技术为稳定血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括产生的四聚体血红蛋白中包含无法接受的高百分比的二聚体单位；二聚体的存在使得血红蛋白组合物不能令人满意地施用于哺乳动物。血红蛋白的二聚体形式可以导致哺乳动物机体的严重肾损伤； 此肾损伤可以严重到足以导致死亡的程度。因此，本领域中存在着对在终产物中形成含有检测不到的二聚体形式的稳定的四聚体血红蛋白的需求。现有技术血红蛋白产品的另一个问题是在施用后血压突然升高。过去，已经从较早一代的基于血红蛋白的氧载体记录到血管收缩事件。例如，如由KatZ等，2010公开的那样，Hemopure 产品(Biopure Co.，USA)导致较高的平均动脉压(1 士9mmHg)或比基线 (96士 IOmmHg)高30%。过去解决此问题的尝试依赖于巯基试剂与血红蛋白巯基反应，据说能防止内皮衍生舒张因子与巯基的结合。然而，巯基处理的使用增加了加工步骤，导致成本和杂质的增加，这些杂质以后必须从血红蛋白组合物中去除。因此，在本领域中存在着对当施用于哺乳动物时不导致血管收缩和高血压的血红蛋白的制备方法的需求。现有技术为形成稳定的血红蛋白进行的尝试所存在的更多问题包括蛋白杂质诸如免疫球蛋白G的存在可以导致哺乳动物中的变态反应效应。因此，本领域中存在着对可以产生稳定的四聚体血红蛋白同时不含蛋白杂质的工艺的需求。除了上述问题以外，在本领域中存在着对稳定的四聚体血红蛋白的需求，所述四聚体血红蛋白不含二聚体、不含磷脂并且能够以工业规模生产。发明内容本发明提供了一种加工非聚合的、热稳定的、纯化的交联四聚体血红蛋白的方法， 所述交联四聚体血红蛋白适合用于哺乳动物而不会导致严重的肾损伤、血管不利影响和严重的不良事件包括死亡。本发明去除了二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白、磷脂和蛋白杂质。另外，本发明使用(1)快速细胞裂解设备，所述设备用于精确的和可控的低渗裂解，⑵流通柱色谱(flowthrough column chromatography), (3)短时间高温 (HTST)设备，所述设备在纯化过程中用于热加工血红蛋白溶液以去除不需要的不稳定的血红蛋白二聚体并去除蛋白杂质，例如免疫球蛋白-G，使得可以避免肾损伤、血管不利影响和其他毒性反应，和(4)气密输液袋包装以避免氧侵入至产品中。
该方法包括哺乳动物全血的起始材料，所述全血至少包括红细胞和血浆。将哺乳动物全血中的红细胞与血浆分离，接着过滤从而获得滤过的红细胞级分。洗涤滤过的红细胞级分从而去除血浆蛋白杂质。在快速细胞裂解设备中以50-1000升/小时的流速通过可控的低渗裂解来破裂所述洗涤过的红细胞足以裂解红细胞却不裂解白细胞的时间。进行过滤从而从所述裂解产物中去除至少一部分废截留物。从所述裂解产物中提取第一血红蛋白溶液。
使用超滤滤器进行第一超滤过程，所述超滤滤器被配置成从第一血红蛋白溶液中去除分子量比四聚体血红蛋白高的杂质并且进一步去除任何病毒和残留的废截留物，从而获得第二血红蛋白溶液。对所述第二血红蛋白溶液进行流通柱色谱(Flowthrough column chromatography)以去除蛋白杂质、二聚体血红蛋白和磷脂以形成无磷脂的血红蛋白溶液。 使用滤器对所述无磷脂的血红蛋白溶液进行第二超滤过程，所述滤器被配置成去除杂质， 产生浓缩纯化的无磷脂的血红蛋白溶液。
通过富马酸二 _3，5-二溴水杨酸酯(bis-3, 5-dibromosalicyl fumarate)至少交联纯化的血红蛋白的α-α亚单位从而形成热稳定的交联血红蛋白而不形成聚合血红蛋白，使得得到的非聚合的交联四聚体血红蛋白的分子量为60_70kDa。本文中使用的表达“非聚合的”是指未与其他血红蛋白分子或任何其他非血红蛋白分子诸如PEG通过分子间交联的四聚体血红蛋白。用合适的生理缓冲液诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乳酸盐林格溶液、乙酸盐林格溶液或Tris缓冲液交换交联四聚体血红蛋白。使用切向流过滤去除任何残留的化学物质。
在此步骤后，将交联血红蛋白热处理以去除任何残留的未交联的四聚体血红蛋白和任何不稳定的血红蛋白，例如，二聚体形式的血红蛋白，和任何其他蛋白杂质。在热处理之前，任选地向所述交联四聚体血红蛋白加入约0. 2%浓度的N-乙酰半胱氨酸从而防止形成高铁血红蛋白。热处理和冷却后立即加入约0. 2-0. 4%浓度的N-乙酰半胱氨酸以进一步防止高铁血红蛋白的形成。热处理优选地是在约70°C -95°C下进行30秒至3小时的短时间高温处理，然后冷却至25° C。之后将在热处理期间形成的任何沉淀物通过离心或过滤设备去除以形成澄清溶液。
然后将所述无二聚体、无磷脂、无蛋白杂质、热稳定的非聚合的交联四聚体血红蛋白加入至药学可接受的载体。
此后，将所述热稳定的交联四聚体血红蛋白配制并包装在定制的和气密的聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯、乙烯-乙烯醇(PE、EVA、EV0H)输液袋中。该包装阻止氧污染，氧污染会导致形成无活性的高铁血红蛋白。
通过上述方法制备的热稳定的交联四聚体血红蛋白用于治疗多种癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。破坏癌细胞的机制是改善了低氧条件下肿瘤的氧合，从而提高了对放射线和化疗剂的敏感性。该热稳定的交联四聚体血红蛋白也可用于在移植期间保存器官组织或用于在体内缺少供氧的情况下(诸如在缺氧心脏中) 保存心脏。


图1描绘了不同血红蛋白的氨基酸序列比对；
图2描绘了本发明的方法概述的流程图3示意性描绘了本发明的方法中使用的快速细胞裂解设备(instant cytolysis apparatus)；
图4描绘了对于(a)未经热处理的交联四聚体血红蛋白和(b)已经在90°C下经历了 45秒至2分钟的热处理或在80°C下经历了 30分钟的热处理的热稳定的交联四聚体血红蛋白的高效液相色谱分析；
图5描绘了对热稳定的交联四聚体血红蛋白的电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析；
图6显示了对(a)纯化的血红蛋白溶液和(b)热稳定的交联四聚体血红蛋白的圆二色性光谱分析；
图7显示了在正常组织中氧合的改善。注射0. 2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致(A)血浆血红蛋白浓度和(B)至肌肉的氧输送的显著增加。与血浆血红蛋白水平相比，观察到氧合显著增加持续更长的时间；
图8显示了在低氧的肿瘤组织中氧合的改善。注射0. 2g/kg热稳定的交联四聚体血红蛋白溶液导致头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)异种移植物的氧输送的显著增加；
图9显示了在㈧鼻咽癌(NPC)和⑶肝肿瘤的啮齿动物模型中部分肿瘤缩小；
图10证明了在用热稳定的交联四聚体血红蛋白治疗后，严重失血性休克的大鼠模型中的平均动脉压变化；
图11是流通柱色谱的洗脱图；血红蛋白溶液处于流过级分中；
图12示意性描绘了用于工业规模操作的具有超滤作用的流通CM柱色谱系统；
图13是用于HTST热处理加工步骤的设备的示意图14证明HTST加工设备中的温度曲线图，和在该系统中在本发明的85°C和90°C 下去除不稳定的四聚体(二聚体)所需的时间；
图15证明在图13的HTST加工设备中在85°C和90°C下该系统中高铁血红蛋白形成的速率；
图16是用于本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的输液袋的示意图17显示了概括肝切除过程中手术和血红蛋白产品施用步骤的示意图18显示了在肝切除术和缺血/再灌注操作后顶损伤组大鼠中诱发的肝内肝癌复发和转移以及远处肺转移的代表性实施例以及使用本发明的热稳定的交联四聚体血红蛋白的预防作用；以及
图19显示了在肝切除和顶损伤操作后4周时试验组和对照组中的组织学检查。

血红蛋白是哺乳动物和其他动物的血液的红细胞中含铁的氧运输蛋白。血红蛋白显示蛋白质的三级和四级结构两者的特性。血红蛋白中的大多数氨基酸形成由短的非螺旋段连接的α螺旋。氢键稳定血红蛋白内部的螺旋部分，产生其分子内的吸引力，将各个多肽链折叠成特定的形状。血红蛋白分子由四个球状蛋白亚单位组装而成。每个亚单位由排列成一组α-螺旋结构段的多肽链构成，所述α-螺旋结构段具有包埋的血红素基团的“肌红蛋白折叠”排列方式连接。
血红素基团由固定在称为卟啉的杂环中的铁原子组成。铁原子与位于一个平面中的环中心中所有4个氮原子同等地结合。然后氧能够结合于与卟啉环的平面垂直的铁中心。因此，单个血红蛋白分子具有与四个氧分子结合的能力。
在成人中，最常见类型的血红蛋白是称为血红蛋白A的四聚体，其由称为α2β2 的两个α和两个β非共价结合的亚单位组成，每个亚单位分别由141和146个氨基酸残基构成。α和β亚单位的尺寸和结构彼此非常类似。对于总分子量为约65kDa的四聚体，每个亚单位的分子量为约16kDa。四条多肽链通过盐桥、氢键和疏水相互作用彼此结合。牛血红蛋白的结构与人血红蛋白类似(α链中的同一性为90. 14% ；β链中的同一性为84. 35%)。不同之处在于牛血红蛋白中位于β Cys 93处的两个巯基，而人血红蛋白中的巯基分别位于α Cys 104、β Cys 93和^Cys 112处。图1显示分别标记为B、H、C、P和 E的牛、人、犬、猪和马血红蛋白的氨基酸序列比对。各种来源的不同氨基酸用阴影表示。图 1表明当比较其氨基酸序列时，人血红蛋白与牛、犬、猪和马具有高度的相似性。
在红细胞内部的天然存在的血红蛋白中，α链与其相应的β链的缔合非常强并且在生理条件下不会离解。然而，在红细胞外，一个α β 二聚体与另一个α β 二聚体的缔合相当弱。该结合具有分裂成两个α β 二聚体的倾向，每个二聚体为约32kDa。这些不需要的二聚体足够小从而能够被肾脏过滤和分泌，结果造成潜在的肾损伤并导致其在血管内存留时间实质性减少。
因此，从功效和安全性两方面来看，稳定在红细胞外使用的任何血红蛋白是必要的。下面概述了制备稳定的血红蛋白的方法；本发明的方法的概况呈现在图2的流程图中。
首先，选择全血来源作为来自红细胞的血红蛋白的来源。选择哺乳动物全血，包括，但不限于，人、牛、猪、马和犬全血。将红细胞与血浆分离，过滤，和洗涤以去除血浆蛋白杂质。
为了从红细胞释放血红蛋白，裂解细胞膜。尽管多种技术可以用来裂解红细胞，但本发明利用精确可控的低渗裂解技术，其规模适合于工业规模制备。为此，用来裂解红细胞的快速细胞裂解设备可见图3。低渗裂解形成裂解产物溶液，其包含血红蛋白和废截留物。 为了能够进行工业规模制备，小心地控制裂解作用使得仅红细胞被裂解却不裂解白细胞或其他细胞。在一个实施方案中，选择快速细胞裂解设备的尺寸使得红细胞在2至30秒内或足以裂解红细胞的时间内，和优选30秒内穿越该设备。所述快速细胞裂解设备包括静态混合器。去离子水和蒸馏水用作低渗溶液。当然要理解使用具有不同的盐浓度的其他低渗溶液将导致红细胞裂解的时限不同。由于可控的裂解步骤仅裂解红细胞，不破坏白细胞或细胞性物质，因此其使毒性蛋白、磷脂或DNA从白细胞的释放或其它细胞性物质的释放最小化。在30秒后，S卩，在含有红细胞的溶液已经穿越快速细胞裂解设备的静态混合器部分后， 立即加入高渗溶液。得到的血红蛋白与使用其他裂解技术得到的血红蛋白相比具有较高的纯度和较低水平的污染物诸如不合乎需要的DNA和磷脂。分别通过聚合酶链式反应(检出限=64pg)和高效液相色谱(HPLC，检出限=1 μ g/ml)方法没有在该血红蛋白溶液中检测到来自白细胞的不合乎需要的核酸和磷脂杂质。
进行两个超滤过程一个过程在流通柱色谱前去除分子量比血红蛋白大的杂质， 另一个过程在流通柱色谱后去除分子量比血红蛋白小的杂质。后一超滤过程浓缩血红蛋白。在一些实施方案中，IOOkDa滤器用于第一超滤过程，而30kDa滤器用于第二超滤过程。
流通柱色谱用来去除纯化血红蛋白溶液中的蛋白杂质诸如免疫球蛋白-G、白蛋白和碳酸酐酶。在一些实施方案中，通过使用一种市售离子交换柱或其组合来进行柱色谱，所述离子交换柱诸如DEAE柱，CM柱，羟磷灰石柱等。用于柱色谱的典型pH为6-8. 5。在一个实施方案中，使用流通CM柱色谱步骤在pH 8.0下去除蛋白杂质。进行酶联免疫吸附测定 (ELISA)以检测从柱色谱洗脱后样品中残留的蛋白杂质和磷脂。此独特的流通柱色谱分离能够实现用于工业规模制备的连续分离方案。ELISA结果显示在洗脱的血红蛋白中这些杂质的量非常低(免疫球蛋白-G 44. 3ng/ml ；白蛋白20. 37ng/ml ；碳酸酐酶:81.2 μ g/ml)。 使用不同类型的柱采用不同的PH值去除蛋白杂质的结果显示在下面的表1中。
表

本发明提供了一种高度纯化和热稳定的交联非聚合四聚体血红蛋白，其适合用于哺乳动物而不导致肾损伤和血管收缩。进行高温和短时间(HTST)热加工步骤以有效地去除不合乎需要的二聚体形式的血红蛋白、未交联的四聚体血红蛋白和血浆蛋白杂质。在热处理后和任选地在热处理前添加N-乙酰半胱氨酸保持了低水平的高铁血红蛋白。该热稳定的交联四聚体血红蛋白可以改善和延长正常和低氧组织中的氧合。在另一方面，该产品用于治疗多种类型的癌症诸如白血病、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌和食管癌。本发明的四聚体血红蛋白还可以用来预防手术切除肿瘤后的肿瘤转移和复发。此外，本发明的四聚体血红蛋白可以在化疗和放疗之前施用于患者。