专利名称：大豆脱色素和护肤组合物的制作方法对于黑素生成的化学和酶学基础的了解已有很多记载。黑素细胞从胚胎神经嵴移行进入皮肤，形成会产生黑素的分泌性颗粒黑素体。黑素生成在黑素体中发生，随后黑素通过黑素细胞树突分布到角质化形成细胞中。黑素生成中关键的酶是酪氨酸酶，它引发了将酪氨酸转变成生物聚合物(biopolimer)黑素的级联反应。已知有两个与酪氨酸酶有关的蛋白质(TRP)，TRP-1和TRP-2。这些蛋白质与酪氨酸酶有大约40％的同源性，且在黑素生成中有催化活性并起调控作用。TRP-1是黑素细胞中最丰富的糖蛋白。皮肤有颜色已经成为人们多年所关注的问题。希望有均一肤色的人通常对除去色素沉着过度(如在老年斑、雀斑或老化的皮肤中所见的)的能力感兴趣。在世界上的某些地区，人们希望身体全面变白。已有许多方法被建议用来实现脱色素。例如，曲酸、氢醌、类视黄醇和其它化学化合物已被用于脱色素。已经发现前述这些方案中有许多并不能被接受。在已经施加前述这些组合物的皮肤区域之间通常有明显的界限。因此，为了获得所需的结果，所有这些化合物都需要精确地使用。还发现这些化合物中有许多对皮肤有很大的刺激性，因此不宜使用。炎症后色素沉着过度是一个常见的问题，其表现为各种皮肤病和治疗性干扰。然而，对于个体产生炎症后色素沉着过度表现出的差异性和潜在的机理还不十分了解。脉冲激光治疗对于化合物、真皮内或炎症后色素沉着过度并不有效，而且也不总是负担得起。在治疗后通常使用氢醌和广谱防晒霜，但是它们不能完全防止或消除色素沉着过度的病灶。因此，迫切需要一种安全、有效且可负担得起的治疗炎症后色素沉着过度的方法。更加希望将这种治疗方法加入日用皮肤护理产品中，从而使皮肤更健康，看上去更漂亮。皮肤老化是一种复杂的现象，由几个内在和外在因素相互作用造成。与老化有关的皮肤变化通常表明化妆品没有能力。由于心理上的影响，皮肤老化已经成为社会普遍关注的话题和问题。随着生育高峰时期出生的人的老化，化妆品护理、化妆品保养和恢复年轻的时代意识有所提高。预防和治疗皮肤老化的方法是迫切需要的。内在的老化是不可避免的受遗传上控制的过程。而在外在影响(风、热、香烟、化物物质等)中，紫外辐射是与皮肤老化有关的最重要的因素。持续接触紫外辐射(UVR)会引起光老化。在最近10年，接触日光的娱乐活动(包括过量的日光浴)、平流层臭氧的消耗以及在治疗各种皮肤疾病时使用UVR使得光老化变得流行。光致损伤可通过避免日光以及适当的日光防护来预防，并能通过使用其刺激性的昂贵的外用类视黄醇来逆转。过多接触紫外光和可见光辐射也引起晒伤。用阿斯匹林和其它非类固醇抗炎药、凉水澡和外用类固醇只能提供轻微的缓解作用。希望有一种外用治疗方法能预防或逆转皮肤老化，并预防或缓解晒伤。更希望有一种能负担得起的每日皮肤护理外用治疗，它能提供没有刺激性或副作用的效果，并且还提供所需的均匀的皮肤肤色，使皮肤组织平滑、颜色均匀，使皮肤结实并有更健康、更年轻的外表。痤疮是一种炎性皮肤病，它通常发生于青春期，在老年人中也有一定规律。痤疮病况包括从皮脂腺毛囊中的粉刺到更为严重的多发的(como)炎性症状如脓疱、丘疹、囊肿和结节的皮肤病灶。该病况不仅使受害人感到不舒适，而且也使人感到困窘，并会引起使人变丑并留下疤痕。过去已经尝试用许多不同的方法来改善该疾病，其中一些治疗较为有效。已经采用从简单洗涤和清洗到药物的治疗。希望有一种药物治疗能预防或逆转痤疮而不需要药物处方。更希望有一种能负担得起的每日皮肤护理外用治疗，它能提供没有刺激性或副作用的效果，并且还提供所需的均匀的皮肤肤色，使皮肤组织平滑、颜色均匀，使皮肤结实并有更健康、更年轻的外表。
大腿和臀部皮肤有凹陷的现象通常称为脂肪团(cellulite)，它对女人的影响比男性更频繁。脂肪团的基础病理学还未清楚确定。理论上讲，脂肪团能反映受影响和未受影响的个体或个体的各区域之间在脂肪组织生物化学或结缔组织结构中的差别。没有证据表明脂肪组织生理学、血流或生物化学在脂肪团病因中起主要作用，但是女性大腿的结缔组织的结构加强了小的皮下贮存脂肪组织的差别。治愈脂肪团的产品(如Cellasene)已在全世界出售，但是它们的效果值得怀疑。治疗脂肪团的方法，如固体探针超声辅助脂肪成形技术或注射脂肪重塑术(liposculpture)可使身体具有一定轮廓，但是该方法很痛苦且昂贵，需要反复治疗。希望有一种能负担得起的局部治疗方法，它能预防或逆转脂肪团，使皮肤结实，使皮肤看上去更健康、更年轻，并提供没有刺激性或不良副作用的每日皮肤护理。
在我们以前提交的PCT专利申请WO99/04752中，描述了使用未经巴氏杀菌的从大豆衍生的提取物用于使皮肤脱色。我们现在已经发现新的稳定的美容效果很好的含有该大豆产品的组合物，该组合物含有低于0.1％的表面活性剂，具有很高的皮肤脱色活性，且生产成本很低。我们意外发现这种含大豆的组合物具有抗老化活性，它们能很好地增加皮肤弹性和结实性，可用于预防和治疗日光引起的损伤和痤疮。
发明概述本发明的特征在于一种用于局部输送大豆产品(例如给诸如人的哺乳动物)的护肤组合物，该组合物包含大豆产品(如未变性的豆浆或粉末)和稳定化系统，该稳定化系统包含选自抗氧化剂、螯合剂或防腐剂的一个或多个成员。较佳的，本发明组合物不含超过约0.1％的表面活性剂。本发明一方面的特征在于组合物包含一种或多种其它与皮肤有关的活性剂，例如但不局限于，脱色素剂、增稠剂、润肤剂、抗氧化剂或防晒剂。
本发明另一特征在于一种使哺乳动物皮肤脱色的方法，所述方法包括将上述组合物施加到皮肤上的步骤。
本发明还描述了一种增强皮肤护理的方法。我们意外发现，施加豆浆或大豆衍生的组合物可增加皮肤的结实性和弹性，使皮肤颜色和组织变均匀，减少皮肤老化，并可用于预防和治疗日光引起的损伤和痤疮。本发明提供了用于皮肤护理的大豆衍生的组合物的例子。
本发明的其它特征和优点可从本发明详述部分以及权利要求明显看出。
附图简述

图1显示了三个图，表明豆浆能抑制胰蛋白酶、抑制PAR-2裂解，并抑制角质形成细胞吞噬作用。
图2显示了经大豆制剂处理并染色以表明色素沉着的猪皮肤组织学切片。
图3显示了经豆浆和DHLA制剂处理的黑色皮肤的猪的侧面。
图4显示了经豆浆处理并染色以表明弹性蛋白纤维的小鼠皮肤的组织学切片。
图5显示了在用豆浆处理其一半脸部后过量暴露于日光下的个体图片。
图6显示了在用豆浆处理其一半脸部后过量暴露于日光下的个体皮肤的放大图片。
图7以图表形式显示了致痤疮和刺激研究的结果。
图8显示了用STI(大豆胰蛋白酶抑制剂)探测大豆制剂的Western印迹。
较佳实施方案详述相信本领域技术人员能根据本文的描述完全使用本发明。下列具体实施方案仅仅被理解成起说明作用，而并不以任何方式限制其它的公开内容。除非另有定义，本文所有的技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常了解的意思相同。另外，本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均纳入本文作为参考。
本发明的新的组合物含有豆科植物产品，较佳的是大豆产品，它可以是液体形式(如豆浆)或固体形式(如豆粉或豆浆粉)。“大豆产品”指从大豆衍生获得的物质，它含有大豆中天然发现的组分，它们的相对浓度与豆中所见浓度相当。在一个实施方案中，大豆产品是未变性的大豆产品。“变性”在Bantam医学字典(1990版)中定义为“由于热、X射线或化学物质引起的蛋白质物理和生理性质变化。这些变化包括丧失活性(就酶而言)和丧失(或改变)抗原性(就抗原而言)”。“未变性大豆产物”指对这些大豆产品进行衍生处理加工(例如温度，萃取介质)没有除去产品的蛋白酶抑制活性的大豆产品。在一个方案中，本发明大豆产品的未变性状态可通过完整的大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)蛋白来测定。
在另一实施方案中，大豆产品是豆浆。制备豆浆的一种方法是将大豆浸泡在去离子水或纯化水中数小时，在大豆完全水化后，加入少量水将大豆研碎。(研磨方法使豆浆被提取出来)。收集后，可对大豆浆进行过滤，除去任何残余部分的外皮。用于本发明的豆浆可以是上述的新鲜豆浆，或可从大豆粉和水制得。大豆粉从大豆研磨制得，并且还可经过冻干、喷雾干燥或冷冻干燥，得到的豆浆可以或无需进行过滤。如此制得的豆浆具有大约1-90％重量的干大豆粉。另一个例子是用豆浆粉，它从冻干的、喷雾干燥或冷冻干燥的豆浆制得，加入水后经或不经过滤或匀浆而制得豆浆。
其它提取大豆的方法也可用来获得用于本发明的活性组分。例如，但不局限于，可用乙醇/水混合物从研碎的大豆中提取出活性组分，然后除去提取物中的乙醇，这样就能保留大豆中的蛋白酶抑制活性。
本发明的组合物可含有大约1％-99％重量的大豆产品。例如，当采用液体大豆产品(如豆浆)时，组合物可含有大约50％-99％重量(例如大约70-99％)的液体大豆产品。例如，当采用固体大豆产品(如大豆粉或豆浆粉)时，组合物可含有大约1％-50％重量(例如大约2％-30％重量)的固体大豆产品。含有固体大豆产品的组合物还可包含水(如蒸馏水或豆浆中所含的水)，以形成组合物的液体基质(例如形成软膏、洗液、可注射溶液或凝胶)。这些组合物可包含大约50％-98％重量(例如70％-98％重量)的水。本发明组合物可通过局部输送、口服或肠胃外给药，但本发明不局限于这些给药方法。
用于本发明的大豆产品可从所有的大豆种类制得，而不论其地理起源、是否接触日光、收获时间等。然而，特定的株系、地理起源或生长条件可能是较佳的。例如，但不局限于，胰蛋白酶抑制剂(如STI，LTI，BBI)含量特别丰富的大豆株系或其它豆类植物株系或是使豆中产生丰富胰蛋白酶抑制剂的生长条件可能是较佳的。应注意，用于本发明组合物的豆科植物产品具有独特的气味，它们可被某些人忍受，但是对于其它人可能是不希望的。如果需要，可通过使用从已知产生气味较少的特定大豆株系衍生得到的大豆产品来减少本发明组合物的气味，这些株系例如是，但不局限于，脂氧合酶-2-缺陷型大豆以及糖的特点有所改进的那些豆等。减少制剂中氧含量的处理可能也会减少气味。还可用各种掩蔽剂或芳香剂来掩蔽该气味。
在一个实施方案中，本发明的组合物含有一种或多种防腐剂。由于本发明组合物是未变性的(例如组合物中保留了蛋白酶抑制活性)，因此它们可能更适合作为微生物生长的培养基。防腐剂可用于基本上防止微生物分解。防腐剂的例子包括苯氧基乙醇和羟苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。其它防腐剂例子列于Wenninger和McEwen编辑的《国际美容组分字典和手册》(CTFA，第7版，1997年)(下文称为《美容学手册》)中1654-55页。组合物可包含大约0.01％-20％重量(更佳的约0.5％-5％重量)的防腐剂。还可通过γ射线或微孔过滤，或是不除去蛋白酶抑制活性的简单加热处理来消除微生物污染。
组合物中还可使用抗氧化剂和/或螯合剂，以增加组合物的使用寿命和稳定性。加入抗氧化剂不仅可使制剂稳定，还可起生物学效果。抗氧化剂化合物及其衍生物包括，但不局限于，水溶性抗氧化剂，如巯基化合物及其衍生物(如偏亚硫酸氢钠和N-乙酰基-半胱氨酸)、硫辛酸和二氢硫辛酸、白藜芦醇、乙酰-半胱氨酸(Iniferine?)或乳铁传递蛋白，以及抗坏血酸和抗坏血酸衍生物(如棕榈酸抗坏血酸酯和抗坏血酸多肽)。适用于本发明组合物的油溶性抗氧化剂包括，但不局限于，丁基化羟基甲苯、类视黄醇(如视黄醇和棕榈酸视黄酯)、生育酚(如乙酸生育酚)、生育三烯酚和泛醌。适用于本发明组合物的含有抗氧化剂的天然提取物包括，但不局限于，含有类黄酮和类异黄酮及其衍生物的提取物(如染料木黄酮和diadzein)、含有白藜芦醇的提取物等。这些天然提取物的例子包括葡萄籽、绿茶、松树皮、蜂胶和荚果提取物。抗氧化剂的其它例子可在《美容学手册》第1612-13页找到。本发明组合物可包含占组合物大约0.001％-20％重量(例如约0.01％-10％重量)的抗氧化剂。
螯合剂也可有助于本发明组合物的稳定。螯合剂的例子包括EDTA及其衍生物(如EDTA二钠和EDTA二钾)、Iniferine?、乳铁传递蛋白和柠檬酸。螯合剂的其它例子列于《美容学手册》第1626页。本发明组合物可包含占组合物大约0.001％-20％重量(例如约0.01％-10％重量)的螯合剂。
增稠剂(如增稠剂或增加粘度剂)也可用于本发明组合物，以改变其粘度。组合物所需粘度将取决于用途(例如作为沐浴产品、乳膏、洗液或凝胶)。例如，在作为沐浴或洗涤产品的应用中，组合物的粘度应相对较低，与水溶液相似。作为乳膏、洗液或凝胶的应用将有稍高的粘度(例如在大约100cps-100000cps之间)。
可加入本发明组合物以改变粘度的增稠剂包括聚合物诸如聚丙烯酸酯(如聚丙烯酰胺)。改变粘度的试剂的其它例子列于《美容学手册》第1692-97页。为了获得合适的粘度，本发明组合物可包含大约0.01％-20％重量(例如约0.1％-5％重量)的增稠剂。
本发明组合物还可含有除大豆产品外的其它脱色素剂。这些脱色素剂例如包括，但不局限于，硫辛酸、二氢硫辛酸、白藜芦醇、抗坏血酸、曲酸、氢醌、异黄酮、类视黄醇(如视黄醇、视黄酸和棕榈酸视黄酯)、酪氨酸酶抑制剂、黑素体转移抑制剂和黑素细胞选择性细胞毒性剂，或含有这些活性的天然提取物。脱色素剂的用量将取决于化合物的活性，通常在组合物的大约0.001％-20％重量(例如0.01％-10％重量)范围内。
本发明组合物还可含有增强组合物在使用者皮肤上触感的化合物。这些化合物例如包括，但不局限于，油、聚硅氧烷(例如硅氧烷聚合物如聚二甲硅氧烷)和皮肤调节剂如润滑剂和润湿剂。这些皮肤调节剂的例子可在《美容学手册》第1656-1670页中找到。
本发明组合物还可有利地含有其它抵御脂肪团的试剂，包括但不局限于，咖啡因、视黄醇和其它类视黄醇等。当然，本发明组合物中还可加入其它对皮肤有活性作用的外用药物并用于本发明方法，这些外用制剂包括抗炎剂如皮质类固醇、抗痒剂、外用镇痛药、消除痤疮的药物如过氧化苯甲酰和β-羟基酸如水杨酸、抗老化剂包括类视黄醇、视黄醇、α-羟基酸、辅酶Q及其它，抗生素和抗真菌剂以及光泽控制产品(包括咪康唑、酮康唑、伊鲁拜尔(elubiol)、伊曲康唑(itraconazole)等)以及本领域普通技术人员已知的其它制剂。
本发明组合物可通过混合所需组分来制得。例如，使豆浆与螯合剂、防腐剂和/或抗氧化剂混合。然后，在该体系内加入增稠剂，进一步混合该混合物，直至它在所需粘度下达到均一。本发明组合物可在氩气或氮气(或其它惰性气体)覆盖层下制得，以增强制剂的稳定性和/或减少大豆气味。本发明组合物可包装入管、密封包装、广口瓶、泵、瓶、罐、药棉拭子、毛巾、手帕等中。还可用密封的包装如铝管、铝袋、泵、层压管来提高产品稳定性。
本发明组合物可用来使哺乳动物(如人)皮肤脱色。“脱色”是指皮肤区域颜色变浅，包括但不局限于使使用者的肤色/面色整个变浅(例如，脸部、手、或整个身体，因皮肤老化而变得不均匀，或因为人种或病理学等原因比所需要的暗)，使皮肤颜色变得均匀，或使老年斑、雀斑或较深的色素沉着区域(例如但不局限于炎症后色素沉着过度的病灶)变得特别浅。
我们意外发现，本发明组合物可用来治疗人皮肤而使皮肤油性和光泽减少。本发明组合物包括，但不局限于，含有大豆的组合物，当它外用于皮肤上(包括用作沐浴添加剂或在手帕中)时，它具有蛋白酶抑制活性，能减少面部皮肤油性和发光的外观。在一个较佳的实施方案中，只要使用者要获得所需的效果，可以每日给予该组合物至少一次。
本发明组合物还可用来防止或治疗痤疮病况。本发明组合物宜每日两次使用一段时间(较佳的至少约45天)，以改善皮肤外表，减缓该症状。然而，认为施加该组合物至少2-4周就可缓解或预防该病况，这取决于个体的皮脂腺活性。
在另一个实施方案中，我们发现大豆产品，例如(但不局限于)具有蛋白酶抑制活性的本发明组合物，当其外用施加到皮肤上(包括用作沐浴添加剂或在贴剂中)时，它有助于对使用者产生镇静、凉爽和/或松弛效果，并使皮肤有美学上愉悦的感觉。该组合物的给予量和给予频率取决于组合物中大豆制剂(如豆浆)的浓度、待治疗皮肤区域的状况以及所需的效果，因此，最终由该组合物的使用者来决定。在一个实施方案中，只要使用者需要获得所需效果，组合物可每日给予至少一次。
另外，我们意外地发现，在过度接触日光后用豆浆处理人皮肤能缓解与晒伤有关的疼痛和灼烧的感觉，减少皮肤起鳞程度。本发明提供在晒伤或过度接触日光后产生镇静、凉爽和减少疼痛效果的方法。该方法包括用具有蛋白酶抑制活性的含豆浆组合物每日局部处理至少一次(只要使用者想要获得所需效果)。
在另一个实施方案中，我们意外发现，用豆浆预先处理人皮肤(例如局部处理，用作沐浴添加剂)能防止日光引起的损伤。在经过豆浆处理后，过度接触日光的皮肤不会象同一个体未经处理的皮肤那样出现发红、起鳞、干燥和疼痛。本发明提供了一种防止过度接触日光后皮肤起鳞、发红和疼痛的方法。该方法包括用具有蛋白酶抑制活性的含豆浆组合物每日局部处理至少一次(只要使用者想要获得所需效果)。
因此，豆浆及其衍生物能提供护理皮肤的性能(包括弹性)，防止皮肤在过度接触日光、晒伤后起鳞/发红/疼痛，提供清凉的感觉、用于沐浴、脱色素、使皮肤颜色和组织变得均匀，治疗炎症后色素沉着过度、痤疮和脂肪团。
如本文实施例所证实的，我们已经意外发现，局部使用豆浆使得经处理的皮肤弹性有所提高。因此，适当地局部使用含有蛋白酶抑制活性的豆科植物提取物(尤其是豆浆和大豆制剂)，可通过影响弹性蛋白和胶原纤维以及皮肤弹性来增加皮肤弹性和结实性。我们意外发现，外部施加具有蛋白酶抑制活性的大豆产品(包括但不局限于本发明组合物以及我们以前的发明(PCT专利申请WO99/04752)的组合物)，可使皮肤变得结实，增加皮肤弹性和抗老化效果，产生美学上愉悦的皮肤感觉。本发明提供了一种增加皮肤结实性和皮肤弹性、减少皮肤老化征兆的方法，该方法可用于整个身体部位，较佳的适用于脸部、上半身以及大腿和臀部皮肤。该方法包括用具有蛋白酶抑制活性的含豆浆组合物每日局部处理至少一次(只要使用者想要获得所需效果)。
下列实施例描述了本发明组合物的几个实施方案。它们不应被用来以任何方式限制或缩小本发明的范围。
实施例1从大豆粉制备豆浆将160克大豆粉(Sunlight Foods，Taipei，Taiwan)加入大约1440克去离子水中。在室温下搅拌该混合物大约1小时。然后使该混合物滤过孔径为75微米的筛网。滤液得到大约1.1千克豆浆。
实施例2从豆浆制备豆浆凝胶如下制得本发明的下列组合物。组合物中每一组分的重量百分数如下表1和2中所示。首先，将如实施例1制得的豆浆放入第一个烧杯中。将防腐剂Phenonip?(防腐剂对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸乙酯和苯氧基乙醇的混合物，NIPA Wilmington，Delaware出售)或防腐剂苯氧基乙醇加入豆浆中。然后，在第一个烧杯中加入螯合剂EDTA二钠(在一些实施例中还加入润湿剂甘油)，并与豆浆混合。如表1和表2所示，在一些实施例中，该步骤还需要将环甲基硅酮(cyclomethicone)、聚二甲基硅氧烷(dimethicone)(商品名Dow Corning 200 Fluid?)或PolySorbate 20或淀粉琥珀酸辛酯铝或蔗糖可可酯(cocoate)或PEG-6癸酸/辛酸三甘油酯进一步加入豆浆混合物中。将增稠剂聚丙烯酰胺、laureth-7和C13-14异链烷烃(Seppic，Paris，France，以商品名Sepigel?出售)的混合物和抗氧化剂BHT一起加入第二烧杯中。然后将第二个烧杯中的组分加入第一个烧杯的组分中，混合直至均匀。然后将抗氧化剂抗坏血酸、抗坏血酸磷酸钠、乳铁传递蛋白或生育酚加入烧杯中，混合均匀，形成所得凝胶。
实施例3从大豆粉、豆浆粉或大豆提取物制备豆浆凝胶如下制得下列本发明组合物。每一制备物中的每一组分的重量百分数显示在下表2中。首先，将豆浆粉(Devansoy Farms，Carroll，IA)或大豆粉(Sunlight Foods，Taipei，Taiwan)或大豆提取物和去离子水放入第一个烧杯中，混合重建大豆粉。然后将防腐剂Phenonip?和螯合剂EDTA二钠加入第一个烧杯中，与豆浆混合。在第二个烧杯中加入聚丙烯酰胺、laureth-7和C13-14异链烷烃的混合物以及抗氧化剂BHT。然后将第二个烧杯中的组分加入第一个烧杯的组分中，混合直至均匀。
表1
表2
实施例4豆浆抑制PAR-2途径我们的专利申请WO99/04752描述了PAR-2途径在色素沉着中的重要性，并表明大豆衍生的蛋白酶抑制剂STI抑制了该途径并引起脱色素。我们的专利申请WO99/30729进一步描述了PAR-2在诱导角质形成细胞吞噬作用中的作用及其对于黑素体转移和色素沉着的影响。为了测试豆浆通过抑制PAR-2诱导的吞噬作用来引起脱色素的可能性，进行如下实验。首先，通过以依赖于剂量的方式抑制胰蛋白酶诱导的发光的酪蛋白肽裂解(图1a)，表明STI和豆浆起丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用。用EnzChekTM蛋白酶试验试剂盒按照生产商说明书(Molecular Probes)测定总蛋白酶活性。将STI和豆浆稀释在PBS(Life Technologies)中，用配制在PBS中的1000单位胰蛋白酶1∶1(v/v)保温。在和BODIPY发光的酪蛋白底物于室温下保温1小时后，在SpectraMax? Gemini微量滴定板读数仪(Molecular Devices Corporation)上用Softmax?Pro3.0软件(Molecular Devices Corporation)测定荧光(激发505/发射515)。每个实验一式六份，重复三次。用Microsoft Excel计算STI和豆浆抑制胰蛋白酶裂解(cleavage)底物的百分数，并用Sigma Plot绘图。如图1a所示，豆浆能以剂量反应方式抑制胰蛋白酶诱导的裂解。
在第二个实验中，设计类似的试验来测定豆浆特异性抑制PAR-2裂解的可能性。在该试验中，用含有人PAR-2切割位点的合成的荧光肽SKGRSLIGK(类似的试验在Lourbakos A，Chinni C，Thompson P，Potempa J，Travis J，Mackie EJ，Pike RN“牙龈卟啉单胞菌的牙龈疼痛素(gingipain)-R切割并激活人中性粒细胞上的蛋白酶激活受体-2”，FEBS Lett 4351，45-8，1998年9月11日中有描述)代替酪蛋白肽作为胰蛋白酶底物。该肽用荧光团对Edans/Dabsyl(Advanced Bioconcept，Montreal，Canada)标记，并用作PAR-2丝氨酸蛋白酶激活剂的底物。该肽被PAR-2激活剂(如胰蛋白酶)切割可通过荧光(激发335/发射515)来检测。使100微摩尔肽与10单位胰蛋白酶(在100mM三[羟甲基]氨基甲烷缓冲液中，pH8.0，Digene，Beltsville，MD)加或不加试验物于室温下避光培育1小时，测定STI或豆浆对胰蛋白酶诱导的PAR-2肽裂解的抑制。用Softmax?Pro3.0软件(Molecular Devices Corporation)在SpectraMax? Gemini微量滴定板读数仪(Molecular Devices Corporation)上测定荧光。每个实验一式六份，重复三次。用Microsoft Excel计算胰蛋白酶切割受抑制的百分数，并用Sigma Plot绘图。如图1b所示，该PAR-2肽被胰蛋白酶切割被存在的STI完全抑制。豆浆保留了抑制该胰蛋白酶诱导PAR-2切割的能力(图2b)，表明与STI类似，大豆提取物能抑制PAR-2的激活作用。
为了测定豆浆抑制PAR-2诱导的角质形成细胞吞噬作用的可能性，我们采用VybrantTM吞噬试验(Molecular Probes)。用SLIGRL(PAR-2激活肽)处理HaCaT角质形成细胞，增加STI或豆浆的浓度24小时，然后与100微升荧光素标记的大肠杆菌K-12生物颗粒培育4小时。在用台盼蓝淬灭非内化的荧光后，用SpectraMax? Gemini微量滴定板读数仪(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)测定(485纳米激发/538纳米发射)表示被摄入的大肠杆菌颗粒的胞内荧光。用Softmax? Pro3.0软件(Molecular Devices Corporation)收集数据，用SigmaPlot?5.0(SPSS Science，Chicago，IL)和SigmaStat?2.0(SPSS Science)软件分析。每个试验一式六份，重复至少三次。如图1c所示，SLIGRL增加了角质形成细胞的吞噬，STI以剂量依赖方式阻止了这种增加。令人感兴趣的是，新鲜制得的豆浆抑制角质形成细胞由SLIGRL诱导的吞噬具有类似的程度。这三个实验表明，豆浆含有抑制PAR-2激活(抑制激活作用导致角质形成细胞吞噬减少)的蛋白酶抑制活性。该结果提示，大豆产品的脱色素活性部分是由于其抑制PAR-2的活性。
实施例5新的豆浆制剂的脱色素活性非常好我们的专利申请WO99/04752记载了豆浆的脱色素活性以及含豆浆配方可用于脱色素。该配方的一个例子是上表1所述的大豆精华1。本发明描述了包含大豆产品和稳定化系统、但表面活性剂不超过0.1％的脱色素组合物。该配方的一个例子是上表1所述的大豆精华23。为了证明大豆精华23的脱色素活性比精华1好，进行下列实验。
用大小合适的笼子在环境控制的房间内喂养黑色皮肤尤卡坦微型猪(Yucatanmicroswine，Charles River，Maine)，采用12小时光照12小时黑暗的光周期，任意提供食物和水。动物护理根据的是“实验室动物护理和使用指南”，NIH出版物第85-23号。在猪背部局部施加20微升测试化合物，每日两次，每周5日，共8或9周。单个猪的处理总是在一侧从头到尾，在动物另一侧按照从尾到头的次序进行。用标准技术取生物活检物。所有猪研究显示没有病毒刺激，组织学分析揭示没有刺激标记或其它病理学征兆。
用Fontana-Mason(F&M)通过标准程序(Sheenan和Hrapckak，1980)对活检物切片染色。F&M染色鉴定硝酸银还原性分子。在皮肤中，该非特异性的染色主要鉴定黑色素。每个活检物至少加工出三个切片。每个实验重复至少三次。
图2显示了两个这样的实验的组织学切片。切片用F&M染色，以标记出经处理部位的黑色素沉积位置。上方的图显示了一头猪的对照(a)以及大豆精华23(b)处理过的部位。下方的图显示了另一头猪的对照(c)和大豆精华1(d)处理过的部位。从该图明显可见，大豆精华23产生色素沉积减少的相对值和绝对值都比大豆精华1的水平高。
实施例6豆浆的脱色素活性在与抗氧化剂结合时得到增强我们的专利申请WO99/04752记载了豆浆有脱色素活性。如我们在本文中所表明的，该脱色素活性部分是由于对PAR-2诱导的角质形成细胞吞噬作用的抑制。为了测试通过将多种导致脱色素的机理组合可改善脱色素的假设，我们测试了豆浆和抗氧化剂组合物的脱色素效果。
用豆浆或豆浆精华配方、1％二氢硫辛酸(DHLA)和1％白藜芦醇(Res)对猪每日处理两次，或用每日一次豆浆和每日一次DHLA或Res的组合处理。处理7或8周后，肉眼观察皮肤变浅。该实验例子显示在图3中，该图显示了经豆浆精华和DHLA组合处理8周后的黑皮猪的侧面。左侧部位(1)经上述豆浆配方豆浆精华23处理。右侧部位(3)经DHLA处理。中间部位(2)经豆浆精华23和DHLA处理。该图显然表明，在豆浆精华23和DHLA组合处理后，脱色素效果比单用各组分有所提高。用豆浆或豆浆精华与DHLA或Res组合获得的了类似的结果。本实施例清楚地证实，不同机理的添加剂能提高豆浆的脱色素效果。
实施例7豆浆影响皮肤弹性在如我们的申请JBP-430、JBP-464和JBP-467所述进行豆浆研究时，我们意外注意到在触诊时经豆浆处理小鼠的皮肤更有弹性。为了测试豆浆对皮肤弹性有积极效果的可能性，我们进行了两组实验非侵入性弹性测定(角质计(cutometer)测定)和对皮肤切片作弹性蛋白纤维进行染色。这些研究表明，豆浆处理增加了皮肤中的弹性蛋白纤维，经处理的皮肤的弹性有所提高。
如我们的申请JBP-430、JBP-464和JBP-467所述，诱导C3H和C57B1/6小鼠进入新的毛周期或刮去毛。如上述申请所述，每日用豆浆处理小鼠。在实验开始时(第1天，第一次处理前)和第21天，进行角质计测定，以测定皮肤弹性。我们采用购自Academ(Menlo Park，California)的角质计，并采用Couturaud等人，“皮肤的生物力学性质用非侵入性方法体内评价年龄和身体部位的影响”，1 Skin Res.and Technol.68-73(1995)和Elsner等人，＂人前臂和外阴皮肤的力学性质＂，122 Br.J.Dermatol.607-614(1990)中所述的方法，这两份文献全部纳入本文作为参考。通过2毫米的孔施加抽吸，测定相应的位移和在负压释放后皮肤恢复。在人研究中，变形参数Ua/Uf(皮肤疲劳或负载后的总体恢复)、Ur/Uf(生物学弹性，或负载后的弹性恢复)和Ur/Ue(结实性，或皮肤耐变形能力的改善)比值的改善表明皮肤有更好的紧张性和弹性。变形参数Ue，Uf，Ua和Ur部分取决于皮肤厚度。随后，如Barel等人，＂皮肤力学性质的抽吸测定方法角质计＂，Handbook of Non-Invasive Methods and the Skin335-340(1995)(纳入本文作为参考)，用这些比例来进行评价。
这样的实验的一个例子显示在表3中，该表证明豆浆处理增加了这些参数，从而反映了有所改善的皮肤弹性。尽管动物之间有明显差异，但是角质计性质增加是一致的，这反映出豆浆对皮肤弹性的有益效果。
表3经刮毛、豆浆处理的C3H小鼠皮肤的力学性质生物物理参数 第1天第21天未处理对照 经豆浆处理未处理对照 经豆浆处理Ua/Uf 0.860±0.066 0.815±0.154 0.839±0.0680.904±0.043Ur/Ue 0.943±0.172 0.964±0.103 0.617±0.1511.402±0.846Ur/Uf 0.720±0.115 0.677±0.168 0.506±0.1360.787±0.067为了进一步研究该弹性效果，取出整个实验中的皮肤活检物，切片根据Kligman，L.H.，＂Luna的技术，弹性蛋白的鲜艳染色＂3(2)The Amer.J.Of Dermatopathol.199-200(1981)(全部纳入本文作为参考)进行弹性蛋白染色。
如图4所示，与未经处理的对照(左侧图)相比，经豆浆处理的C3H小鼠(右侧图)的皮肤附件和上层真皮周围的弹性蛋白纤维(染成深蓝-紫色)的厚度和密度有所增加。这种增加早在处理后第四天就能检测到，并且在整个研究中保持一致。用C5781/6小鼠也获得了相同的结果。本实施例证明，用豆浆和豆浆配方进行皮肤护理能增加皮肤弹性，减少皮肤老化。
在另一实验中，在体外研究大豆粉对胶原合成的影响。通过在处理3天后评价放射活性脯氨酸掺入胞外胶原，估计大豆粉增加正常人真皮成纤维细胞中胶原合成速度的效果。如表4所示，1微克/毫升的大豆粉可使正常人真皮成纤维细胞中胶原合成的速度增加58％。在较低的浓度下，大豆粉未见有明显的刺激作用。因此皮肤表现出更结实、更完整、更年轻。
表4大豆粉对正常人真皮成纤维细胞中胞外胶原合成的影响
NS不显著实施例8豆浆防止日光诱导产生的损伤一个人每日一次在刮脸后立即用含有豆浆的本发明组合物处理其右半边脸部。豆浆处理8周后，让该个体在娱乐活动期间过度暴露于日光下，且不用防晒剂。个体的皮肤表现出“日光晒伤”的症状他的脸部变红，变疼痛，在接触日光后第二和第三天起鳞。出人意料的是，经本发明豆浆组合物预处理的右半边脸不发红、不疼痛或起鳞。图5显示了该个体脸部的两个侧面。从该图中明显可以看出皮肤发红以及日光伤害程度的不同。图6显示了个体皮肤的Hi-scope图，表明未经处理侧起鳞而经处理侧光滑。本实施例证明，经常使用本发明的豆浆组合物能防止皮肤受意外强烈日光的照射，并减少与“日光晒伤”有关的发红、起鳞和疼痛。
实施例9豆浆能治疗日光引起的伤害实施例7中的个体在接触目光后24和48小时在未经处理侧的一部分使用豆浆组合物。接触日光后施加豆浆的目的不仅是使受伤皮肤润湿。发现它能产生清凉和镇静的感觉，能减轻过度暴露于日光所引起的疼痛，并减少发红和起鳞，留下“新鲜的”感觉。本实施例证明，局部施用豆浆或豆浆配方能缓解疼痛，减少因过度接触日光而引起的发红和起鳞。在接触日光的皮肤上使用豆浆能产生清凉和凉爽的感觉。
实施例10含有大豆的组合物能减少痤疮病灶进行临床研究，以研究施加含大豆组合物每日两次共45天对于有轻微痤疮(即在研究开始时有10个以上非炎性和炎性病灶)的对象以及没有痤疮的对象的效果。评价痤疮病灶数，进行红斑估计和照相估计。对两组对象施加含有0.005％异黄酮的大豆精华23。
在轻微痤疮对象中，炎性丘疹数(p＝0.001)从基线极明显减少，减少41.9％。另外还有红斑从基线减少的趋势(p＝0.063)。在无痤疮对象中，黑头粉刺、丘疹或脓疱没有显著增加。在图7中用图说明了丘疹数的减少。
实施例11含豆浆的本发明组合物含有完整的STI本发明的含豆浆组合物是非变性的，具有蛋白酶抑制活性。这些组合物是独特的，因为它们含有完整的蛋白质，特别是完整的STI(一种丝氨酸蛋白酶抑制剂)。为了证明这一独特之处，用Western印迹方法，根据Bonifacino J.S.(编辑)(1999).Immunofluoresence Staining.Current Protocoles in Cell Biology on CD-ROM，John Wiley& Sons，Inc.(Teton Data System，Jackson，WY)所述，比较等体积的上述实施例3中的精华23与市售的大豆基产物(Helena Rubinstein′s Future White Essence，其组分称为“大豆蛋白”)的STI含量。将样品裂解在PBS中的RIPA缓冲液[1％Nonidet P40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠和CompleteTM蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)]中。使RIPA裂解液(10微克/泳道)在10％SDS-PAGE凝胶上电泳，用增强的化学发光(ECL)Western印迹(Amersham，Arlington Heights，IL)分析蛋白质。抗STI抗体购自Chemicon，经1∶500稀释使用。
如图8所示，我们的大豆配方精华23含有完整的STI，它大小与STI标记(在平行的泳道中电泳)相同。相反，精华23的安慰剂和市售的大豆基产品均不含完整的STI。
应当理解，尽管本发明结合详细描述作了说明，但前述内容只是为了进行描述，而并未限制由所附权利要求确定的本发明范围。其它方面、优点和改进均包括在权利要求范围内。


本发明涉及一种用于局部输送大豆产品的护肤组合物,它包含非变性的大豆产品以及稳定化系统,所述稳定化系统包含选自抗氧化剂、螯合剂或防腐剂的成员。本发明还涉及用本发明的护肤组合物来治疗皮肤病情以及改善皮肤外表和感觉的方法。