专利名称:一种检测dmd基因外显子缺失和/或重复的方法DMD基因是迄今为止发现的最大的人基因,该基因有时会发生突变,例如新生男婴中1 3500出现该基因的突变。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生缺失,涉及基因近端和中部两个热点区域(外显子3-7和外显子44-5 。DMD基因内一个或多个外显子的大片段会发生重复,约占DMD突变的6%。DMD基因发生更多的是点突变、小片段的缺失和插入。目前,DMD基因的检测方法主要有以下几种微阵列比较基因组杂交技术 (a-CGH)、MLPA, MAPH、SCAIP、多重PCR、DNA印迹、Sanger测序法和第二代测序技术。对于高通量检测DMD基因外显子缺失和重复而言,上述这些检测方法的缺点是通量低、效率差。 所以,本领域中需要新的高通量检测DMD基因外显子缺失和重复的方法。
本发明涉及一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复方法,所述方法利用现在DMD 基因的序列信息设计探针,将捕获富集获得的DNA片段进行测序,通过分析获得DMD基因外显子缺失信息。本发明提供了一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复的方法,包括步骤1)将从待测样品和正常对照样品提取基因组DNA分别打断为双链DNA片段,并在所述双链DNA片段的两端添加接头序列;2)以第一引物和第二引物扩增所述带有接头的双链DNA片段,获得第一扩增产物;3)将所述第一扩增产物变性后,用核酸芯片进行杂交捕获;4)以第三引物和第四引物扩增所捕获的核酸,获得第二扩增产物;5)对上述第二扩增产物进行测序,获得测序序列片段;6)将所述测序序列片段比对到参考DMD基因的外显子序列及外显子侧翼上;7)通过比较待测样品和正常对照样品比对结果确定所述待测样品DMD基因的外显子是否有重复和/或缺失,即如果比对到所述基因外显子参考序列上的所述待测样品测序序列显著多于/少于所述正常对照样品测序序列,表示所述基因的外显子是否有重复和 /或缺失。本发明的方法结合序列捕获技术、高通量测序和生物信息分析对DMD基因进行检测。这三种技术的结合是一种非常有效的DMD基因缺失和/或重复的检测策略。下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了用于确定本发明的设截止值的正态分布图。 图2显示了实施例中的实验上机条件。主带位置。在本发明的方法步骤1)中,所述双链DNA经打断后优选具有平末端,例如通过末端修复造成所述平末端。在另一优选例中,还包括步骤在所述平末端双链DNA片段的3’ 端加“A”,所述3’端加“A”的双链DNA片段与带有一个“T”的接头相连,成为两端都带有接头的双链的DNA片段混合物。所述接头序列长度优选是20-150nt,特别是50-100nt。本领域技术人员可以根据序列选择合适的接头序列,也可以市售的试剂盒中常用的序列作为接头序列。在本发明的方法步骤1)中,优选所述双链的DNA片段两末端通过接头连接序列与接头序列连接。在另一优选例中,所述接头连接序列为poly (N)n,其中,各个N分别独立地选自A、T、G或C,η为选自1-20的任一正整数。在另一优选例中,所述的接头连接序列为poly(A)n,其中,η为1-20的正整数,较佳地η = 1_2。在另一优选例中,所述的接头连接互补区序列为poly(N’)m,其中各N’分别独立地选自A、T、G或C,m为1-20的正整数,并且?017(吣11和?017(^)111为互补序列。在另一优选例中,m为选自1-3的任一正整数。在另一优选例中,所述的接头连接互补区的长度与接头连接序列的长度相同,即Poly(N)n* poly (N’ )m为完全互补序列。在另一优选例中,所述的接头连接互补区为poly (T)m,其中,m 为1-20的正整数,较佳地m = 1-2。本领域技术人员可以根据序列选择合适的接头连接序列,也可以市售的试剂盒中常用的序列作为接头连接序列。在本发明的方法步骤幻中,优选所述第一引物和第二引物根据DMD基因的基因区序列和/或所述接头序列设计。在一个优选例中,所述的第一引物和第二引物具有对应于所述接头的引物结合区的接头结合区,以及位于接头结合区外侧的测序探针结合区。在另一优选例中,所述的第一引物和第二引物为长度30-80bp的寡核苷酸。在另一优选例中,第一引物和第二引物长度为55-6^p。在另一优选例中,所述的第一引物和第二引物是不同的。在本发明的方法步骤幻中,本发明使用的芯片可以通过以下方式进行设计通过微阵列技术,将高密度DNA片段阵列以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面,以荧光标记的DNA探针,借助碱基互补杂交原理,进行大量的基因表达及监测,捕获目标序列。例如,芯片可以由美国Roche NimbleGen公司设计合成。 在本发明的方法步骤幻中,优选所述的核酸芯片固定有5-200,000种对应于所述 DMD基因的特异性探针。在另一优选例中,所述芯片上特异性探针的种类为50-150,000种, 更佳地500-100,000种,最佳地5000-80,000种。在另一优选例中,所述探针的序列对应于 DMD基因的以下区域外显子和/或外显子前后两端优选50-500nt,更优选100-300nt,最优选200nt。在另一优选例中,所述特异性探针的长度为20-120mer,较佳地,50-100mer,更佳地,60-80mer。在另一优选例中,所述特异性探针为全人工合成或体外克隆合成。在本发明的方法步骤幻后,优选包括步骤用封闭分子封闭位于所述扩增产物两端的、对应于第一引物和第二引物的区域,从而获得两端被封闭的单链扩增产物的混合物, 用所述的经封闭的单链扩增产物的混合物进行后续步骤4)。在另一优选例中,所述的封闭分子封闭第一 PCR扩增产物中对应于第一引物和第二引物的70% -100%区域。在另一优选例中,所述的封闭分子封闭第一 PCR扩增产物中对应于第一引物和第二引物的100%区域。在本发明的方法步骤4)中,优选所述第三引物和第四引物根据DMD基因的基因区序列和/或所述接头序列设计。在一个优选例中,所述第三引物和第四引物分别特异性对应于或结合于所述的第一引物和第二引物。在另一优选例中,所述的第三引物和第四引物分别特异性结合于所述的第一引物和第二引物的外侧,并且长度小于第一引物和第二引物。在另一优选例中,所述的第三引物和第四引物长度为15-40bp,较佳地为20-2^p。在另一优选例中,所述的第三引物和第四引物是不同的。在本发明的方法步骤5)中,所述测序优选采用第二代测序技术,例如illumina solexa,Hiseq 2000、ABI SOLiD,Roche 454 测序平台和 / 或 Ion torrent。在另一优选例中,将所述的第二扩增产物的混合物与固相载体上固定的测序探针进行杂交,并进行固相桥式PCR扩增,形成测序簇;然后对所述测序簇用“边合成-边测序”法进行测序,从而得到样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列。目前,有一些生物技术服务公司可提供测序服务。
在本发明的方法步骤6)中,将所述测序序列比对到参考DMD基因外显子序列及外显子侧翼上可以通过本领域中已知的软件进行,例如短寡核苷酸分析包(Short Oligonucleotide Analysis Package, SOAP)比对禾口BWA (Burrows—Wheeler Aligner)比对; 所述侧翼长度优选为50-500nt,更优选100-300nt,最优选200nt。在本发明的方法步骤6)后,可以先对测序结果原始测序序列质控,去除不合格的测序序列,其中原始read质控包括的项目见下表;
本发明涉及一种检测DMD基因外显子缺失和/或重复方法,所述方法利用现在DMD基因的序列信息设计探针,将捕获富集获得的DNA片段进行测序,通过分析获得DMD基因外显子缺失信息。
一种检测dmd基因外显子缺失和/或重复的方法
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