专利名称：抱茎苦荬菜内酯及其衍生物组合物和它的制备方法及其应用的制作方法抱茎苦荬菜是菊科抱茎苦荬菜[Ixeris sonchifia(Bge.)Hance]一年生草本植物的全草，又名苦碟子。盛产于我国东北、华北等地。《现代中药学大辞典》记载，抱茎苦荬菜味苦、辛，具清热解毒、排毒、止痛之功效。民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症。全世界苦荬菜属植物共有50余种，主要分布于中国、日本、朝鲜越南以及前苏联等地。我国共有苦荬菜属植物20余种。苦荬菜属植物在我国有悠久的药用历史，主要药理作用有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静及心血管等方面的活性，冯玉书[中草药通讯1979(3)31、沈阳药学院学报.1981，1323]等人证明，抱茎苦荬菜的提取物具有增加冠脉流量，增加心肌营养性血流量，降低心肌耗氧量，改善心肌循环等作用；对血液系统能显著抑制血小板聚集功能，明显增加纤溶酶的活性，而这些作用是防治血栓闭塞性疾病的基础。抱茎苦荬菜的提取物无论在有氧、不同程度缺氧以及无氧条件下，均能使心肌乳酸含量显著降低，减轻或防止心肌细胞酸中毒，有利于心肌细胞功能的恢复[沈阳药学院学报.1982，1630]；同时降低心肌代谢，增加侧枝循环，改善心肌缺氧，使心肌供血有明显改善。近年柳晓琳[锦州医学院学报2002，2，23(1)]等对苦碟子抗肿瘤作用进行了研究以小鼠移植性肉瘤180(S180)和艾氏腹水瘤(EAC)为模型，观察苦碟子的抗肿瘤作用，并分别计算出抑瘤率和生命延长率。结果不同剂量的苦碟子对小鼠肉瘤S180的抑制率分别为39.86％，38.14％和35.73％(与对照组相比差异有显著性，P＜0.01)，苦碟子也能延长荷艾氏腹水瘤(EAC)小鼠的存活期，生命的延长率分别为41.27％，29.78％和17.88％(高剂量组和中等剂量组与对照组相比差异有显著性，P＜0.01)。从二十世纪八十年代以来，各国学者对苦荬菜属植物的化学成分进行了一系列研究，发现其化学成分比较复杂，主要含倍半萜内酯类、三萜类及黄酮类化合物，此外还含有香豆素、木质素、维生素、氨基酸、糖等类型化合物。倍半萜类化合物分布在植物界和微生物界，多以挥发油的形式存在，倍半萜的含氧衍生物多具有较强的香气和生物活性。倍半萜类是分子中由3个异戊二烯单位构成、含15个碳原子的化合物。按其结构碳环数分为无环型、单环型、二环型、三环型和四环型等。按倍半萜的含氧基分为倍半萜醇、醛、内酯等。倍半萜内酯类化合物具有抗炎、解痉、抑菌、强心、降血脂、抗原虫和抗肿瘤等活性，因此成为大家关注的热点，研究很快，在苦荬菜属植物中分离得到大约有70多个倍半萜内酯类化合物，其骨架类型主要有愈创木烷内酯型、美兰烷内酯型、吉马烷内酯型和桉烷内酯型等。
本发明的目的是提供抱茎苦荬菜内酯及其衍生物组合物和它的制备方法及其应用，它可以制成各种单方药物制剂，还可制成缓释或控释药物制剂，可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可用于与其它药物(含中药提取物或有效成分)组成复方药物制剂，以上药物制剂可用于制备治疗各种肿瘤和癌症的药物。该组合物主要含有抱茎苦荬菜内酯A-1(I)葡萄糖苷和抱茎苦荬菜内酯B-1(II)葡萄糖苷。抱茎苦荬菜内酯组合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例为10～1∶1～10。化合物I、II可以通过水解R1上的葡萄糖基获得抱茎苦荬菜内酯苷元组合物。所涉及的化合物中内酯环可以在碱性下开环成化合物III、IV，通过对其中R1和R2的修饰(如烷基化、酯化、胺基化、糖基化和/或成盐)，或对其碳骨架采取还原，加成等反应制成各种衍生物以改善其活性和/或物理性质。1本发明组合物的制备(1)本发明涉及抱茎苦荬菜内酯苷及其组合物的制备方法，其具体特征步骤如下(a)抱茎苦荬菜全草(菊科植物)切碎经水煮或含水醇回流提取后得提取液(a)。
(b)将提取液(a)浓缩并过滤，滤液经有机溶剂萃取，除去油和亲脂性物质，将水层浓缩真空干燥，得到干粉(b)。
(c)将干粉(b)用水溶解，通过反向吸附树脂柱，除去水溶性杂质，再用醇水洗脱，得到洗脱液(c)。
(d)洗脱液(c)经浓缩，真空干燥，得到干粉(d)。
(e)干粉(d)经硅胶拌样，氧化铝柱层析，有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，真空干燥，得到干粉(e)。
(f)干粉(e)经硅胶拌样，硅胶柱层析，有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，真空干燥，得到本发明所述抱茎苦荬菜内酯苷组合物。
(g)将所述组合物最终通过HPLC分离，分别得到二种化合物的纯品，它们是化合物I和化合物II。
(2)本发明中涉及抱茎苦荬菜内酯苷元及其组合物的制备方法，其具体特征步骤如下(a)将本发明所述组合物用酸或酶水解，得水解物(a)。
(b)水解物(a)经硅胶拌样，硅胶柱层析，有机溶剂洗脱，洗脱液浓缩，真空干燥，得到本发明所述抱茎苦荬菜内酯苷元及其组合物。
2组合物的组成纯化与定量分析2.1所述组合物通过HPLC分离纯化，分别得到二种化合物的纯品。检测结果如下所述抱茎苦荬菜内酯苷各组分通过HPLC检测(色谱柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波长270nm；流动相甲醇-水(38∶62)(见附图2，附图3)2.2用纯化的化合物I和II为对照品分别绘制液相工作标准曲线(以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标)如下表1 两种组分标准曲线

2.3所述化合物I和II组合物通过HPLC检测(色谱柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波长270nm；流动相甲醇-水(38∶62))给出两个峰(见附图1)，峰1(10.5min)是化合物I，峰2(12.4 min)是化合物II。
2.4所述化合物I和II苷元组合物通过HPLC检测(色谱柱DiamonsilTMC18 5μ 200×4.6mm；波长270nm；流动相甲醇-水(41∶59))给出两个峰(见附图4)，峰1(23.8min)是化合物I苷元，峰2(26.2min)是化合物II苷元。
抱茎苦荬菜内酯苷是抱茎苦荬菜提取物主要有用成分，可以通过特定的工艺过程，标化只含有抱茎苦荬菜内酯A-1(I)葡萄糖苷和抱茎苦荬菜内酯B-1(II)葡萄糖苷组分的组合物，抱茎苦荬菜内酯苷组合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例为I(10～1)∶II(1～10)。从而为抱茎苦荬菜内酯及其衍生物组合物的单方制剂和复方制剂的现代化提供了可靠的物质基础。
3本组合物成分的结构鉴定3.1对HPLC分离得到的抱茎苦荬菜内酯苷组合物的二种组分经UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS光谱鉴定结构如下化合物I为白色针状结晶，EI-MS给出分子离子峰为424[M]+，提示分子量为424，结合1H-NMR，13C-NMR确定分子式为C21H28O9。IR(KBr)cm-13400(-OH)为一宽而强的吸收峰；1771及1662处的强峰表明有两种不同类型的羰基吸收峰，其中1771为典型的饱和五元γ-内酯羰基吸收峰；1640为双键吸收峰。13C-NMR中显示共有21个碳信号。除去高场的6个葡萄糖碳原子峰，有15个低场碳信号。结合IR谱推测化合物I为倍半贴内酯类化合物。
化合物II为白色针状结晶，EI-MS给出分子离子峰为422[M]+，提示分子量为422，结合1H-NMR，13C-NMR确定分子式为C21H26O9。IR(KBr)cm-13400(-OH)为一宽而强的吸收峰；1769及1670处的强峰表明有两种不同类型的羰基吸收峰，其中1769为典型的饱和五元γ-内酯羰基吸收峰；1640为双键吸收峰。13C-NMR中显示共有21个碳信号。除去高场的6个葡萄糖碳原子峰，有15个低场碳信号。结合IR谱推测化合物I为倍半贴内酯类化合物。
1H-NMR信号归属

13C-NMR信号归属


由此得到化合物I的结构为

R1葡萄糖基即为抱茎苦荬菜内酯A-1(I)葡萄糖苷，分子式为C21H28O9。由此得到化合物II的结构为

R1葡萄糖基即为抱茎苦荬菜内酯B-1(II)葡萄糖苷，分子式为C21H26O9。3.2对HPLC分离得到的抱茎苦荬菜内酯苷元组合物的二种组分经UV、IR、1H-NMR、13C-NMR和MS光谱鉴定结构如下化合物I为白色针状结晶，EI-MS给出分子离子峰为262[M]+，提示分子量为262，结合1H-NMR，13C-NMR确定分子式为C15H18O4。IR(KBr)cm-13400(-OH)为一宽而强的吸收峰；1771及1662处的强峰表明有两种不同类型的羰基吸收峰，其中1771为典型的饱和五元γ-内酯羰基吸收峰；1640为双键吸收峰。13C-NMR中显示共有15个碳信号。结合IR谱推测化合物I为倍半贴内酯类化合物。化合物II为白色针状结晶，EI-MS给出分子离子峰为260[M]+，提示分子量为260，结合1H-NMR，13C-NMR确定分子式为C15H16O4。IR(KBr)cm-13400(-OH)为一宽而强的吸收峰；1769及1670处的强峰表明有两种不同类型的羰基吸收峰，其中1769为典型的饱和五元γ-内酯羰基吸收峰；1640为双键吸收峰。13C-NMR中显示共有15个碳信号。结合IR谱推测化合物I为倍半贴内酯类化合物。由1H-NMR信号归属


13C-NMR信号归属

由此得到化合物I的结构为

即为抱茎苦荬菜内酯A-1(I)，分子式为C15H18O4。由此得到化合物II的结构为 即为抱茎苦荬菜内酯B-1(II)，分子式为C15H16O4。4体外抗癌活性4.1细胞株人宫颈癌细胞HeLa，人黑色素瘤细胞A375-S2，小鼠肺上皮癌细胞L929。
4.2方法MTT法测定细胞生长抑制率.光学显微镜观察细胞形态变化。荧光显微镜观察观察细胞核变化和用琼脂糖电泳法测定细胞凋亡典型的DNA断裂.测定对正常人外周血细胞的影响.
4.3抱茎苦荬菜内酯苷组合物对细胞生长的抑制作用抱茎苦荬菜内酯苷组合物抑制HeLa，A375-S2，L929细胞的生长呈时间剂量依赖性。经抱茎苦荬菜内酯苷组合物处理后的细胞表现出典型的凋亡特征细胞皱缩，胞质空泡化，染色质浓集，边聚，出现凋亡小体。琼脂糖电泳检测表明抱茎苦荬菜内酯苷组合物导致L929细胞DNA片段化，并对人外周血细胞(PBMC)的影响较小。内酯苷组合物(◆)和阳性对照品顺铂(■)(24h，n＝4)抑制曲线表明(见附图5)样品能促进细胞凋亡，抑制细胞生长。本实验，A375-S2细胞(A)，HeLa细胞(B)和L929细胞(C)经1，10，50，100，200，500，1000μg/ml浓度的样品处理24h后，细胞增殖受到影响，在250μg/ml浓度下，增殖抑制率超过50％。因此，实验结果表明，样品对于A375-S2，HeLa和L929细胞都显示出了一定的增殖抑制活性。
4.4抱茎苦荬菜内酯苷元组合物对细胞生长的抑制作用抱茎苦荬菜内酯苷元组合物抑制HeLa，A375-S2，L929细胞的生长呈时间剂量依赖性。经抱茎苦荬菜内酯苷元组合物处理后的细胞表现出典型的凋亡特征细胞皱缩，胞质空泡化，染色质浓集，边聚，出现凋亡小体。琼脂糖电泳检测表明抱茎苦荬菜内酯苷元组合物导致L929细胞DNA片段化，并对人外周血细胞(PBMC)的影响较小.并通过实验表明苷元对于三种肿瘤细胞有更强的抑制活性。
内酯苷元组合物(◆24h，■48h)和阳性对照品顺铂(▲24h，×48h)(24h，48h，n＝3)
抑制曲线表明(见附图6)苷元能促进细胞凋亡，抑制细胞生长。A375-S2细胞(A)，Hela细胞(B)和L929细胞(C)经1，10，50，100，200μg/ml浓度的样品处理24h和48h后，细胞增殖受到影响，在24h，较低剂量50μg/ml浓度下，增殖抑制率均已超过50％，48h后，10μg/ml的剂量以下，抑制率既达到50％。因此，实验结果表明，苷元对于三种肿瘤细胞的抑制活性要明显高于内酯苷的抑制活性。
本发明的优点是提供了一种新的抱茎苦荬菜内酯及其衍生物组合物和它的制备方法及其应用，并可以制成各种单方药物制剂，还可制成缓释或控释药物制剂，可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可用于与其它药物(含中药提取物或有效成分)组成复方药物制剂，以上药物制剂可用于制备治疗各种肿瘤和癌症的药物。


图1为本发明抱茎苦荬菜提取的二种内酯苷组分HPLC2为本发明抱茎苦荬菜内酯A-1(I)葡萄糖苷HPLC3为本发明抱茎苦荬菜内酯B-1(II)葡萄糖苷HPLC4为本发明化合物I和II苷元成分HPLC5为本发明抱茎苦荬菜内酯苷组合物对肿瘤细胞A375-S2(A)的抑制曲线图6为本发明抱茎苦荬菜内酯苷组合物对肿瘤细胞HeLa(B)的抑制曲线图7为本发明抱茎苦荬菜内酯苷组合物对肿瘤细胞L929(C)的抑制曲线图8为本发明抱茎苦荬菜内酯苷元组合物对肿瘤细胞A375-S2(A)的抑制曲线图9为本发明抱茎苦荬菜内酯苷元组合物对肿瘤细胞HeLa(B)的抑制曲线图10为本发明抱茎苦荬菜内酯苷元组合物对肿瘤细胞L929(C)的抑制曲线
实施例1干燥抱茎苦荬菜全草切片10Kg，用水煮沸提取2次，每次2小时，提取液过滤后通过反向吸附树脂柱，再用醇水洗脱，洗脱液浓缩后用氧化铝柱层析，得富含抱茎苦荬菜内酯A-1(I)葡萄糖苷和抱茎苦荬菜内酯B-1(II)葡萄糖苷组分的组合物，最后经硅胶柱层析得到本专利所述的组合物(以下简称本组合物)150g。
本组合物通过水解R1上的葡萄糖基获得抱茎苦卖菜内酯苷元组合物。
本组合物及其苷元组合物，内酯环可以在碱性下开环成化合物III、IV，通过对其中R1和R2的修饰(如烷基化、酯化、胺基化、糖基化和/或成盐)，或对其碳骨架采取还原，加成等反应可制成各种衍生物。
本组合物或其衍生物50g，与微晶纤维素45g及硬脂酸镁5g混合，混合物用于打片，每片重0.2g，每片含本组合物0.1g。结合症状，每次服1-2片，每日2-3次。
本组合物或其衍生物50g，与玉米淀粉50g，加水制成软材，过12目筛造粒，干燥，制得颗粒，装入胶囊，每粒胶囊内容物重0.2g，含本组合物0.1g。结合症状，每次服1-2片，每日2-3次。
本组合物或其衍生物5g，与右旋糖苷-40或山犁醇20g及磷酸缓冲适量混合，用于注射用水溶解，通过注射剂的通用操作过程，制成注射剂每支5ml，含本组合物0.05g。结合症状，每次用1-4支，与注射氯化钠等输液混合使用，每日1次。
本组合物或其衍生物5g，与右旋糖苷-40或山犁醇20g及磷酸缓冲适量混合，用于注射用水溶解，通过注射剂的通用操作过程，灌装，冻干，制成冻干注射剂每支含本组合物0.05g。结合症状，每次用1-4支，与注射氯化钠等输液混合使用，每日1次。


本发明涉及从抱茎苦荬菜中提取分离得到的含有活性化合物抱茎苦荬菜内酯A－1(I)葡萄糖苷和抱茎苦荬菜内酯B－1(II)葡萄糖苷组合物及其相关的衍生物及其制备方法。抱茎苦荬菜内酯组合物中I和II的含量大于10％，小于98％，其中I和II的比例为10～1∶1～10。化合物I、II可以通过水解R1上的葡萄糖基获得抱茎苦荬菜内酯苷元组合物。将抱茎苦荬菜全草切碎，经水煮，浓缩回收过滤，再经氧化铝柱层析后，最后，经铝胶柱层析得上述组合物。上述组合物及其衍生物适用于制成各种单方药物制剂，可制成缓释或控释药物制剂；以上药物制剂可用于治疗各种肿瘤和癌症。