专利名称:马动脉炎病毒的rt-lamp检测试剂及试剂盒的制作方法马病毒性动脉炎是由马动脉炎病毒(Equine viral arteritis, EVA)引起的一种通过呼吸道或生殖器官传播的传染病,是危害养马业的重大疾病之一,被世界动物卫生组织(OIE)列入检疫名录。马动脉炎病毒(EAV)属于套式病毒目(Nidovirale)、动脉炎病毒科(Arteri--viridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus),它是线性单股正链RNA病毒,含有至少9个以上重叠的开放阅读框架,编码7种结构蛋白小囊膜蛋白(E、GP2b、GP3和 GP4)、核衣壳蛋白(N)、膜基质蛋白(M)、主要囊膜蛋白GP5。1957年Doll等在美国俄亥俄州 Bucyrus首次分离到该病毒,目前分布遍及全世界,多数为亚临床感染,但良种马易发病。病毒只有I个血清型,有欧、美两个代表株,欧洲株为CW株,美洲株为Bucyrus株。近年来,我国社会经济不断发展和人们生活水平不断提高,喜爱养马和赛马的人也越来越多,随着马术比赛国际化交流日益增多,该病的传播风险也越来越高。为防治该病的传播,有必要建立一种快速、高效、操作简便的检测方法。目前EVA的检测方法主要有病毒中和试验、病原鉴定、补体结合试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验(ELISA、)和RT-PCR检测等,其中病毒中和试验和病原鉴定(仅限于精液)是OIE国际贸易指定试验方法,授权公告号为CN1851463的发明专利,则公开了间接酶联免疫吸附试验检测EAV方法,RT-PCR检测如杜建等的马动脉炎病毒RT-PCR检测方法的建立(中国动物检疫,2005,(5) :30-32);但上述方法均存在不同的缺点,例如,所需试验周期较长、对仪器要求要求高、操作繁琐、无法现场检测,且灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。研究建立特异、敏感、可对马病毒性动脉炎病毒进行方便、准确检测的方法,在检疫方面具有重要的实际应用价值。
本发明所要解决的技术问题是提供了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒,该RT-LAMP检测试剂及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作简单、对仪器要求简单和结果易于观察等优点,方便适用于现场快速检测;为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂,包括F3引物溶液、B3引物溶液、BIP引物溶液和FIP引物溶液,所述F3引物溶液含核苷酸序列为GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物,所述B3引物溶液含核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物,所述BIP引物溶液含核苷酸序列为TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG的BIP引物,所述FIP引物溶液含核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物。引物系选择马动脉炎病毒膜蛋白M基因的保守片段为靶目标,应用 PrimerExploer V4 软件(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)分析、设计和合成;将合成的多组内外引物最佳配对筛选实验,得到最合适的上述F3、B3、BIP、FIP 引物;引物由上海生工合成。该RT-LAMP检测试剂组成100 X 25 μ I反应体系的试剂盒10 X ThermoPol缓冲液2. 5 μ 1,浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1,浓度I. 5mM的dNTP 2 μ 1,浓度5 M的甜菜碱(Betaine)2l·! I,浓度25 mM的MgCl2Iy I,浓度都为10 μ M的F3引物溶液和B3引物溶液各0.5 μ 1,浓度都为10μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I。25 μ I检测反应体系时样品DNA模板2 μ 1,余量用双蒸水补足。ThermoPol缓冲液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液和Betaine均购于TaKaRa公司。该RT-LAMP检测试剂组成的试剂盒中还可以有阳性对照液和阴性对照液,阳性对照液含有马动脉炎病毒阳性cDNA,阴性对照液为双蒸水,用以对比、验证检测。与现有技术相比,本发明的优点在于马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒,包括含核苷酸序列为 TTGAGCGGGG GATGGGAACA CATCGCCAAC TGGTGGTAG 的 BIP 引物溶液,含核苷酸序列为CGCCCGTTTC GAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列为ACTCAGATAG TGGTTCGCGG CGTCTTGACG CCATCGACAA G 的 FIP 引物溶液,含核苷酸序列为 GCCTCGTCTT CGGTCCAT的F3引物溶液、试剂盒中还有IOXThermoPol缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和MgCl2,该RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒具有高灵敏度,高特异性,操作简单方便只需要简单的水浴锅即可,对仪器要求简单无需昂贵的PCR仪或荧光PCR仪的投入,结果易于观察染料直接肉眼观察结果等优点,适用于现场快速检测1个小时就完成检测;为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。O.0012pg、0.012pg、0. 12pg、l. 2pg、12pg,结果O. 12pg也可以观察到颜色变化,说明本发明的RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒灵敏性高,灵敏度比依杜建等建立的马动脉炎病毒RT-PCR检测方法高出100倍,具体杜建等的检测方法在此不作叙述。实施例5、反应体系的优化与实施例4基本相同,只是25 μ I反应体系中,分别对浓度25mM的1%(12用0、1、2、3、4、5μ I扩增反应试验,对浓度10 μ M的F3引物溶液和 Β3 引物溶液用 O. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1 μ I 扩增反应试验,对浓度 10 μ M 的BIP引物溶液和FIP引物溶液用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μ I扩增反应试验,对浓度5 M 的甜菜碱用0、1、2、3、4、5μ I扩增反应试验,对反应温度进行61、62、63、64、65°C扩增反应试验,结果MgCl2用1μ 1,F3引物溶液和Β3引物溶液都用O. 5 μ 1,BIP引物溶液和FIP引物溶液用4 μ 1,甜菜碱用2 μ 1,反应温度为63°C为优,所以建立10XThermoPol缓冲液
2.5 μ 1,浓度8 U / μ L的Bst DNA聚合酶I μ 1,浓度I. 5mM的dNTP 2 μ 1,浓度5 M的甜菜碱(Betaine) 2μ I,浓度25 mM的MgCl2I μ I,浓度都为10 μ M的F3引物溶液和Β3引物溶液各O. 5 μ 1,浓度都为10 μ M的BIP引物溶液和FIP引物溶液各4 μ I反应体系的试剂盒;访试剂盒也可以是200X25 μ I反应体系,300 X 25 μ I反应体系,或100 X 20 μ I反应体系等,在此不一一举例。实施例6、应用取马血、鼻腔分泌物等进行与实施例3相同的核酸提取、cDNA合成检测和恒温扩增检测,,若扩增产物中呈绿色荧光,则该马感染有马动脉炎病毒,已患或可能会患马病毒性动脉炎,需及时预防和治疗。
本发明公开了马动脉炎病毒的RT-LAMP检测试剂及试剂盒,包括含核苷酸序列为GCCTCGTCTTCGGTCCAT的F3引物溶液、含核苷酸序列为CGCCCGTTTCGAAAAGAGG的B3引物溶液、含核苷酸序列为TTGAGCGGGGGATGGGAACACATCGCCAACTGGTGGTAG的BIP引物溶液,含核苷酸序列为ACTCAGATAGTGGTTCGCGGCGTCTTGACGCCATCGACAAG的FIP引物溶液,试剂盒中还有10×ThermoPol缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTP、甜菜碱和MgCl2,该RT-LAMP检测试剂及试剂盒对马动脉炎病毒具有高灵敏度,高特异性,操作简单方便,对仪器要求简单,结果易于观察等优点,适用于现场快速检测;为马病毒性动脉炎的早期防治提供技术支持。
马动脉炎病毒的rt-lamp检测试剂及试剂盒制作方法
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