专利名称：琥珀酸的制造方法基于发酵的琥珀酸生产一般在供给足量氧气的好氧条件下、供给少量氧气的微好氧条件下或不供给氧气的厌氧条件下进行。目前为止的记载是，较之于好氧条件，微好氧条件下或厌氧条件下对发酵反应更有利(专利文献I 4，非专利文献I)。特别地，还有这样的记载以棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)为题材，基于模拟(FBA模型)试验结果，供给微量氧气的条件相比于厌氧条件，提高了琥珀酸的生产，以及通过缺损LDH基因进一步提高了琥珀酸的生产(非专利文献I)。 专利文献5和6中记载了，在使用酵母或曲霉等真核细胞生产琥珀酸中，在缺氧条件下，氧气消耗速度(移动速度)控制在0. 01 5mmol/L/hr以下,或通过通气进行氧气供给控制时(oxygen limited conditions),氧气消耗速度控制在 5. 5 7mmol/L/hr。现有技术文献专利文献[专利文献I]日本专利特开2004-194570号公报[专利文献2]日本专利特开2006-6344号公报[专利文献3]日本专利特开2005-95169号公报[专利文献4]国际公开W02005/026349号小册子[专利文献5]国际公开W02009/065778号小册子[专利文献6]国际公开W02010/003728号小册子[非专利文献][非专利文献 I] Shinfuku et al. , Development and experimental verificationof a genome-scale metabolic model for Corynebacterium glutamicum (谷氛酸棒状杆菌的基因组尺度代谢模型的建立和实验证实).Microbial Cell Factories 2009, vol. 8:4
但是，由于非专利文献I中记载的模拟(FBA模型)试验是以菌体增殖达最佳状态为目的进行计算的，因此条件是作为原料的糖代谢用于菌体增殖、菌体的代谢物主要产生乳酸(碳收率最大60%)、琥珀酸中碳收率最大20%左右。进而，在微好氧条件下以及厌氧条件下的琥珀酸生产中，氧摄取速度(OUR)/糖摄取速度(GUR)为0. 21时，相对于模拟结果的碳收率为19. 2%，实施例的碳收率为3. 1%，模拟结果与实施例相背离。由此可知，在菌体增殖受到限制的条件下，向基于产生琥珀酸的微生物的发酵反应的氧气供给和琥珀酸生产反应的详细关系尚不明确。此外，模拟中的发酵条件下菌体增值速度高，在菌体增殖受限制的条件下，向发酵反应的氧气供给和琥珀酸生产反应的详细关系尚不明确。而且，在工业规模下进行生产时，必须控制为不供给氧气的厌氧环境，具体来说，如专利文献I记载的那样，通过减压将反应水溶液中溶解的气体除去，或通过氮气等将氧气从反应体系中除去。然而，由于增设除去溶解气体用的减压设备和控制氮气供给等要花费大量费用，所以在工业利用上不理想。此外，在工业规模下进行从反应体系除去氧气时，反应开始前要花费大量的时间，因此使用的菌体和培养基等的状态发生了变化，反应本身可能出现障碍。此外，工业规模的琥珀酸生产中，氧气供给和琥珀酸生产效率的关系尚不清/E. o本发明的课题是提供比以往的生产效率高，尤其是可以适应工业规模的琥珀酸的制造方法。本发明人们，为了解决上述课题而潜心研究，结果发现了通过能产生琥珀酸的微生物从原料糖制造琥珀酸时，在微生物的菌体增殖受到限制的条件下，通过将氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比控制在特定的范围，即在供给极微量的氧的环境下进行琥珀酸生产反应，可提高琥珀酸生产效率，从而完成了本发明。 S卩，本发明的主旨如下。[ I ] 一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比(mmol-02/mol-SA)在0. I以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。[2] [I]中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反应中的相对琥珀酸的氧移动速度减少率(％/g/L)在I. 2以下。[3] [I]或[2]中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，氧移动速度(mmol-02/L/hr)在0.01以上、5以下。[4] [I] [3]的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，该微生物选自棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属、放线杆菌(Acinobacillus)属、丝状真菌、酵母菌。[5] [I] [4]的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，该微生物是被变异为乳酸脱氢酶活性低于非变异株的微生物，和/或变异为丙酮酸羧化酶活性强于非变异株的微生物。[6] [I] [5]的任一项中所述的琥珀酸的制造方法，其特征在于，反应中的pH为5以上、10以下。[7]—种含琥珀酸聚合物的制造方法，包括根据[I] [6]的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和使用所得到的琥珀酸进行聚合反应的工序。[8] —种琥珀酸衍生物的制造方法，包括根据[I ] [6]的任一项所述的方法制造琥珀酸的工序，和以所得到的琥珀酸为原料合成琥珀酸衍生物的工序。本发明是一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比(mmOl-02/mOl-SA)的范围在0. I以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。〈微生物〉本发明的方法中使用的微生物只要是具有琥珀酸产生能力的微生物就没有限制。本发明中，所谓琥珀酸产生能力是指，在培养基上培养微生物时，在该培养基上蓄积琥珀酸的能力。具体地，虽然没有特别的限制，但琥珀酸产生能力的程度能够通过琥珀酸的糖消费碳收率等来表示。对于琥珀酸的糖消费碳收率(C_mol%)虽然没有特别的限制，但如果糖消费碳收率过低，则相对于作为原料的糖的琥珀酸生产效率有降低的倾向，因此通常在40C-mol%以上，优选在50C-mol%以上，更优选在60C-mol%以上。另一方面，通常在133C_mol%以下，优选在120C-mol%以下，更优选在110C-mol%以下。另外，所谓琥珀酸中的糖消费碳收率 (C-mol%)是指，相对于消费的糖所含的碳原子(C原子)的摩尔数，生产的琥珀酸所含碳原子的摩尔数之比。本发明的方法所使用的微生物，只要具有琥珀酸产生能力就没有特别的限制，可列举从棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属细菌、放线杆菌(Acinobacillus)属细菌、丝状真菌和酵母菌组成的群组中选择的微生物。其中，优选棒状杆菌、大肠杆菌、厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属细菌、放线杆菌(Acinobacillus)属细菌、酵母菌，更优选棒状杆菌、大肠杆菌、酵母菌，特别优选棒状杆菌。本发明的方法中使用的棒状杆菌可列举属于棒状杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属、节细菌(Arthrobacter)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属、细杆菌(Microbacterium)属、微球菌(Micrococcus)属的细菌。作为短杆菌属细菌,使用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Iactofermentum)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等。另外，黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌和谷氨酸棒杆菌相互的亲缘关系非常近，性质也类似，在现在的分类学中有时也被分类为同一个种。作为特别优选的棒状杆菌亲株的具体例子可列举，黄色短杆菌MJ-233 (FERMBP-1497)、同 MJ-233AB-41 (FERM BP-1498)、谷氨酸棒杆菌 ATCC31831、乳糖发酵短杆菌ATCC13869 等。另夕卜，由于现在黄色短杆菌有时也被分类为谷氨酸棒杆菌(Lielbl，W.，etal., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991，vol. 41，p255_260),所以本发明中，黄色短杆菌MJ-233株及其变异株MJ-233AB-41株分别与谷氨酸棒杆菌MJ-233株及MJ-233AB-41株是相同的株。黄色短杆菌MJ-233于1975年4月28日在通商产业省工业技术院微生物工业技术研究所(现独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心)(〒305-8566日本国茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6)以受托番号FERM P-3068寄托保藏，1981年5月I日基于布达佩斯条约移交国际寄托保藏，以FERM BP-1497的受托番号寄托保藏。作为厌氧螺菌(Anaerobiospirillum)属细菌，使用产琥拍酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)等。作为放线杆菌(Acinobacillus)属细菌,使用产琥拍酸放线杆菌(Acinobacillussuccinogenes)等。丝状真菌可列举属于曲霉(Aspergillus)属、青霉(Penicillium)属、根霉(Rizopus)属等的微生物。作为曲霉属微生物，使用黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等。作为青霉属微生物，使用产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、简青霉(Penicillium simplicissimum)等。作为根霉属微生物，使用米根霉(Rizopus oryzae)等。酵母菌可列举属于酵母属(Saccaromyces)、裂殖酵母属(Shizosaccaromyces)、念珠菌属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、接合酵母 属(Zygosaccharomyces)等的微生物。作为酵母属(Saccaromyces)微生物，使用酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、贝酵母(S. bayanus)等。作为裂殖酵母属(Shizosaccaromyces)微生物，使用粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等。作为念珠菌属(Candida)微生物,使用白念珠菌(Candida albicans)、索诺拉念珠菌(C. sonorensis)、光滑念珠菌(C. glabrata)等。作为毕赤酵母属(Pichia)微生物,使用毕赤酵母(Pichia pastoris)、树干毕赤酵母(Pichia Stipidis)等。作为克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)微生物，使用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)、耐热克鲁维酵母(K. thermotolerans)等。作为接合酵母属(Zygosaccharomyces)微生物，使用拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailli)、鲁氏酵母(Z. rouxii)等。该琥珀酸生产能力可以是本发明的方法中所使用的微生物的野生株所具有的性质，也可以是通过育种赋予的性质。通过育种赋予琥珀酸生产能力的方法没有特别限制，具体来说可使用通过UV照射或NTG处理等通常的变异处理而得到变异株的方法、通过细胞融合或基因重组法等遗传性方法得到诱导重组体的方法等迄今微生物育种中采用的方法。上述重组体可使用强化琥珀酸合成酶基因的表达或弱化琥珀酸分解酶基因和副产物合成基因的表达等公知的方法得到。使用本发明方法的重组体可以施加单独的变异，也可以施加2种或3种以上的变异。具体地可列举例如，被变异为乳酸脱氢酶活性比非变异株降低的微生物等。被变异为丙酮酸羧化酶(以下也称为“PC”或“pc”)活性比非变异株增强的微生物，例如，可以与日本专利特开平11-196888号公报中记载的方法同样地，通过用质粒使pc基因在宿主微生物中高表达来构筑。此外，可以通过同源重组组装于染色体上，也可以通过启动子取代来增强PC基因的表达(日本专利特开2008-259451号公报)。转化可通过例如电脉冲法(Res. Microbiol.，Vol. 144，p. 181-185，1993)等进行。
所谓“PC活性增强”是指PC活性相对于野生株或亲株等非变异株，每单位重量菌体优选增加I. 5倍以上，更优选增加3.0倍以上。PC活性的增强可通过公知的方法，例如，按J. Bacteriol.，158，55-62，(1984)中记载的方法测定PC活性来确认。作为pc基因的具体的导入方法，使用日本专利特开2008-259451号中记载的方法。此外，变异为乳酸脱氢酶(以下有时称作“LDH”)活性比非变异株降低的微生物，例如，可以通过日本专利特开平11-206385号公报中记载的基于同源重组的方法，或通过使用sacB基因的方法(Schafer，A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)破坏染色体上的LDH基因来构筑。另外，所谓“LDH活性降低”是指与非变异株比较，LDH活性下降。LDH活性完全消失也可以。LDH活性的降低可通过公知的方法(L. . Kanarek, et al. , J. Biol.Chem. 239，4202 (1964)等)测定LDH活性来确认。进一步，本发明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增强和/或LDH 活性降低，还可以是变异为从醋酸激酶(以下也称为“ACK”)、磷酸转乙酰酶(以下也称为“PTA”)、丙酮酸氧化酶(以下也称为“P0XB”)和辅酶A转移酶(以下也称为“CTF”)组成的群组中选出的I种以上的酶活性降低的微生物。虽然可以将PTA和ACK任一方的活性降低，但为了有效降低醋酸副产物的产生，优选降低二者的活性。所谓“PTA活性”是指，对磷酸向乙酰辅酶A转移生成乙酰磷酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为PTA活性降低”是指，PTA的活性比非变异株，例如野生株降低。PTA活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。此外，PTA活性完全消失也可以。PTA活性的降低可通过例如，Klotzsch, H. R. , MethEnzymol. 12，381-386(1969)等记载的方法测定PTA活性来确认。所谓“ACK活性”是指，对由乙酰磷酸和ADP生成醋酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为ACK活性降低”是指，ACK的活性比非变异株，例如野生株降低。ACK活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。此夕卜，ACK活性完全消失也可以。ACK活性的降低可通过Ramponi的方法(Ramponi G. , Meth.Enzymol. 42，409-426 (1975))测定ACK活性来确认。谷氨酸棒杆菌(包括被分类到黄色短杆菌的菌)中，如 Microbiology. 1999 Feb; 145 (Pt 2) :503-13 中记载的那样，由于 PTA 和 ACK两种酶被pta-ack操纵子(GenBank Accession No. X89084)编码,所以破坏pta基因时,可以降低PTA和ACK两种酶的活性。降低PTA和ACK的活性可以通过公知的方法，例如，利用同源重组的方法或按照使用sacB基因的方法(Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)破坏它们的基因来进行。具体地可以按照日本专利特开2006-000091号公报中公开的方法来进行。作为pta基因和ack基因，除了上述具有GenBank Accession No. X89084碱基序列的基因以外,还可以使用具有宿主染色体上的Pta基因和ack基因发生同源重组程度的同源性的基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此夕卜，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。所谓“P0XB活性”是指对由丙酮酸和水生成醋酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为POXB活性降低”是指，POXB的活性比非变异株，例如野生株低。POXB活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失的情况。POXB活性的降低可通过Chang Y.，et al.，J. Bacteriol. 151，1279-1289(1982)等中记载的方法测定活性来确认。POXB的活性降低，可以通过公知的方法，例如，利用同源重组的方法或按照使用sacB基因的方法(Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73)等破坏poxB基因来进行。具体地可以按照W02005/113745号公报等公开的方法来进行。作为poxB基因，可举出例如具有GenBank Accession No. Cgl2610(GenBank Accession No. BA000036 的第 2776766-2778505号的互补链)的碱基序列的基因，但具有宿主染色体DNA上的poxB基因发生同源重组程度的同源性也可以，因此也可以使用该序列的相同基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此外，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。所谓“CTF活性”是指对将乙酰辅酶A的辅酶A向其他物质转移而生成醋酸的反应进行催化的活性。所谓“变异为CTF活性降低”是指，CTF的活性比非变异株，例如野生株降低。CTF活性与非变异株比较，优选每单位重量菌体降低至30%以下，更优选降低至10%以下。“降低”也包括活性完全消失情况。CTF活性的降低可通过Scherf U and Buckel ff. Appl Environ Microbiol. 1991; vol. 57, pp. 2699-2702.等中记载的方法测定。作为Ctf 基因，可举出例如具有 Genbank Accession No. Cgl2569 (GenbankAccession No. BA000036的第2729376-2730917号的互补链)的碱基序列的基因，但具有宿主染色体DNA上的Ctf基因发生同源重组程度的同源性也可以，因此也可以使用该序列的相同基因。此处，所谓发生同源重组程度的同源性是指，优选80%以上，更优选90%以上，特别优选95%以上。此外，如果是能与上述基因在严格条件下杂交的DNA，就可以发生同源重组。此外，本发明的制造方法中所使用的微生物，除了上述PC活性增强或PC活性增强且LDH活性降低以外，还可以组合上述变异中的2种以上变异所得到的微生物。作为理想的微生物，可列举例如日本专利特开2008-259451号公报等中记载的黄色短杆菌MJ233/PC-4/ A LDH 株、国际公开 W02009/065777 号小册子、国际公开 W02009/065778 号小册子、国际公开W02009/065779号小册子、国际公开W02009/065780号小册子、国际公开TO2010/003728号小册子等中记载的组合了破坏编码乙醇脱氢酶的ADHl和ADH2基因、破坏编码甘油三磷酸脱氢酶的GPDl基因、增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性、增强苹果酸脱氢酶活性、增强富马酸酶活性、增强富马酸还原酶活性、增强苹果酸转运体活性的酵母菌株，例如 SUC-200 (MATA ura3-52 leu2_112 trpl-289 adhl: :lox adh2: :loxgpdl: :Kanlox, overexpressing PCKa, MDH3, FUMR, FRDg and SpMAEl)等。< 培养 >本发明中，所谓培养主要是指，令琥珀酸制造方法中所使用的微生物增殖而制备微生物菌体的工序。可以省略培养工序，也可以将在寒天培养基等固体培养基上斜面培养之物直接用于反应，此外，还可以将培养工序重复数次。本发明中，将主要制造琥珀酸的工序称为“琥珀酸生产反应”或“反应”，将制备直接供应琥珀酸生产反应的菌体的培养称为“本培养”，将制备供应该本培养的菌体的培养称为“种培养”。培养所使用的培养基，可以使用上述微生物的培养中所使用的通常的培养基。可以使用例如向硫酸铵、磷酸钾、硫酸镁等无机盐构成的组合中添加肉类提取物、酵母提取物、蛋白胨等天然营养源的一般的培养基。本反应中使用的令上述微生物增殖而得到菌体的培养条件不受限制，但通常，如果是棒状杆菌，只要是生长最适温度就无特别限制，但通常为25V以上，另一方面，通常为35°C以下，优选32°C以下，特别优选30°C以下。培养时，通气、搅拌同时供氧。生长最适温度是指琥珀酸生产所使用的条件中生长速度最快的温度。培养时间只要是得到规定量的菌体的时间就没有特别限制，通常在6小时以上、96小时以下。此外，作为更适合制造琥珀酸的菌体制备方法，还可以使用日本专利特开2008-259451号公报中记载的短时间内重复交替碳源的枯竭和充足来进行培养的方法。培养后的菌体，可以将含微生物的培养液直接用于琥珀酸生产反应，也可以将菌体通过离心分离、膜分离等回收后再用于反应。作为本发明的制造方法所使用的微生物，还可以使用该菌体的处理物。作为菌体的处理物，可列举例如，将按上述方法培养、收集的菌 体用丙烯酰胺、卡拉胶等固定的固定化菌体、将菌体破碎后的破碎物、该离心分离的上清液或将该上清液通过硫酸铵处理等部分纯化后的部分。<培养所使用的糖>培养中使用普通的糖。培养所使用的糖，只要是上述微生物能同化吸收并生产琥珀酸的糖就没有特别限制，通常使用半乳糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖、蔗糖、淀粉或纤维素等碳水化合物，甘油、甘露醇、木糖醇或核糖醇等多元醇等发酵性糖类物质，其中优选葡萄糖、蔗糖、果糖或甘油，特别优选选葡萄糖或蔗糖。此外，也使用含有上述发酵性糖类物质的淀粉糖化液或糖蜜等，具体地优选从甘蔗、甜菜或糖枫等植物中榨取的糖液。这些糖可以单独或组合使用。上述糖的使用浓度没有特别限制，在不阻碍琥珀酸的生产的范围内尽可能提高是有利的，相对于反应液，通常在5%(W/V)以上，优选在10%(W/V)以上，另一方面，通常在30% (W/V)以下，优选在20% (W/V)以下。此外，也可以应对随着反应进行的上述糖的减少，进行糖的追加添加。<琥珀酸生产反应>本发明的琥珀酸生产反应的特征在于，在令具有琥珀酸产生能力的微生物和糖反应的琥珀酸的制造方法中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比(mmol-02/mol-SA)在
0.I以上、240以下，反应中的微生物的倍增时间在40小时以上。<氧移动速度>本发明中的氧移动速度，只要后述氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比在上述范围之内就没有特别限制，也可以是不向反应槽供给氧的厌氧气氛(氧移动速度为0的条件)。此处，不向反应槽供给氧的厌氧气氛(氧移动速度为0的条件)可以通过例如，将容器密闭而在不通气的条件下反应、供给氮气等惰性气体使其反应，或通入含有二氧化碳气体的惰性气体等方法获得，但存在琥珀酸收率或琥珀酸生产速度低下、丙酮酸等副产物增加造成的琥珀酸纯化成本增加，以及为了实现氧移动速度为0而将反应槽用氮或不含氧的惰性气体等置换而使成本增加等问题。另一方面，如果氧移动速度过高，也会产生琥珀酸的糖消费碳收率低下或琥珀酸生产速度低下、副产物醋酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，还有为了实现高氧移动速度而将搅拌数设定得高和/或通气速度设定得高所带来的动力成本增加等问题，所以氧移动速度通常为0.01 [mmol 02/L/hr]以上，优选为0. 02 [mmol 02/L/hr]以上，更优选为0.05 [mmol 02/L/hr]以上,另一方面,通常为5 [mmol 02/L/hr]以下,优选为3,更优选为
2.5[mmol 02/L/hr]以下，特别优选为 2[mmol 02/L/hr]以下。本发明中，反应液中的氧移动速度可以通过将溶液用氮气置换，降低溶解氧的浓度后，进行通气或搅拌，从溶解氧浓度的变化求出的方法(Wise ff. S. J. Gen. Microbiol.，1951，vol. 5，pp. 167-177)等测定。本发明中，向反应槽供给氧的方法没有特别的限制，可以使用例如，通气的方法或向液体中溶解氧的方法。优选通气的方法。也可以适当进行反应液的搅拌而调节至上述氧移动速度的范围内。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以仅通过反应液的搅拌使氧溶解，也可以进行反应液的搅拌和通气，也可以只进行通气使氧溶解。此外，还可以设置用于有效地产生基于搅拌的乱流的挡板。 本发明中的通气方法没有特别限制，可举出令含氧气体与反应液或进料液接触的方法。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以直接使用纯氧或空气等含氧气体，也可以混合使用。此外，纯氧或空气等含氧气体还可以与氮气或二氧化碳等气体任意混合。此外，还可以将用过一次的气体回收，再度使用。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以将含氧气体用能调节通气量的压缩机，通过孔喷射器(orifice sparger)、喷嘴喷射器(nozzlesparger)或环喷射器(ring sparger)等喷射器(通气管)，以及多孔管等向反应槽的气相部通入气体，也可以向反应液中直接通气。此外，为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以通过将氧气溶解于反应中进料的进料液中，再供给该液体而间接地添加。也可以在向反应液或进料液等通气时，将气体从配管等直接向液体中流通，可以使用喷射器等气流扩散装置，也可以使用膜等。为了调节至上述氧移动速度的范围内，可以测定通入气体或排除气体的流量、压力或组成，反应液或进料液中的氧浓度或氧化还原电位或进料液的流量等中的任一种，同时调节任一种。<琥珀酸生产速度>本发明中，所谓琥珀酸生产速度(mmol/L/hr)是指每IL在I小时中生产的琥珀酸的量，如果过小则有需要长反应时间造成的成本增加或琥珀酸以外的副产物的产量增加造成的琥拍酸收率低下的倾向，因此通常为lmmol/L/hr以上,优选5mmol/L/hr以上。另一方面，虽然不被上限所限制，但通常为1000mmol/L/hr以下,优选700mmol/L/hr以下,更优选300mmol/L/hr 以下。<氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比>本发明中，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比(mmOl-02/mOl-SA)如果过小，则带来如下问题较之于适合琥珀酸生产的氧供给量减小，琥珀酸收率下降或琥珀酸生产速度下降，副产物丙酮酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，为了实现非常小的氧移动速度条件的要求而将反应层用氮置换等带来的成本增加等，因此在0. I以上，优选0. 2以上，更优选0.3以上。另一方面，如果这个比过大，则产生如下问题较之于适合琥珀酸生产的氧供给量增大，琥珀酸收率下降或琥珀酸生产速度下降，此外，副产物醋酸的产量增加造成的琥珀酸纯化成本增加，氧移动速度增大引起的伴随着菌体增殖的副产物增加，琥珀酸生产速度减小带来的反应时间增加所造成的成本的增加等，因此在240以下，优选200以下，更优选150以下，进一步优选100以下，特别优选50以下。将氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比作为指标的原因是如下考虑的。通常，琥珀酸生产反应中，为了使琥珀酸收率最大，理论上较好的是使菌体的增殖速度无限小，不供给氧的厌氧环境最佳。但是，本发明的结果显示出，在厌氧环境下的琥珀酸生产反应中，丙酮酸等副产物量变大、琥珀酸收率降低，通过供给微量的氧气，副产物量降低、琥珀酸收率提高，进而琥珀酸生产速度提高。这样，我们判断，在伴随着副产物的产生的琥珀酸生产中，不是在只考虑了琥珀酸生产的理论上优选的厌氧条件下，而是在供给微量氧气的条件下，琥珀酸生产能力得以提高。这意味着，琥珀酸生产反应中，必须控制合适的氧供给。但是仅将氧移动速度作为指标设定某个范围的话，例如，如果在琥珀酸生产速度小的反应时供给了适合高琥珀酸生产速度的氧量，琥珀酸生产变成了好氧状态，导致上述那样的醋酸等副产物增加，所以不理想，因此认为将表示对应于琥珀酸生产速度的氧量的氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比作为指标是优选的。此处，我们认为本发明中，作为主要显示相对于具有琥珀酸生产能力的微生物的琥珀酸代谢需要多少氧量的指标，控制氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比的值是重要的。 该氧移动速度相对于琥珀酸生产速度之比，尤其是可以成为工业上的琥珀酸生产反应的条件设定时的优选指标。工业生产时，琥珀酸生产速度可以根据原料成本或制造设备成本来选择、变化优选的速度。该指标在这样的条件的变更中可以容易地对应，是有用的。〈倍增时间〉本发明中，所谓倍增时间是指，上述微生物的菌体数增加到2倍所消耗的时间，以某2点的菌体浓度(OD)或干燥菌体重量的值为变量，用以下计算式(I)表示。[数I]


一种琥珀酸的制造方法，其特征在于，是使具有琥珀酸产生能力的微生物与糖反应的琥珀酸制造方法，氧移动速度相对于琥珀酸生产速度的比(mmol-O2/mol-SA)在0.1以上、240以下，反应中微生物的倍增时间在40小时以上。