专利名称：聚酰胺胺、其部分降解产物或其复合物-Math1基因纳米微粒以及在治疗耳聋的应用的制作方法近年来，以非病毒材料为基因载体的基因治疗研究引起了广泛的重视，其中用阳离子聚合物和基因复合形成纳米微粒来模拟类似病毒的结构作为基因载体就是ー个重要方面。纳米微粒(nan0partiCle，NP)基因载体是由高分子材料合成的ー种固态胶体纳米级微粒载体，其能将DNA、RNA、PNA (肽核苷酸)、dsRNA (双链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米微粒之中或吸附在纳米微粒表面，通过细胞胞吞使纳米微粒进入細胞内，经高分子材料的降解逐渐释放出基因治疗分子，从而发挥其基因治疗的效能。大量研究表明，在一定条件下，聚阳离子可与基因在水溶液中复合形成纳米微粒。 同吋，可以在聚阳离子链上引入具有特殊功能的基团(如半乳糖、转铁蛋白)，从而使聚阳离子/基因纳米微粒具有类似病毒的功能，如受体调节内化、进入細胞核等。聚阳离子作为基因载体在血浆的电解质环境中仍是稳定的纳米微粒，且在冷冻干燥储存过程中并不失活。聚酰胺胺(PAMAM)是ー种代表性的人工合成树枝状聚合物，在生理pH值范围内， 其表面氨基基团会携带正电荷，是常见的阳离子高分子聚合物。它具有独特的球形外形，以及高度分支的纳米级树枝状结构。该分子由三部分組成中心核、内层重复的亚单元和外层的氨基端，它具有良好的流体力学性能，易于加工成型；同时它还具有低粘度、高水溶性、可混合性、高反应性等特点，相比之下，其它阳离子聚合物如壳聚糖等，其质子化需要较低的 PH值，而且粘度较大，水溶性欠佳。在生物性能方面，聚酰胺胺具有无免疫性、毒性较低、可通过尿和粪便排出体外的优异性能。随着代数的増加，PAMAM树枝状聚合物末端的氨基基团增加。氨基基团在生理PH 下，发生质子化，使PAMAM具有聚阳离子特征。带电荷易干与抗体、核酸和荧光基团通过静电作用形成稳定的复合物(Haensler and Szoka, 1993 ；Bielinska et al.，1996 ；Wang et al.，2000)。研究表明，PAMAM可以介导核酸、质粒等进入細胞中，并获得目的基因表达。其机理是带正电荷的PAMAM/DNA复合物易于粘附于负电荷的細胞表面，利于其进入細胞内部并表达.(Dennig J and Duncan Ε, 2002) PAMAM对于细胞的转染效率和细胞毒性会随代数的增加而同时增加，该特性与被转染的靶细胞有关。耳蜗是人类感受外界声音刺激的唯一器官，同时也是ー种高度分化的功能特化器官，其内部的毛细胞是感受声音振动的机械-电感受器，对维持听觉及平衡觉有重要作用。任何原因导致的内耳毛細胞的变性、坏死均可引起听觉和平衡功能障碍。传统观点认为鸟类及哺乳类动物的耳蜗毛細胞在胚胎期完成分化，且不能自发再生，一旦发生由于耳蜗毛细胞损失而导致的耳聋就很难自然恢复听力，必须通过人为的治疗才有可能恢复，而这一直是个世界性的难题。近年来有研究表明，耳毒性药物和噪声损伤哺乳动物内耳毛细胞后，毛細胞可以经诱导再生。许多生长因子在毛細胞再生中起重要作用，如转化生长因子 (TGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等等。Mathl (Mammalian atonal homolog 1)是ー种碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因， 其是果蝇Atohl基因的小鼠同源基因。Mathl基因全长1. 181Λ，含一个外显子，mRNA长 106^ρ，编码由3M个氨基酸组成的蛋白，即转录因子Mathl，分子量为38. 2kDa0Mathl基因是毛細胞分化成熟的必需基因，在毛細胞再生过程中有重要作用(Bermingham NA, Hassan ΒΑ, Price SD et al. ,Mathl :anessential gene for the generation oi inner ear hair cells. Science, 1999,284 :1837-1841)。由于病毒载体的局限性，利用病毒载体在动物体内进行内耳毛細胞再生的研究无法应用于临床。纳米微粒作为ー种新型基因载体，以其无免疫原性，低毒、装载容量大、制备容易且结构稳定、利于改造和修饰等优势，更有利于毛細胞再生的进ー步研究及临床应用。目前，纳米微粒基因载体的内耳导入途径主要是鼓阶打孔和圆窗膜注射，通过直接注射和微渗透泵将该载体导入外淋巴液。这两种方式虽然有效，但都是侵袭性操作，破坏耳蜗鼓阶，存在诱发炎症、外淋巴漏、损坏听力的危险。由于圆窗膜具有半透膜的特性分泌和吸收功能，而纳米微粒基因载体具有靶向性和通透性，作为ー种新技木，有望实现圆窗膜跨膜导入。然而，至今未见PAMAM及其衍生物-Mathl基因纳米微粒的制备以及用 PAMAM-Mathl基因纳米微粒转染体外培养细胞或在体转染耳蜗并且表达Mathl基因的报导。
本发明的目的在于提供ー种PAMAM-Mathl基因纳米微粒，实现基因的递送。根据本发明的一方面，该PAMAM-Mathl基因纳米微粒包括PAMAM和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0. 10-0. 25，zeta电位约为10_50mV，包封率为 90-95%。该PAMAM-Mathl基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高 Mathl基因的表达和递送能力。本发明的另ー目的在于提供ー种PAMAM部分降解产物-Mathl基因纳米微粒，实现基因的递送。根据本发明的一方面，该PAMAM部分降解产物-Mathl基因纳米微粒包括PAMAM部分降解产物和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0. 10-0. 25，zeta电位约为10-50mV，包封率为90-95%，该PAMAM部分降解产物是通过热处理获得的，特別是，在 500C -100°C下将PAMAM在水溶液中加热，更特別是加热2_48小吋。本发明的另ー目的在于提供ー种PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒，实现基因的速达。根据本发明的一方面，该PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒包括PAMAM复合物和如图4所示的质粒，其粒径为100-200nm，分散指数为0. 10-0. 25，zeta电位约为10_50mV， 包封率为90-95%，该PAMAM复合物是由PAMAM或其部分降解产物与环糊精在水溶液中震荡混旋获得的。特别是，以质量比为1 10到10 1混合，更特别是混旋IOs到30s。该PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒的細胞毒性明显更低。本发明的又一目的在于提供本发明的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒的制备方法。该方法简单易行，原料易得，无须使用有机溶剂和醛类作为交联剂，反应迅速，反应条件温和，重复性好，稳定性高，实用性強，具有广泛的应用性。根据本发明的一方面，所述PAMAM、PAMAM部分降解产物或其复合物-Mathl基因纳米微粒是通过将上述聚合物之一与如图4所示的含Mathl基因的质粒进行复凝聚而制备的。特別地，在室温下，将PAMAM、PAMAM部分降解产物或其复合物加入到PBS溶解的含 Mathl基因的质粒中，在静电作用下，聚合物分子包裹含Mathl基因的质粒而生成纳米微粒混悬液。具体地，该方法包括下述步骤(1)制备浓度为500-1500 μ g/ml的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物的水溶液；(2)制备浓度为120-720 μ g/ml的含Mathl基因的质粒的PBS溶液；(3)以N/P比(PAMAM氨基/质粒磷酸基)为30 1到1 10混合步骤(1)、⑵ 的溶液以进行复凝聚反应得到PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒混悬液。其中，PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物的分子量是500Da lOOOOOODa。其中，PAMAM的代数是1-10。其中，PAMAM部分降解产物是通过热处理反应进行部分降解(或断裂)获得的，其可进ー步提高基因体外转染水平。其中，PAMAM复合物是由PAMAM或PAMAM部分降解产物与环糊精复合获得的，以降低細胞毒性，特別地，以质量比为1 10到10 1在水溶液中混旋获得。其中，含Mathl基因的质粒是如图4所示的质粒。与现有技术相比，本发明制备的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl纳米微粒至少具有以下特点(1)选用的树状分子具有稳定、黏度低、水溶性好、无免疫原性、在生理pH范围内质子化、对生物活性物质的转运效率高等优点。(2)制得微粒的粒径大小可以调节，尺寸较均一。(3)制得微粒的表面带有正电荷，利于进行表面修饰。 (4)制得的PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物与含Mathl基因的质粒通过静电作用复合制备纳米微粒，一方面能増加Mathl基因的稳定性，使Mathl基因最终被递送到細胞内，另ー方面，增强与細胞膜的作用及保护Mathl基因免遭核酸酶的降解破坏。(5)制得的PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒，在进行体内或体外细胞转染时，具有更高的转染效率和更低的細胞毒性。(6)通过调节各种成分的比例很容易实现对基因传递的控制。本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl 基因纳米微粒在转染体外培养的HEK293細胞中的应用。本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl基因纳米微粒在转染离体培养的耳蜗组织中的应用。本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl 基因纳米微粒在转染在体耳蜗中的应用。本发明的又一目的在于提供PAMAM、PAMAM部分降解产物或PAMAM复合物-Mathl 基因纳米微粒在耳聋方面的应用，该纳米微粒可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性耳聋。图1示出PAMAM-Mathl纳米微粒的形成示意图；图2示出PAMAM复合物-Math 1纳米微粒的透射电镜图；图3示出PAMAM复合物纳米颗粒的粒径分布；图4示出质粒PRK5_MathI-EGFP的图谱；图5示出Mathl基因的核苷酸序列；图6示出电泳图谱，其中泳道1 标记；1 未经转染对照组；2 利用根据实施例9 的转染组；3 利用根据实施例10的转染组；4 利用根据实施例4的转染组；图7示出EGFP在转染有PAMAM复合物-Mathl纳米颗粒的细胞中的表达；图8示出耳后入路圆窗膜显微注射导入，a 耳后入路寻找听泡的解剖标志，黑箭头示面神经、蓝星示胸锁乳突肌；b 将胸锁乳突肌向上分离牵开，可见听泡后壁(蓝色箭头)及ニ腹肌后腹(蓝星)；c:ニ腹肌后腹(蓝星)向后分离后暴露听泡后上骨壁(黑箭头指示方向)；d 磨除此处听泡后上、面神经入听泡处后方骨壁；e 打开听泡后可见圆窗龛 (黑箭头示)、镫骨动脉(蓝箭头示)；f 刺破圆窗膜显微注射(黑箭头示针头)；以及图9示出表达了 Mathl-EGFP蛋白的内耳组织，1 内毛細胞区域；2 柱細胞区域； 3 外毛細胞区域。用Hpal和Xball酶对含有EGFP基因的质粒pEGFP_C2 (Invitrogen公司) 和实施例1的PRK5-Mathl质粒分别进行双酶切，纯化回收，经T4连接酶连接构建 PRK5-MathI-EGFP 质粒。实施例3 :PRK5-MathI-EGFP的扩增和纯化取5μ 1质粒PRK5-Mathl_EGFP，加入100μ 1感受态大肠杆菌DH5a細菌，混勻，冰浴30分钟，42°C热休克1分钟，冰浴2分钟，加入800 μ 1 LB培养基，37°C培养1小吋。取 100 μ 1菌液涂布于含有氨苄青霉素的平板，37°C倒置培养16小吋。挑取平板中的单菌落， 接种于5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C恒温振荡过夜，使細菌生长至对数晚期。按照质粒提取试剂盒OiIAGEN)说明书提取质粒。取质粒0. 5 1 μ g，加入内切酶5U (不超过总反应体积1/10)，反应体积20 μ 1，适温水浴池，取少量样品进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切結果。实施例4 将100 μ 1 的 500yg/ml 的 PAMAM 溶液カロ 入至Ij 100 μ 1 720 μ g/ml 的 PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0. 5小时得到PAMAM-PRK5-MathI-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为 118. 6nm，分散指数0. 187 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为42 士 1. 17 (mV)。实施例5 将50°C热处理24h而部分降解的100 μ 1的500 μ g/ml的PAMAM溶液加到100 μ 1 720 μ g/ml的PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0. 5小时得到PAMAM-PRK5-MathI-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为105. lnm，分散指数为0. 206 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为39 士 1. 12 (mV)。实施例6 将50°C热处理24h而部分降解的100 μ 1的500 μ g/ml的PAMAM溶液加到50 μ 1 720 μ g/ml的PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0. 5小时得到PAMAM-PRK5-MathI-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为104. 2nm,分散指数为0. 198 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为41. 6 士 1. 19 (mV)。实施例7 将100°C热处理24h而部分降解的100 μ 1的500 μ g/ml的PAMAM溶液加到25 μ 1 720 μ g/ml的PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0. 5小时得到PAMAM-PRK5-MathI-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为102. 9nm,分散指数为0. 202 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为42. 9 士 1. 23 (mV)。实施例8 将50°C热处理48h而部分降解的100 μ 1的500 μ g/ml的PAMAM溶液加到100 μ 1 720 μ g/ml的PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0. 5小时得到PAMAM-PRK5-MathI-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色测定其粒径为101. 5nm，分散指数为0. 211 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为37 士 1. 28 (mV)。实施例9 将β -环糊精加入到PAMAM溶液，其质量比为1 10，混合10s。然后将100 μ 1 的 500ug/ml PAMAM 复合物加到 100 μ 1 720 μ g/ml 的 PRK5_Mathl-EGFP 质粒的 PBS 溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育0.5小时得到PAMAM复合物-PRK5-Mathl-EGFP质粒的纳米混悬液。动态光散色測定其粒径为129. 2nm，分散指数为 0. 245 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为35 士 1. 31 (mV)实施例10 将β-环糊精加入到50°C热处理24h而部分降解的PAMAM溶液，其质量比为 10 1，混合 10s。然后将 IOOul 的 500ug/ml PAMAM 复合物加到 100 μ 1 720 μ g/ml 的 PRK5-Mathl-EGFP质粒的PBS溶液中，迅速在旋涡混合器上混合30秒后，室温下继续孵育 0. 5小时得到PAMAM复合物-PRK5-Mathl-EGFP质粒的纳米混悬液动态光散色測定其粒径为 130. 2nm，分散指数为0. 247 ；zeta电位分析仪测定其zeta电位为39 士 1. 19 (mV)实施例11 =PAMAM复合物_PRK5_MathI-EGFP纳米微粒在体外培养HEK293细胞的转染及Mathl蛋白的表达转染前一天将HEK 細胞接种于35mm培养皿，待细胞达80%融合时进行转染。 转染时使用含10% FBS的DMEM培养基冲洗两遍，每皿加入37°C预热的2ml含10% FBS的 DMEM培养基。将按上述实施例制备的纳米混悬液轻轻晃动以充分混勻(PAMAM复合物納米浓度为4ng/μ 1)，然后向每培养皿加入300 μ 1纳米溶液，轻轻晃动培养皿以充分混勻，于 37°C,5% CO2培养箱培养M-48小时。收集于36. 50C 士0. 5°C培养48小时的細胞(约IO7个)，用1Trizol法提取 RNA。加入30 μ 1 DEPC水溶解RNA，取2 μ 1用紫外分光光度计测定RNA含量后，于_80°C的冰箱中冻存RNA。PCR 扩增模板变性于65°C将上述步骤中制备的RNA加热5min以熔化ニ级结构，然后在冰上立即冷却。模板变性反应体系
组分
体积
RNA
OligodT (20)
dNTPs
模板
ddH20
5.0μ1 Ι.ΟμΙ 2.0μ1
3.0μ1 (200ng) 4.0μ1 反转录反应体系


本发明涉及了一种聚酰胺胺和/或聚酰胺胺复合物-Math1基因纳米微粒、其制备方法及其应用，该基因纳米微粒通过将聚酰胺胺或聚酰胺胺复合物与含Math1基因的质粒进行复凝聚而制备。该基因纳米微粒的粒径可控、尺寸均一、利于表面修饰、可提高Math1基因的表达和递送能力，可以用于由于噪声、药物中毒等原因引起的毛细胞缺失而导致的感音神经性耳聋。