专利名称：一种反硝化细菌培养及测定水体硝态氮同位素组成的方法地下水是我国经济和社会发展以及人民生活所必需的、不可替代的重要资源。全世界超过15亿的人口主要依靠地下水作为饮用水。我国部分城市和广大农村地区，地下水往往是唯一的供水水源。近些年来，硝态氮污染地下水已是国际上普遍关注的问题。欧美许多国家和地区都存在地下水硝态氮含量严重超标的现象，我国许多地区也在不同程度上受到了硝态氮的污染，尤其是农村地区硝态氮污染非常普遍，且有日益严重的趋势。硝态氮 本身对人体虽无直接危害，但被还原为亚硝态氮后却可诱发高铁血红蛋白症、消化系统癌症等疾病而威胁人体健康。因此，为保证供水安全，有效治理被污染的地下水体，确定地下水中硝态氮污染的来源非常重要。在人类活动影响下，硝态氮污染来源复杂，既有天然源，又有人为源，一般认为地下水中大量的硝态氮主要来源于居民生活污水与垃圾粪便、化肥、エ业废水、大气氮氧化合物干湿沉降以及污水灌溉等。判断地下水no3_n污染源的方法很多，其最简单和传统的方法是通过调查污染区的土地利用类型并结合地下水化学特征分析辨明污染源。但这一方法得到的结果较为粗糙。这主要是因为不同来源的N通过氮转化作用形成易迁移的NO3-流入地表水和地下水中。不同来源N03_的化学形式都是N03_，没有什么区別，单纯从化学形式上很难区分其确切来源。但是，在同位素水平上，N03_可进ー步区分为15N03_和14no3_、n18o_3和N16CT3，不同来源的NO3-具有不同的15N/14N和180/160比值特征，这些比值可通过同位素质谱仪精确測定，因此，硝酸盐中氮氧同位素组成的差异为识别硝酸盐的污染来源提供了直接手段，目前常用測定方法主要有高温燃烧法及反硝化细菌法，而反硝化细菌法具有低成本、前处理简单、所需样品量少等优点，已成为先进的硝酸盐氮氧同位素测试方法。目前国内反硝化细菌法测试硝态氮同位素应用还较少，而已有的文献方法也存在如下弊端(I)反硝化细菌的培养需要特制培养瓶，这在普通实验室难以找到；(2)反硝化细菌富集培养后是否将培养液中的硝酸盐完全转化会N2O,而不会影响后续样品測定，目前此指标检测方法缺乏；(3)与样品产生的N2O气体不能直接进行分析，需要将N2O气体一次性全部注入连接在质谱仪上的样品瓶后再进行分析，需要样品量大。综合分析目前国内没有形成一种详细可操作的反硝化细菌法测试水体硝酸盐氮同位素的方法，因而限制了这一方法在水体硝酸盐污染溯源与治理中的应用。
本发明针对现有技术的不足，提供ー种反硝化细菌的培养及利用该反硝化细菌测定水体硝酸盐氮同位素组成的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是ー种反硝化细菌的培养及測定水体硝酸盐氮同位素方法，其特征在于，包括以下步骤(I)反硝化细菌的富集培养将缺乏N2O还原酶活性的反硝化细菌接种含有N03_的TSB灭菌培养液在摇床上(26°C，180rpm)培养，进行反硝化细菌的富集培 养；(2)检测反硝化细菌是否将培养液中N03_转化完全取步骤(I)所得菌液与磺胺显色液进行显色反应，如果菌液变为粉红色，说明反硝化细菌并没有将培养液中N03_完全转化为N2O,而是停留在N02_阶段，此瓶抛弃处理；如果菌液不变色，可以进行后续实验；(3)反硝化细菌的浓缩将步骤(I)及通过步骤(2)检测的菌液在超高速离心机30000rpm，18°C离心20分钟，倒出上层清液，剩余菌体用无N03_的TSB培养液悬浮，浓缩成2倍的菌液；(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N2O取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为12mL试管中，每个试管用高纯氦气(流速为10 20mL/min)吹扫3h以上；(5)样品中NO3-转化为N2O在步骤⑷的试管中用注射器注入小于4mL的水样(总硝态氮量为O. 5 μ g)，样品注入后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入设置26°C的恒温箱3h-24h ;培养时间完毕后注入O. IOmL浓度为lOmol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO2 ；(6) N2O氮同位素测定将步骤(5)所得试管产生的N2O气体利用痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱仪(IRMS)測定，得到N2O氮同位素组成测定值。(7)氮同位素测试结果的校正δ N 的标准米用 δ NUSGS34 = _1· 8%。，δ Nusgs32 = +180%。；氮同位素校正方程如下+180%。= mX δ 15NUSGS32_meas+b①-I. 8%。= mX δ 15N腸34_meas+b ②，根据这两个标准样品的真实值⑴和测定值(M)，得到m和b，从而得到δ15Ν的校正方程。然后重新培养反硝化细菌，进行下一批样品的測定。步骤(I)所说的TSB培养液(含Ν03_)配制方法为30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，I. Og KNO3,0. 5g (NH4)2SO4,6. 15g K3PO4 · 3H20, IOOOmL 去离子水，分装到 500mL 盐水瓶中高压灭菌60min。步骤(I)所说的盐水瓶为总容积为580mL的医院常用输液瓶，瓶盖采用橡胶塞，盐水瓶内装有460mL-480mL带有N03_的TSB培养液，121°C灭菌60分钟，反硝化细菌转接后，将瓶塞用封ロ膜密封，防止与外界的空气交換。步骤⑵所说的磺胺显色液配制方法为4g磺胺，IOmL优质纯85%磷酸，O. IgN-I-萘基こニ胺盐酸盐，定容到IOOmL,应为无色，如果变成粉红色就不能再用。步骤(3)所说的无NO:的TSB培养液配制方法为30g TSB, 0. 5g (NH4) 2S04,4. 9gKH2PO4, 2000mL去离子水,分装到IOOmL的血清瓶中，高压灭菌60min备用。步骤(4)所说的试管为内径IOmm高IOOmm的试管,采用特氟龙娃胶垫及螺旋盖。步骤(4)所说的高纯氦气吹扫采用氦气吹扫仪，试管倒立插在氦气针上，另外在硅胶垫上插ー个8cm长25gauge的针头，将试管中的空气及菌液中的N2O用氦气置換出。步骤(5)所说的水样加入量如果大于4mL，就需要在试管垫上加一个排气针以防止压カ过大。步骤(6)所说的痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱仪(IRMS),TracsGas配有Gilson自动进样器，高纯氦气为载气，流量为50-60mL/min，參考标准气体为校正过的99. 9% N2O气体。将步骤(5)所得试管放置于自动进样器配置的试管架上，通过Gilson自动进样器将N2O气体输送至TraceGas,经TraceGas提取纯化和捕集N2O气体,最后由同位素比质谱仪测定氮同位素组成。 相对于现有技术，本发明具有以下优良效果I、采用易获得的普通盐水瓶培养反硝化细菌，減少了特制培养瓶的寻找、订制生产等一系列繁琐手续，同时降低了反硝化细菌的培养成本；2、本发明采用磺胺显色液检测反硝化细菌培养过程中是否将培养液本身的硝酸盐消耗完毕，操作简单，排除了培养液内部硝酸盐对样品硝酸盐的影响，提高了測定结果的可信度。3、本发明的方法測定硝酸盐氮同位素组成省时省力，降低了测试成本，为硝酸盐污染溯源工作提供了重要的研究手段。4、本发明的方法针对了我国目前水体硝酸盐污染严重亟需治理的现状，具有科学性、简便性、可操作性强的优势，推广前景广阔。，以对本发明的方法进行详细的说明，但本发明的保护范围不限于以下的实施介绍，凡依照本发明的方法所作的等效的变化或变通，都应视为本发明保护的范畴。实施例I :ー种反硝化细菌培养及測定水体硝态氮同位素组成的方法，包括以下步骤(I)反硝化细菌的富集培养在每升去离子水中加入30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，I. Og KNO3,O.5g(NH4)2SO4,6. 15g K3PO4 · 7H20,分别取480mL装到两个盐水瓶中，另外取2个5mL装到试管中，胶塞封ロ，高压灭菌60min，构成反硝化细菌富集培养液；将缺乏N2O还原酶活性的反硝化细菌致金色假单胞菌P. aureofaciens接种到5mL有N03_的TSB灭菌培养液的试管中，在摇床上(26°C，180rpm)培养一天，第二天将这5mL菌液转接到含N03_的480mLTSB灭菌培养液的盐水瓶中并在摇床上(26°C，180rpm)培养一周，进行反硝化细菌富集培养；(2)检测反硝化细菌是否将培养液中N03_转化完全步骤(I)所得菌液取lmL，加80 μ L磺胺显色液，如果菌液变为粉红色，说明反硝化细菌并没有将培养液中Ν03_完全转化为N2O,而是停留在Ν02_阶段，此瓶抛弃处理；如果菌液不变色，可以进行后续实验；
(3)反硝化细菌的浓缩将步骤(I)及通过步骤⑵检测的菌液200mL倒入200_mL离心瓶中，在超高速离心机30，OOOrpm, 18°C离心20分钟(细菌应该在瓶底成团状)，弃掉上层清液(注意不要搅乱细菌团)，从ー个100-mL无N03_的培养基中分别取出IOml加到每个瓶中，充分震荡以重新悬浮细菌，把重新悬浮的细菌转移到ー个200-mL的烧杯中，用剰余的无N03_培养基清洗离心瓶，把它们都合到200-mL的烧杯中，加10滴止泡剂B(购自Sigma公司)；(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N2O取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为12mL试管中，试管为内径15mm高IOOmm的试管，采用特氟龙硅胶垫及螺旋盖，每个试管用高纯氦气(流速为10 20mL/min)吹扫3h以上； (5)样品中NO3-转化为N2O在步骤(4)的试管中用注射器注入O. SmL河水样品(硝态氮含量为I. 58mg/L)，样品注入后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入恒温箱26°C过夜培养。第二天注入O. IOmL浓度为lOmol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO2 ；(6) N2O氮同位素测定将步骤(5)所得试管产生的N2O气体利用痕量气体分析仪(TraceGas)-同位素比质谱仪(IRMS)測定，得到测定值δ 15N = -2. 35%0。(7)氮同位素测试结果的校正δ 15N 的标准采用 δ 15Nusgs34 = -I. 8%0，δ 15Nusgs32 = +180% ；氮同位素校正方程如下+180%。= mX δ 15NUSGS32_meas+b①-I. 8%。= mX δ 15N腸34_meas+b ②，根据USGS34和USGS32的测定值和真实值，得到δ 15N的校正方程为T =
I.07*Μ+5. 56，从而得到该河水样品的硝态氮δ 15N = 3. 03，根据文献，这个值溯源表明该河水硝酸盐污染来自于化肥。由此可见，用本发明的方法测试河水硝态氮同位素组成是完全可行的。实施例2 ー种反硝化细菌培养及測定水体硝态氮同位素组成的方法，其具体操作步骤为步骤(I)到(3)同实施例I。(4)在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的
N2O取步骤(3)所得浓缩菌液3mL注入容积为20mL钳ロ顶空样品瓶中，每个样品瓶用高纯氦气(流速为10 20mL/min)吹扫3h以上；(5)样品中NO3-转化为N2O在步骤(4)的试管中用注射器注入O. 5mL地下水样品(硝态氮含量为25. 75mg/L)，样品注入后，上下颠倒以充分混匀；试管倒置放入恒温箱26°C过夜培养。第二天注入O. IOmL浓度为lOmol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO2 ；(6) N2O氮同位素测定将步骤(5)每个顶空样品瓶产生的N2O气体用气密性注射器抽取2mL注入提前抽真空的试管中，通过Gilson自动进样器将N2O气体输送至TraceGas,经TraceGas提取纯化和捕集N2O气体，最后由同位素比质谱仪测定氮同位素组成，得到测定值δ 15N = 6. 20%0。步骤(7)同实施例1，得到该地下水样品的硝态氮δ 15N真实值为12. 21，根据文献，这个值表明该地下水样品中硝酸盐污染主要来自于粪肥。由此可见，用本发明的方法测试地下水硝态氮同位素组成是完全可行的。实施例3 ー种反硝化细菌培养及測定水体硝态氮同位素组成的方法，其具体操作步骤为(I)反硝化细菌的富集培养在每升去离子水中加入30g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)，I. Og KNO3,
O.5g(NH4)2SO4,6. 15g K3PO4 · 7H20，分别取520mL装到两个500_mL三角瓶中，另外取2个5mL装到试管中，胶塞封ロ，高压灭菌60min，构成反硝化细菌富集培养液；采用反硝化细菌菌株为绿针假单胞菌P. chlororaphis,富集培养步骤同实施例2 (I)；步骤⑵到步骤⑷同实施例2 ；(5)样品中NOf转化为N2O在步骤(4)的钳ロ顶空瓶中用注射器注入5mL雨水样品(硝态氮含量为O. 2Img/L)，样品注入后，上下颠倒以充分混匀，并在瓶垫上加ー个排气针，倒置放在一个试管架上放入恒温箱26°C过夜培养。第二天注入O. IOmL浓度为lOmol/L的NaOH，消散细菌后终止反应，同时吸收产生的CO2 ；步骤(6)-(7)同实施例2，得到该雨水样品的硝态氮δ 15N真实值为0. 16，根据文献，这个值表明该雨水中硝酸盐来源主要与空气中氮沉降及地面化肥氨挥发有夫。
0078]由此可见，用本发明的方法测试雨水硝态氮同位素组成是完全可行的。


本发明涉及水体硝酸盐污染治理与控制技术领域，是培养一种反硝化细菌并利用该细菌测定水体硝酸盐氮同位素组成的方法，它包括以下步骤①反硝化细菌的富集培养，②检测反硝化细菌是否将培养液中NO3-转化完全，③反硝化细菌的浓缩，④在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间及去除反硝化细菌菌液中的N2O，⑤样品中NO3-转化为N2O，⑥N2O氮同位素测定，⑦氮同位素测试结果的校正，本次试验完毕；本发明的积极效果是仅采用普通盐水瓶或者三角瓶就可以完成反硝化细菌的培养，磺胺显色的检测提高了测定结果的可靠性，降低了测试成本；并针对了我国目前水体硝酸盐污染严重亟需治理的现状，具有科学性、简便性、可操作性强的优势，推广前景广阔。