专利名称：一种检测海水中弧菌数量的荧光定量pcr方法弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，是海水和原生动物、鱼类等海洋生物 的正常优势菌群。弧菌属的一些种类是致病菌，能引起海洋生物弧菌病，以水产品为中间宿 主，一些弧菌可引起人类腹泻、菌血症和外伤感染，严重时可以致死。多数弧菌属于条件致 病菌，正常情况下它们大量存在于养殖水体中，不引发疾病，当环境条件突然改变或急剧恶 化时，水体中某种致病菌出现爆发，大量繁殖，同时环境恶化导致养殖动物免疫力降低，二 者共同作用引起弧菌病的发生。因此快速准确科学检测海水中弧菌的数量的方法，对海洋 动物的病害预警和防治具有重要意义。传统对海水中弧菌数量的检测方法是利用TCBS培养基对弧菌的特异选择性，针 对性的对水体中的弧菌数量进行定量。但是由于TCBS培养基中的指示剂成分不能进行高 压灭菌，使用时只能溶解煮沸，致使在细菌生长过程中极易滋生霉菌；另外，TCBS对弧菌的 特异性并不高，部分变形杆菌、肠球菌、假单胞菌、气单胞菌、邻单胞菌等也可以在TCBS上 生长，部分弧菌属细菌不能在TCBS培养基上生长；以上两点缺陷导致TCBS培养基对弧菌数 量的定量结果不够准确。其次，弧菌在TCBS培养基上的生长周期要24h以上，因此需要耗 费大量的人力和物力等成本的投入。
本发明解决传统方法中弧菌数量检测的不准确性、周期长及投入大等问题，采用 了荧光定量PCR方法对水体中弧菌总数进行检测，具体内容如下1.检测样品的制备以0. 8 μ m微孔滤膜抽滤待测海水样品1-2L (视海水质量而定，通常情况下养殖水 体1L即可)，所得滤液用0. 2 μ m滤膜过滤，保留0. 2 μ m孔径滤膜作为待测样品。2.特异性引物设计以核糖体16S rRNA基因为靶基因设计针对弧菌属细菌的特异性引物。核糖体 16S rRNA基因是细菌进化过程中最为保守的基因，同时包含多个高变区，作为系统学标记 有着独到的优势，理论上在特定的保守区设计引物，即可得到某种属细菌16S rDNA混合文 库。rRNA为目标基因，从16S rRNA序列中寻找弧菌属保守但特异于其他菌种属细 菌的位点，根据这些位点设计弧菌属细菌特异性引物VFl :GGATAACYATTGGAAACGATG和VRl GCCTTGGTGAGCCATTACCT。经特异性检验，这对引物可以特异性地扩增几乎所有弧菌的16S rRNA的部分片段，片段大小160bp。3.弧菌数量的荧光定量PCR检测方法以溶藻弧菌参考菌株基因组为模板，反应体系为10XBuffer (含Mg2+ 15mM)2y L, dNTP (各 2. 5mM) 1. 6 μ L，上下游引物(10 μ Μ)各 0.4 μ L，TaqDNA 聚合酶(5U/ yUO. lyL，溶藻弧菌DNA模板1. 2 μ L，加水至20 μ L。反应条件预变性95 °C ；变性 950C 30s，退火60°C 30s，延伸72°C 15s，31个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物用 琼脂糖凝胶电泳，切胶后回收PCR产物，产物与载体pMDIS-T连接后转化感受态细胞，涂板 兰白筛选，经PCR鉴定为阳性的菌落进行扩大培养，抽提质粒。根据所得质粒的分子量与质 量浓度，计算其拷贝数浓度(5. 1 X IOltl拷贝/μ L)。将已知拷贝数的质粒用Easy dilution 10倍倍比稀释至5. 1 X 10°拷贝/ μ L作为模板，进行荧光定量PCR扩增，通过3次重复实验， 得到相应的动力学曲线及Ct值与质粒拷贝数浓度对应关系的定量标准曲线。 以SYBR Premix Ex Taq 试剂建立20 μ L反应体系，包括SYBR Green I荧光染料 预混试剂10 μ L、上下游引物各0. 4 μ L，DNA模板1. 6 μ L和去离子水7. 6 μ L。反应条件 95°C预变性30s ；变性95°C 30s，退火60°C 30s，延伸72°C 15s，在延伸步骤未采集荧光信号， 共40个循环；熔解曲线95°C 60s,60°C 30s,95°C 30s，全过程收集荧光信号，所收集数据通 过MxPro软件分析可得到水体样本的弧菌总数。荧光定量PCR方法检测水体中弧菌总数相比于传统方法具有如下优点[1]以16SrRNA为靶基因设计的弧菌属特异性引物能特异性检测出几乎所有弧菌 属细菌，而与其它相关细菌无交叉反应，相比于传统方法检测特异性更好，并且不会发生传 统检测方法中滋生霉菌等现象。[2]本方法检测速度快，包括核酸提取在内整个检测时间仅为3h左右，其灵敏度 达到IO2个细菌就可以得到阳性结果，而传统的检测方法至少需要24h，通常检测灵敏度为 IO1CfVml0[3]本方法对操作环境要求低，不需要进行严格的无菌操作，且结果直观，实验结 束即可得实验数据，不需要进行平板计数。具体实施方案以下所有实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。实施例1、2009年6月，辽东湾海水增养殖区，取辽东湾海水水体样本lml，10倍倍 比稀释3个梯度，每个稀释度分别取50 μ 1涂布于TCBS平板和2216Ε平板上，每个梯度2 个重复，放置30min后，25°C倒置培养24h后，平板计数法计数。TCBS培养基一部分平板滋 生霉菌，无法计数，一部分平板稀释梯度不够，过于密集，无法计数，计数有效的平板得到弧 菌总数为2. 5X107cfu/mL，细菌总数为2. 1 X 107cfu/mL，弧菌总数反而高于细菌总数，在温 度比较高的夏天，霉菌等杂菌尤其易于生长，结果让人不能信服。另取辽东湾海水水体样本1L，用0. 8 μ m微孔滤膜抽滤，所得滤液用0. 2 μ m滤膜过 滤，保留0.2μπι孔径滤膜。滤膜剪碎后放入5ml离心管中，加入3ml无菌水，剧烈震荡。将 离心管置沸水浴中煮沸10min，4000rpm离心lOmin，取上清，12000rpm离心lOmin，上清液 即为水体样本基因组DNA。以所得水样基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。通过 MxPro软件分析得到水体样本的弧菌总数为5. 2 X IO3拷贝/ μ L，即1. 5Χ 104cfu/mL。＝实施例2、2009年6月，仿刺参预警模拟实验，取刺参养殖水体样本1ml，10倍倍比 稀释3个梯度，每个稀释度分别取50 μ 1涂布于TCBS平板和2216Ε平板上，每个梯度2个 重复，放置30min后，25°C倒置培养24h后，平板计数法计数。TCBS培养基一部分平板滋生 霉菌，无法计数，一部分平板稀释梯度过大没有细菌生长，计数有效的平板得到弧菌总数为 8. 6 X 107cfu/mL,细菌总数为1. 3 X 108cfu/mL。相比于荧光定量PCR检测方法，平板计数更 耗费时间和人力物力。另取养殖水体样本1L，用0. 8 μ m微孔滤膜抽滤，所得滤液用0. 2 μ m滤膜过滤，保 留0.2μπι孔径滤膜。滤膜剪碎后放入5ml离心管中，加入3ml无菌水，剧烈震荡。将离心 管置沸水浴中煮沸10min，4000rpm离心lOmin，取上清，12000rpm离心lOmin，上清液即为 水体样本基因组DNA。以所得水样基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。通过MxPro 软件分析得到水体样本的弧菌总数为3. 6 X IO4拷贝/ μ L，即1. 1 X IO5拷贝/mL。实施例3、2008年8月，瓦房店40亩仿刺参养殖池塘，取池塘水体样本1ml，10倍 倍比稀释3个梯度，每个稀释度分别取50 μ 1涂布于TCBS平板和2216Ε平板上，每个梯度 2个重复，放置30min后，25°C倒置培养24h后，平板计数法计数。TCBS培养基一部分平板 滋生霉菌，无法计数，一部分平板稀释梯度不够，过于密集，无法计数，计数有效的平板得到 弧菌总数为8. 4X107cfu/mL,细菌总数为1 X 108cfu/mL。另取池塘水体样本1L，用0. 8 μ m微孔滤膜抽滤，所得滤液用0. 2 μ m滤膜过滤，保 留0.2μπι孔径滤膜。滤膜剪碎后放入5ml离心管中，加入3ml无菌水，剧烈震荡。将离心 管置沸水浴中煮沸10min，4000rpm离心lOmin，取上清，12000rpm离心lOmin，上清液即为 水体样本基因组DNA。以所得水样基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。通过MxPro 软件分析得到水体样本的弧菌总数为2. 9 X IO4拷贝/ μ LJP 7.8X104cfu/mL。本发明采用荧光定量PCR技术快速检测养殖水体中的弧菌数量。以核糖体16S rRNA基因为靶基因设计针对弧菌属细菌的特异性引物，以重组质粒的方式构建荧光定量标准曲线，以Premix Ex TaqTM试剂建立20μL反应体系，包括SYBR Green I荧光染料预混试剂10μL、上下游引物各0.4μL，DNA模板1.6μL和去离子水7.6μL。本发明提供结果直观、特异性好、敏感性高、检测快速，解决了传统检测方法中霉菌滋生导致的结果不准确，弥补TCBS培养基对弧菌定量检测方法特异性差问题，有长远的市场开发和经济投入潜力。