Adh1b基因突变检测特异性引物和液相芯片的制作方法[0002]ADHlB基因称乙醇脱氧酶IB,英文名称为alcohol dehydrogenase-lB,位于4号染色体4q23的长臂上，位于100227526到100242571碱基对之间。ADHlB基因编码的蛋白是乙醇脱氢酶家族的成员，这个酶家族成员可以消化代谢很多物质，包括乙醇、视黄醇、月旨肪醇、脱氢氧化固醇以及脂质过氧化产物。这个编码蛋白由几个α，β和Y亚基的同质和异质二聚体组成，在乙醇氧化中具有很高的活性，并且在乙醇代谢中起着重要的作用。近来，人们还发现ADHlB基因的变异与癌症、肝脏功能紊乱、冠心病、糖尿病并发症、多发性神经病以及头颈部肿瘤也有一定的联系。[0003]目前，ADHlB基因突变检测方法主要有:基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALD1-T0F-MS)，创造酶切位点法PCR (CRS-PCR)，微阵列芯片技术，基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术是一种软电离技术，在蛋白质等生物大分子的检测中有着强大而成熟的功能，但是在核酸检测领域，由于核酸分子本身的特殊性，检测受到一定的限制。创造酶切位点引物的选择余地较小，只能利用多态性位点的近旁序列，而且CRS-PCR产物酶切后，不同等位基因间片段的长短差异只有大约一个引物的长度(一般为20bp~25bp)，如果扩增的长度较大，这样小的片段长度的差异在电泳时不易显示出来，将给基因型的判断带来很大不便。而微阵列技术存在成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较窄，探针的合成与固定比较复杂等问题，因此这些检测方法都难以满足实际应用的需要。
[0004]本发明的目的之一是提供ADHlB基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于单独或并行检测ADHlB基因六种常见基因型A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A和T4973C的野生型和突变型。[0005]实现上述目的的技术方案如下:[0006]一种ADHlB基因突变检测液相芯片，包括有[0007](A).针对ADHlB基因不同突变位点分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每条ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列为:针对A3170G位点的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，针对G3641T位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对 G4564T 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 A5998G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20，针对 G531A 位点的 SEQ ID N0.21 及SEQ ID N0.22，和 / 或针对 T4973C 位点的 SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24 ;所述 tag 序列选自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.12 ；
[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球,所述ant1-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述ant1-tag序列选自SEQ ID N0.25~SEQ ID N0.36，且所述ant1-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
[0009]( C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变位点的目标序列的引物。
[0010]在其中一个实施例中，所述扩增引物为:针对A3170G位点的SEQ ID N0.37及SEQID N0.38，针对 G3641T 位点的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40，针对 G4564T 位点的 SEQIDN0.41 及 SEQ ID N0.42，针对 A5998G 位点的 SEQ ID N0.43 及 SEQ ID N0.44，针对 G531A位点的 SEQ ID N0.45 及 SEQ ID N0.46，和 / 或针对 T4973C位点的 SEQ ID N0.47 及 SEQ IDN0.48。
[0011]在其中一个实施例中，所述ASPE引物为:针对A3170G位点的由SEQ ID N0.1和SEQID N0.13组成的序列及SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.14组成的序列，针对G3641T位点的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.15组成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.16组成的序列，针对G4564T位点的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.17组成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQID N0.18组成的序列，针对A5998G位点的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.19组成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.20组成的序列，针对G531A位点的由SEQ ID N0.9和SEQ IDN0.21组成的序列及由SEQ IDN0.10和SEQ IDN0.22组成的序列，和/或针对T4973C位点的由 SEQ ID N0.11 和 SEQ ID N0.23 组成的序列及由 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.24 组成的序列。
[0012]本发明的另一目的是提供用于ADHlB基因突变检测的特异性引物。
[0013]实现上述目的技术方案如下。
[0014]用于ADHlB基因突变检测的特异性引物，所述特异性引物为，针对A3170G位点的SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0 .14，针对 G3641T 位点的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，针对G4564T 位点的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，针对 A5998G 位点的 SEQ ID N0.19 及 SEQID N0.20，针对 G531A 位点的 SEQ ID N0.21 及 SEQ ID N0.22，和 / 或针对 T4973C 位点的SEQ ID N0.23 及 SEQ ID N0.24。
[0015]本发明的主要优点在于:
[0016]1.本发明所提供的ADHlB基因突变检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100%，且检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。所制备的ADHlB基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及ant1-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、ant1-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。
[0017]2.本发明通过发明人长期积累的设计经验和大量的实验操作，从众多的特异性引物中选取了最优的组合。本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3% ;除了能够检测单个位点突变情况，也能够同时并行检测多个突变位点的突变情况，检测效果一致。
[0018]3.本发明的检测方法步骤简单，6种突变位点检测可通过一步PCR即可完成6条含有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。[0019]4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

[0020]实施例1ADHlB基因突变检测液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]针对ADHlB 基因六种常见基因型 A3170G、G3641T、G4564T、A5998G、G531A 和 T4973C的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1ADHlB基因的ASPE引物序列(tag序列+特异性引物序