川芎嗪与微泡联合低频超声辐照治疗血管再狭窄的用途[0002]经皮冠状动脉介入治疗已从当初的球囊时代进入目前的支架时代，成功的打开血管，给缺血心脏带来血运重建，免受冠状动脉搭桥术，大大减少急性心肌梗死和死亡的发生几率。尽管随着介入治疗技术的成熟和治疗器械的改进，冠状动脉介入治疗的适应症不断扩大，手术成功率也不断提高，但是介入治疗仍然存在无法摒除的弱点，术后再狭窄(RS)的发生严重影响了冠状动脉介入治疗的远期疗效，严重制约了经皮冠状动脉介入治疗技术的发展。研究RS的发生机理是治疗与防治RS的关键。[0003]川芎嗪是从中药川芎中分离的一种生物碱，即四甲基吡嗪。无色针状结晶，具有特殊异臭，有吸湿性，易升华，为治疗血栓等疾病的一种新型药物.有对抗肾上腺素和氯化钾引起家兔离体动脉收缩的作用。能明显增加冠脉流量，降低动脉压及冠脉阻力。有增进微循环的作用。能抑制ADP诱导的家兔体外血小板聚集，对大鼠静脉分路血栓有抑制作用。临床用于治疗缺血性脑血管病(包括脑血栓形成、脑栓塞等)和冠心病心绞痛取得较肯定的疗效。[0004]本发明人意外发现，将川芎嗪与微泡混合静肪注射，再联合低频超声辐照，川芎嗪可降低内膜中血管内皮 生长因子(VEGF)表达，靶向微泡破裂介导的局部药物释放可增加靶区川芎嗪浓度，干预后内皮VEGF表达减少更为显著，内膜增生减轻更明显。川芎嗪通过下调VEGF表达促进内皮修复和抑制内膜增生，从而减轻了内膜增生。本发明人发现川芎嗪微泡联合低频超声辐照后VEGF减少最显著，内膜增生程度低，可有效防治平滑肌细胞增生或血管重塑导致的血管再狭窄。
[0005]本发明的目的在于提供一种川芎嗪联合微泡与超声辐照治疗平滑肌细胞增生或血管重塑导致的血管再狭窄的用途。[0006]为实现本发明的目的，提供如下实施方案。[0007]在一实施方案中，提供了一种川芎嗪在制造治疗血管再狭窄药物中的应用，其特征在于将川芎嗪与微泡混合静脉注射，并联合低频超声辐照。
[0008]在上述实施方案中，本发明的应用，所述血管再狭窄为平滑肌细胞增生或血管重塑导致的血管再狭窄。
[0009]在上述实施方案中，本发明的应用，所述川芎嗪与微泡混合静脉注射是将川芎嗪与微泡制成混悬液，静脉注射，也即川芎嗪微泡混悬液注射液，其中，川芎嗪与微泡的重量比为:(1~2:25~50)，其中，所述微泡为脂质体微泡。
[0010]本发明的应用或用途，所述川芎嗪的有效治疗量为30~80mg，优选有效治疗剂量40 ~80mgo
[0011]在上述实施方案中，本发明的应用，所述混悬液由以下方法制得，该方法包括以下步骤:
[0012]I)脂质体微泡的制备，将卵磷脂与胆固醇按质量比3:1混合，用乙醚溶解，蒸发除尽乙醚成膜，加入5~IOmlPH值为7.4、浓度为0.01M/L的PBS缓冲液(即磷酸缓冲液)，磁力搅拌器洗脱干膜，洗脱液倒入50ml小烧杯，加入两滴司班80、聚乙二醇、葡聚糖，匀速搅拌，6000r/min机械震荡仪震荡10s，再以氮气置换出其中的空气，进行充分振荡至成膜材料充分溶解分散，至溶液充分分散形成稳定体系，得到脂质微泡溶液。
[0013]2)川芎嗪溶液制备，川芎嗪与PBS缓冲液混合，制备出lmg/ml的单纯川芎嗪PBS溶液。
[0014]3)制备川芎嗪微泡混悬液
[0015]将步骤I)的脂质微泡溶液离心，取下层乳白色沉淀与步骤2)的川芎嗪PBS溶液混合制备成lmg/ml的川弯嗪微泡混悬液。
[0016]在上述实施方案中，聚乙二醇与卵磷脂体质量比4:1，葡聚糖与卵磷脂体质量比7:10。
[0017]在上述实施方案中，步骤I)中，卵磷脂胆固醇占0.1~5%重量百分比，卵磷脂与胆固醇的质量比为3:1，聚乙二醇4000占5~10%重量百分比，葡聚糖占I~2.5%重量百分比，司班80占0.01~1%重量百分比,PBS缓冲液占85~94%重量百分比。重量百分比是指占包括缓冲液在内的 所有成膜材料总量的百分比。
[0018]有益效果:川芎嗪、微泡与超声辐照三者联合治疗平滑肌细胞增生或血管重塑导致的血管再狭窄产生协同作用，提高川芎嗪的疗效，三者联合使川芎嗪的疗效比单用川芎嗪更好，更强，更高。



[0019]图1各试验组的髂动脉形态学改变(HE染色，X 40)，ΙΑ、1B、1C、ID、IE、IF分别代
表空白对照组、模型组、微泡联合川芎嗪低频超声辐照组、单纯川芎嗪组、单纯低频超声辐照组、微泡联合低频超声辐照组的髂动脉形态学改变。
[0020]图2各实验组髂动脉新生内膜面积和内中膜面积比改变，注:与F组比较，V P< 0.01 ;与 A 组比较，*P < 0.05，#P < 0.01 ;与 B 组比较，#P < 0.05。

[0021]以下实施例用于进一步阐明和理解本发明，但不以此限制本发明的范围。
[0022]按以下步骤进行试验:
[0023]1、实验动物与分组
[0024]将日龄为100±5天，体重为2.2±0.1Kg的30只健康雄性新西兰大白兔，随机分为A、B、C、D、E、F6组，每组5只。其中，A组命名为:模型组，B组命名为:单纯川芎嗪组，C组命名为:微泡联合川芎嗪低频超声辐照组，D组命名为:单纯低频超声辐照组，E组命名为:微泡联合低频超声辐照组，F组命名为:空白对照组。
[0025]2、建立新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型[0026]将A、B、C、D、E5组25只兔经水合氯醛腹腔麻醉后，采用直径2.5mm球囊损伤内皮细胞法，损伤兔右侧髂动脉，进管深度(10±2) cm达腹主动脉下段，充盈0.3~0.4ml肝素生理盐水，囊内压(1.8atm)来回牵拉3次，每次间隔60s，清创缝合，术后肌注青霉素40万，连续3天预防感染。
[0027]3、制备空白脂质微泡溶液
[0028]采用薄膜分散~机械振荡法制备脂质微泡，称量卵磷脂0.12g和胆固醇0.04g(质量比3:1),加入梨形瓶，向瓶内加入15ml乙醚,旋转蒸发仪55°C蒸发，除尽乙醚，20min成膜后，加入5~IOmlPH值为7.4、浓度为0.01M/L的PBS缓冲液，磁珠磁力搅拌器洗脱干膜，洗脱液倒入50ml小烧杯,加入辅助材料司班80(两滴0.03mg)、聚乙二醇0.4g(与卵磷脂体质量比4:1)、葡聚糖0.07g (与卵磷脂体质量比7:10)，匀速搅拌，6000r/min机械震荡仪震荡10s，再以氮气置换出其中的空气，密闭后在均质振荡仪上以设定的速度、时间(6000r/min、5min)进行充分振荡至成膜材料充分溶解分散，最后在超声仪上超声振荡约3~5分钟，至溶液充分分散形成稳定体系，制备出空白脂质微泡溶液。
[0029]4、川芎嗪溶液制备
[0030]川芎嗪溶液:将川芎嗪与PBS缓冲液混合，制备出lmg/ml的单纯川芎嗪PBS溶液。具体配制可选择20mg、30mg、40mg、60mg、80mg川弯嗪分别溶于20ml、30ml、40ml、60ml、80mlPBS缓冲液中，形成lmg/ml的川芎嗪溶液。
[0031]5、空白微泡溶液制备
[0032]空白微泡溶液: 离心分离出步骤3中乳白色沉淀，即微泡，称取500~2000mg乳白色沉淀与步骤4)等体积量的PBS缓冲液混合制备出空白微泡溶液，现用现配。
[0033]6、制备川芎嗪微泡混悬液
[0034]步骤5)的空白脂质微泡溶液经300r/min,离心3min,取下层乳白色沉淀，按0.5~2g与步骤4)的川芎嗪PBS溶液混合制备成lmg/ml的川芎嗪微泡混悬液，具体见下表1。
[0035]表1 )I丨芎嗪微泡混悬液组成
[0036]
川%喋潋泡潘川芎pI I泡川%嗔It泡川芎嗉微泡K芎嗪微泡
悬液〖混悬液2 混悬液3 混悬液4 混悬液5
IIftJlii ig)I冊0.01000.1.)1500.02000,0500.0
InigTniTlW^IFnil^ ^
溶液
[0037]微泡、川芎嗪与低频超声干预方案为:
[0038]A组仅建立新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型，不采取任何干预措施；
[0039]B组新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型经耳缘静脉快速团注川芎嗪溶液lml/kg,实际给药剂量lmg/kg,不给予低频超声福照；
[0040]C组新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型经耳缘静脉快速团注川芎嗪微泡混悬液lml/kg,实际给药剂量lmg/kg,给予低频超声福照；
[0041]D组新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型经耳缘静脉注射空白微泡溶液Iml/kg,实际给药剂量Omg/kg,给予低频超声福照；
[0042]E组新西兰大白兔髂动脉内皮细胞损伤模型仅给予低频超声辐照干预；
[0043]F组为正常新西兰大白兔，不采取任何干预措施。
[0044]8、(:、0组于建模术后即刻、24!1、48!1、72!1、96!1、120!1、144!1给予干预，连续 7 天。
[0045]治疗探头放置于髂动脉损伤段血管对应体表投影区，注射给药后即刻给予低频超声辐照，治疗参数:频率IMHz,声强1.0W/cm2，辐照时间60s。
[0046]血管新生内膜面积、内中膜面积比测定
[0047]给予干预措施后3周，气体栓塞处死实验动物，选取髂动脉血管，固定于4%多聚甲醒溶液，切片，行HE染色和Masson染色,观察内膜增生指标:新生内膜面积(neointimalarea，NIA)=内弹力板围绕面积一管腔面积；中膜面积=(外弹力板围绕面积一内弹力板围绕面积)；内中膜面积比(NIA/MA)=新生内膜面积/中膜面积。
[0048]免疫细胞化学检测VEGF表达
[0049]石蜡切片，厚度4 μ m，体积分数3%H202室温孵育30min以灭活内源性酶，生物素化二步法测定VEGF表达(一抗，1:100稀释)，DAB显色。免疫组化阳性颗粒为棕黄色，分布在胞浆中，以PBS缓冲液代替一抗做阴性对照。应用IPP软件进行半定量分析，测定阳性染色积分光密度(IOD)值，除以图像中的血管壁面积，获得平均IOD值计算平均光密度(0D值)代表VEGF表达强度，每个切片选取4个视野，每个视野测量3次后求平均值。 [0050]统计学方法
[0051]应用SPSS18.0统计学软件，计量资料数据以均数土标准差(x±s)表示，数据采用单因素方差分析，组间对比采用LSD检验，两两比较采用两样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
[0052]结果
[0053]术后各建模组兔切口愈合良好，无感染，一般情况好。建模后4周处死取材。
[0054]组织形态学观察
[0055]光镜下，空白组髂动脉内膜光滑无增厚，内膜由一层扁平状内皮细胞构成，内外弹力板显示清晰。模型组髂动脉内膜增厚明显，管腔狭小，内弹力板内侧有大量增生的平滑肌细胞，形态排列紊乱，细胞周围覆盖较多胶原纤维。川芎嗪组和川芎嗪联合靶向微泡破裂组组内膜厚度减少，管腔狭窄程度较模型组减轻，以川芎嗪联合靶向微泡破裂组内膜增厚最少(见图1
[0056]各组髂动脉新生内膜面积、内中膜面积比改变
[0057]相比F组，其余各组NIA和NIA/MA均显著增加，A组增加最为显著(P < 0.01)。B组、C组、E组髂动脉NIA和NIA/MA均显著小于A组(P < 0.01或P < 0.05)，内膜增生程度C组减少最为显著，NIA/MA较A组下降0.99 (t=4.854，P=0.008)。相比B组，C组NIA和 NIA/MA 均显著减少(P < 0.05)，NIA/MA 较 B 组下降 0.20 (t=3.738，P=0.006)，D 组、E组 NIA/MA 大于 B 组(P < 0.05，图 2)。
[0058]相比A组，B组和C组VEGF表达降低(P < 0.01 )，D组和E组表达变化不大；相比B组，C组VEGF表达量减少(P < 0.05)。结果见表2.[0059]表2各试验组的VEGF表达量
[0060]