专利名称：用于控制交联基质的性质的酶交联剂的改性的制作方法用于控制交联基质的性质的酶交联剂的改性发明人盖伊·托莫和奥莱恩·普里斯-布鲁姆 进旦 冃月^酶交联基质的应用性酶交联基质在食品、化妆品和医疗行业的多种应用中形成。特别在医疗应用中，酶交联水凝胶广泛用于多种医疗应用，包括组织密封剂和粘合剂、止血制剂、组织工程基质或药物输送平台。虽然一些水凝胶如明胶和泊洛沙姆可由于聚合物链之间在特定条件一例如温度改变一下的物理相互作用而形成，但大多数聚合物溶液必须交联以形成水凝胶。除固体凝胶的实际形成外，可植入的水凝胶必须耐受其所施用的组织中的普遍条件，如机械应力、温度增加和酶降解及化学降解。因此，在很多情况下，有必要交联水凝胶基质。交 联可在体外通过水凝胶的预铸塑或成型来进行。这种应用主要用于组织工程或药物输送应用。或者，交联可在体内进行(原位凝胶化或交联)，其中液体溶液被注入或施用于预期位点，并交联以形成凝胶。凝胶形成可通过多种交联方法启动。凝胶形成的化学方法包括通过接触如在氰基丙烯酸酯中或通过外部刺激如光启动而启动聚合。而且，凝胶形成可用低分子量交联剂如戊二醛或碳二亚胺(Otani Y, Tabata Y, Ikada Y，胸外科年鉴，1999，67，922-6 (Otani Y,Tabata Y,Ikada Y,Ann Thorac Surgl999, 67，922-6)。Sung HW,Huang DM, Chang WH, HuangRN, Hsu JC.生物医学材料研究杂志，1999，46，520-30 (Sung HW, Huang DM, Chang WH, HuangRN, Hsu JC. J Biomed Mater Res 1999, 46, 520-30) o0tani, Y. ; Tabata, Y. ; Ikada, Y.生物材料，1998，19，2167-73 (Otani, Y. ;Tabata, Y. ;Ikada, Y. Biomaterials 1998，19，2167-73)。Lim, D. ff. ; Nettles, D. L. ; Setton, L. A. ; Chilkoti1A.生物大分子，2008，9，222-30 (Lim, D.ff. ;Nettles, D. L. ; Setton, L. A. ; Chilkoti, A. Biomacromolecules 2008, 9, 222-30))或聚合物上活化的取代基(Iwata, H. ;Matsuda, S. ;Mitsuhashi, K. ; Itoh, E. ; Ikada, Y.生物材料，1998, 19, 1869-76 (Iwata, H. ;Matsuda, S. ;Mitsuhashi, K. ; Itoh, E. ; Ikada, Y.Biomaterials 1998, 19, 1869-76))通过化学交联预形成的聚合物而实现。但是，化学交联可在食品、化妆品或医疗应用中存在问题，因为交联剂通常具有毒性、致癌性或刺激性。此外，其为可容易扩散到交联基质外的小分子，可引起局部或全身损伤。替代化学交联的是酶交联方法。这些启动凝胶形成的方法已被基于多种不同的交联酶考察。实例包括酶交联粘合剂如贻贝胶(Strausberg RL, Link RP.生物技术趋势，1990，8，53-7 (StrausbergRL, Link RP. Trends Biotechnol 1990，8，53-7))或酶交联血液凝固——如在纤维蛋白密封剂中(Jackson MR.美国外科杂志，2001，182，1S-7S(JacksonMR-Am J Surg2001, 182，1S-7S). Spotnitz WD.美国外科杂志，2001，182，8S-14S (SpotnitzWD. Am J Surg 2001，182，8S-14S)Buchta C, Hedrich HC, Macher M, Hocker P, Redl H.生物材料，2005，26，6233-41. 27-30(Buchta C, Hedrich HC, Macher M, Hocker P, RedlH. Biomaterials 2005,26,6233-41. 27—30))。贻贝胶的交联通过粘合蛋白的卩，多巴)残基向可进行随后的蛋白质间交联反应的反应性醌残基的酶转化而启动(Burzio LA, WaiteJH.生物化学，2000，39，11147-53 (Burzio LA,Waite JH.Biochemistry2000,39,11147-53). McDowell LM, Burzio LA, Waite JH, Schaefer JJ.生物化学杂志，1999，274，20293-5(McDowell LM, Burzio LA, Waite JH, Schaefer JJ.Biol Chem1999，274, 20293-5))。已被用于此类密封剂的酶一方面是酪氨酸酶,另一方面是漆酶和过氧化物酶，其通过分别由酪氨酸和其他酚类化合物形成醌和自由基发挥作用。其依次可交联于蛋白质上的游离胺或蛋白质和多糖上经类似改性的酚基。第二种充当技术模型的交联操作是转谷氨酰胺酶催化的反应，其发生于血液凝固过程中(Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, Djonov V, Zisch AH, Hubbell JA, WeberFE, Lutolf MP.生物材料，2007，28，3856-66 (Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, DjonovV, Zisch AH, Hubbell JA, Weber FE, Lutolf MP. Biomaterials 2007, 28, 3856-66)) 原位凝胶形成的仿生方法已研究了因子XIIIa或其他组织转谷氨酰胺酶的应用(SperindeJ,Griffith L. Macromolecules 2000,33,5476-5480.Sanborn TJ,Messersmith PB, Barron AE.生物材料，2002，23，2703-10 (Sperinde J, Griffith L. Macromolecules2000, 33, 5476-5480. Sanborn TJ, Messersmith PB, Barron AE. Biomaterials2002, 23, 2703-10))。特别感兴趣的另外的原位交联凝胶形成是通过钙非依赖性微生物转谷氨酰胺酶(mTG)的明胶交联。mTG催化与因子XIIIa类似的交联反应，但微生物酶的活性不需要凝血酶或I丐。最初的mTG研究致カ于食品エ业应用(Babin H, Dickinson E.食品胶体，2001，15，271-276(Babin H, Dickinson E. Food Hydrocolloids 2001，15，27ト276)·Motoki M, Seguro K.食品科学与技术趋势，1998，9，204-210(Motoki M, SeguroK. Trends in Food Science & Technology 1998，9，204-210)),而后来的研究考虑潜在的医疗应用。之前的体外研究已显示，mTG可使明胶交联以在数分钟内形成凝胶，明胶-mTG粘合剂可结合潮湿的或湿润的组织，并且粘合強度相当于或优于纤维蛋白基密封剂(Chen TH, Payne GF, et al.生物材料，2003，24，2831-2841 (Chen TH, PayneGF, et al. Biomaterials 2003,24,2831-2841)。McDermott MK, Payne GF, et al.生物大分子，2004，5，1270-1279(McDermott MK, Payne GF, et al. Biomacromolecules2004，5，1270-1279)。Chen T，Payne GF, et al.生物医学材料研究部分B:应用生物材料，2006，77，416-22 (Chen T, Payne GF, et al. J Biomed Mater Res B Appl Biomater2006, 77, 416-22) )0明胶和mTG用作医疗粘合剂在PCT W0/2008/076407被述及。在交联基质形成中酶用作交联剂的其中ー个缺陷是，其在预期的凝胶状态已形成后可继续交联反应。这通常是不希望的，因为过度交联可导致刚性较高、脆性较高而挠性较低的凝胶。此外，交联基质的机械性质将在凝胶寿命中继续改变，致使一致的性质难以实现。超过预期交联密度的持续酶交联源自即使交联基质或水凝胶已经形成时酶仍继续催化交联反应能力。这取决于即使溶液粘性大幅增加酶仍继续在整个基质中扩散的能力。该观点与 Hu 等(Hu BH, Messersmith PB. J.美国化学会志(Am. Chem. Soc.), 2003, 125 (47), pp14298 - 14299) 一致，其基于对肽移植的合成聚合物溶液的工作提出，在聚合物溶液部分交联造成的初始网络形成过程中，溶液粘性迅速増加，而转谷氨酰胺酶的移动性迅速減少。过度酶交联导致机械性质减弱的问题之前已被记载多次Bauer等证明，高水平的微生物转谷氨酰胺酶(mTG)引起小麦面筋蛋白过度交联，导致面筋网络弹性丧失和机械损伤。(Bauer N, Koehler P, Wieser H, and Schieberle P.微生物转谷氨酰胺酶对小麦面筋蛋白II流变性质的影响的研究.谷物化学.80(6) :787 -790 (Bauer N, Koehler P,Wieser H, and Schieberle P. Studies on Effects of MicrobialTransglutaminase on Gluten Proteins of Wheat II Rheological Properties. CerealChem. 80(6) :787 - 790))。Sakai等发现，酚之间大量共价交联有效增强机械稳定性，但是，酚之间进一步交联导致脆性凝胶形成。(Sakai S, Kawakami K.离子和酶可交联藻酸盐的合成和表征，生物材料文献，3 (2007), pp. 495 - 501 (Sakai S，Kawakami K. Synthesis and characterizationof both ionically and enzymatically crosslinkable alginate, Acta Biomater3(2007), pp. 495 - 501))。在辅因子依赖性交联酶如钙依赖性转谷氨酰胺酶的情况下，通过结合去除辅因子或在一定反应时间后去除辅因子可限制交联程度。但是，辅因子去除通常在水凝胶形成中技术上不可行，其中水凝胶可截留辅因子。当应用与辅因子无关的酶如可来自微生物来源 的转谷氨酰胺酶时，交联的有限程度可通过热处理反应系统得到。但是，这种处理引起对蛋白质功能性的消极副作用，因此不希望被应用。此外，不是所有反应系统均适于进行热处理。除在交联基质中导致过度交联外，交联酶在预期的交联状态已实现后于基质中继续扩散还可导致酶高速扩散到凝胶外，也被称为酶洗脱。其还可存在如下问题释放到身体中的高水平交联酶可与身体组织相互作用，并引起局部或全身损伤。发明概述需要且将可用的是拥有可用于多种应用的改善的酶交联组合物。因此，需要且将可用的是拥有在固体基质初始形成后在已得到预期机械性质的点终止交联基质的酶交联；和/或降低酶从固体交联基质洗脱的程度和速度的机制。本发明在至少一些实施方式中克服了背景技术的上述缺陷，并针对上述技术问题提供了解决方案(在其多个优势中，不希望提供封闭式列表)，这是通过提供通过聚合物酶交联形成的基质或水凝胶实现的，其中交联酶分子已被改性，其目的在于提高基质的交联密度、机械性质或其他性质；和/或提供对交联速度和/或程度改善的控制。任选的改变酶分子的方法是通过改变酶分子在正形成的交联基质中的感知量(perceived volumn)。改变后的感知量优选根据形成基质的聚合物的交联程度确定,使得减少的交联程度与用未改变的酶分子的交联程度相比指示感知量增加。一种增加酶分子感知量的方法是通过使至少一个分子或部分共价或非共价连接酶分子而增加分子的尺寸和/或流体动力学体积。发明人已证明，水凝胶或交联基质中的酶交联程度可由分子与酶的共价连接来调控，使得酶分子改变导致最终交联水平较低。在此方式下，可避免过度交联现象。其他增加感知量的方法是通过改变酶分子的静电荷，使得其净电荷与聚合物或共聚物链上的净电荷符号相反。这可通过改变酶的等电点(pi)来实现。在非限制性假设下，增加酶分子的感知量降低分子在交联基质或水凝胶中的移动性或扩散。这防止其在超过的点后交联有益于水凝胶的预期材料性质继续其交联活性。本文定义的“感知量”或“有效量”指交联酶在交联基质中的有效流体动力学体积。感知量可通过在交联反应前或在交联反应中使酶共价或非共价结合另一分子、载体、聚合物、蛋白质、多糖等而增加。本文定义的“扩散”或“移动性”指交联酶或其他蛋白质由于布朗运动在溶液、氢气或基质中的随机分子运动。本文定义的“扩散系数”指量化ー类分子在特定条件下的扩散程度的术语。用于測量酶扩散的非限制性实例是通过测量酶从水凝胶的洗脱。本文定义的“移动性降低”指蛋白质或酶在溶液中或在水凝胶中的分子运动较低或扩散系数较小。本文定义的“尺寸”指分子的分子量或流体动力学体积或感知量。 本文所用的“分子量”，简称MW，指以道尔顿或千道尔顿表示的蛋白质或聚合物的绝对重量。例如，PEG化蛋白质(B卩-已结合一个或多个PEG (聚こニ醇)分子的蛋白质)的MW是其所有组分的总WL 本文定义的“流体动力学体积”指蛋白质或酶的表观分子量，其通常可用尺寸排阻色谱测量。组分的流体动力学体积指组分的直径或体积——假设当其以液体形式运动吋。本文定义的“基质”指交联材料的组合物。总体上，当基质形成材料交联时，包含这些材料的组合物从液体状态转变为凝胶状态，从而形成“凝胶”、“水凝胶”或“凝胶化组合物，，。凝胶可具有一定的粘弾性和流变性，该性质为其提供一定程度的耐久性和膨胀能力。这些材料通常是聚合物。基质可包含不交联的材料，有时被称为共聚物。本文所用的“聚合物”指包含重复单元的天然、合成或半合成的分子。本文所用的“共聚物”指參不參与交联反应均可并且通常不是基质主要组分的基质组分。非限制性实例包括多糖如葡聚糖和/或纤维素聚合物，如羧甲基纤维素。共聚物优选不共价结合酶或基质材料，如基质的蛋白质基料。本文所用的“载体”指交联反应前或中共价或非共价结合交联酶的聚合物、蛋白质、多糖或任何其他组分。本文定义的“交联酶”指可将聚合物链上的底物基团直接(例如，通过转谷氨化(transglutamination))或间接(例如,通过醌或自由基的形成)交联到粘合基质如水凝胶中的酶或酶组合。根据本发明至少ー些实施方式，提供了交联基质，其包含通过改性酶分子交联的底物聚合物，所述改性的酶分子具有在基质通过所述聚合物交联而形成时改变酶分子在交联基质中的感知量的改性。任选地，所述改性酶分子具有増加所述改性酶分子的实际尺寸的改性。任选地，所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子的流体动力学体积的改性。任选地，所述改性酶分子具有这样的改性通过改变所述改性酶的等电点(pl)，相对于未改性酶，改变所述改性酶分子与所述底物聚合物的净电荷符号相反的静电荷。任选地，所述改性是酶赖氨酸的ε -氨基的改性，其通过选自如下的方法实现琥珀酰化(用琥珀酸酐)、こ酰化(用こ酸酐)、氨甲酰化(用氰酸酷)、还原烷基化(醛)和用马来酸酐处理。任选地，所述改性是在包含酶的羧酸的ー个或多个侧链的改性以减少负电荷数。任选地，所述改性包括使至少ー个分子或部分共价或非共价连接至所述改性酶分子。任选地，所述改性包括使改性分子共价连接至所述改性酶分子。任选地，所述改性酶分子与非改性酶相比具有降低的扩散速度和降低的交联速度，但与非改性酶相比至少具有相似的测量酶活性。任选地，降低的交联速度至少为非改性酶交联速度的10%。任选地,所述改性分子包括载体或聚合物。任选地,所述聚合物包括合成聚合物、纤维素聚合物、蛋白质或多糖。任选地，所述纤维素聚合物包括羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素中的一种或多种。任选地，所述多糖包括葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、透明质酸或淀粉衍生物中的一种或多种。任选地，所述改性分子包括PEG (聚乙二醇)。任选地，所述PEG包括PEG衍生物。任选地，所述PEG衍生物包括活化PEG。任选地，所述活化PEG包括下列中的一种或多种甲氧基PEG(mPEG)、其衍生物、mPEG-NHS、mPEG的琥珀酰亚胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS)、 mPEG-戊二酸酯-NHS、mPEG-戊酸酯-NHS、mPEG_ 碳酸酯-NHS、mPEG_ 羧甲基-NHS、mPEG_ 丙酸酯-NHS、mPEG-羧戊基-NHS)、mPEG-硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-异氰酸酯、mPEG-环氧化物或其组合。任选地,所述活化PEG与所述酶上的胺基或巯基发生反应。任选地，所述活化PEG与所述活化酶的赖氨酸残基的摩尔比在O. 5至25的范围内。任选地，所述活化PEG是单功能、异双功能、同双功能或多功能的。任选地，所述活化PEG是分支PEG或多臂PEG。任选地，所述活化PEG的尺寸在1000道尔顿至40，000道尔顿的范围内。任选地，基质进一步包括不共价结合至所述酶或所述底物聚合物的共聚物。任选地，所述共聚物包括多糖或纤维素聚合物。任选地，所述多糖包括葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、透明质酸或淀粉衍生物。任选地，所述纤维素聚合物包括羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素。任选地，所述改性酶分子通过使所述改性酶分子交联多个其他酶分子以形成多个交联酶分子的聚集体而改性。任选地，所述改性酶分子的改性或改性程度影响基质的至少一个性质。任选地，所述至少一个性质选自拉伸强度、刚性、所述底物聚合物的交联程度、粘性、弹性、挠性、断裂张力、断裂应力、泊松比、溶胀能力和杨氏模量或其组合。任选地，所述改性酶的改性程度决定所述改性酶在基质中的移动性或自基质的扩散。任选地,所述改性酶的所述改性使所述改性酶在所述改性酶和所述蛋白质的溶液或在所述改性酶和所述蛋白质的基质中的扩散系数相对于非改性酶和所述蛋白质的溶液或基质降低。任选地，所述改性酶的改性程度决定一个或多个基质机械性质。任选地，所述改性酶分子与非改性酶分子相比显示交联速度在交联聚合物中与在溶液中相比更大的差异。根据本发明至少一些实施方式，提供了控制基质形成的方法，包括以在形成基质时改变酶分子在交联基质中的感知量的改变使酶分子改性；混合所述改性酶分子与至少一种底物聚合物，该底物聚合物是所述改性酶分子的底物；和通过所述改性酶分子使所述至少一种底物聚合物交联，形成基质，其中所述形成基质至少部分地由所述酶分子的所述改性控制。任选地，所述改性使所述改性酶分子的交联速度随所述至少一种底物聚合物的交联程度增加而降低。任选地，在溶液中混合所述改性酶分子和所述至少一种底物聚合物，使得所述改性在所述溶液的粘性増加时控制所述至少ー种底物聚合物的交联程度。任选地，所述改性包括酶在pH在7至9的范围内时的PEG化。任选地，PEG化反应的pH为7. 5-8. 5。根据本方法和/或基质的至少ー些实施方式，所述至少一种底物聚合物包括选自如下的底物聚合物可天然交联的聚合物、可通过所述改性酶交联的部分变性聚合物和包含功能基团的改性聚合物或可通过所述改性酶交联的肽。任选地，所述至少ー种底物聚合物包括明胶、胶原、酪蛋白或白蛋白或改性聚合物，并且其中所述改性酶分子包括改性转谷氨酰胺酶和/或改性氧化酶。任选地，所述至少一种底物聚合物包括选自下列的明胶通过部分水解动物组织或得自动物组织的胶原得到的明胶，其中所述动物组织选自动物皮肤、结缔组织、鹿角、角、骨、鱼鳞和用细菌、酵母菌、动物、昆虫或植物系统生成的重组明胶或任何类型的细胞培养物或其任意組合。任选地，所述明胶是哺乳动物或鱼类起源的明胶。任选地，所述明胶是A型(酸处理)或B型(碱处理)。任选地，所述明胶具有250-300白化。任选地，所述明胶含有平均分子量75-150kda。任选地，所述改性转谷氨酰胺酶包括改性微生物转谷氨酰胺酶。任选地，所述改性 聚合物经改性允许所述改性微生物转谷氨酰胺酶进行交联。任选地，所述改性氧化酶包括酪氨酸酶、漆酶或过氧化物酶中的ー种或多种。任选地，所述基质进ー步包括包含通过所述改性氧化酶交联的酚酸的糖作为所述至少ー种底物聚合物。任选地，所述糖包括阿拉伯糖基木聚糖或果胶中的ー种或多种。任选地，所述酶分子通过PEG化而改性，并且其中所述PEG化提供免疫原性掩蔽，这是通过掩蔽所述酶分子隔离接受基质的宿主动物的免疫系统实现的。任选地，所述宿主动物是人。根据至少一些实施方式，提供了密封组织防止体液泄漏的方法，包括向组织施用本文所述的基质。任选地，所述体液包括血液，使得所述基质是止血剤。根据至少一些实施方式，提供了包含本文所述基质的止血剂或外科密封剂。根据至少一些实施方式，提供了包含本文所述基质的用于密封伤ロ的组合物。根据至少一些实施方式，提供了该组合物用于密封组织中的缝合线或钉合线(staple line)的应用。根据至少一些实施方式，提供了包含本文所述基质的用于局部药物输送的媒介物组合物。根据至少一些实施方式，提供了包含本文所述基质的用于组织工程的组合物，适用作可注入支架。根据至少一些实施方式，提供了使组合物改性的方法，包括提供具有可交联功能基团的改性酶和具有至少ー个可通过所述改性酶交联的部分的蛋白质；混合所述改性酶与所述蛋白质，其中所述改性酶使所述蛋白质交联，而且也通过所述可交联功能基団交联于所述蛋白质。使聚合物链上的底物基团直接交联的直接交联酶的非限制性实例包括转谷氨酰胺酶和氧化酶。转谷氨酰胺酶的实例包括微生物转谷氨酰胺酶(mTG)、组织转谷氨酰胺酶(tTG)和因子XIII。这些酶可来自天然或重组来源。聚合物链中的谷氨酸和赖氨酸氨基酸是用于转谷氨酰胺酶交联的底物。氧化酶的非限制性实例是酪氨酸酶、漆酶和过氧化物酶。这些酶通过醌的形成(酪氨酸酶)或自由基的形成(漆酶，过氧化物酶)使聚合物交联。然后醌和自由基彼此或与其他氨基酸或酚酸发生相互作用，以使聚合物交联。这些酶可交联的底物可以是包含酪氨酸或其他芳香族氨基酸的任何蛋白质。底物还可以是包含酚酸如阿魏酸的碳水化合物。这种碳水化合物例如可以是阿拉伯糖基木聚糖或果胶。具有一个或多个适当官能基团的合成或部分合成的聚合物也可充当上述任意酶可交联的底物。在本发明的另ー实施方式中，应用酶组合。本文定义的“聚合物链(strand)”或“聚合物链(chain)”指酶交联的底物聚合物，其根据本发明至少ー些实施方式优选属于以下类别其中ー种(仅为非限制性实例，并且不希望提供封闭的列表) I)具有可由酶天然交联的底物基团和本身可由酶天然交联的任何聚合物。例如，在转谷氨酰胺酶的情况下，其将包括可由酶天然交联的蛋白质或多肽，如明胶、胶原和酪蛋白。 2)包含由于其结构可由酶交联但非天然可由酶交联的底物基团的聚合物。在这种情况下，聚合物结构必须在酶交联前被改性。例如，在转谷氨酰胺酶的情况下，其将包括非酶天然底物的蛋白质，如白蛋白或乳球蛋白，因为其具有阻碍酶进入的球状结构。可通过用还原剂、变性剂或热量使蛋白质部分变性使其成为底物。3)非酶交联底物但已被作为酶底物的肽或功能基团改性从而使改性聚合物可由酶交联的天然或合成的聚合物。这种聚合物的非限制性实例包括任何适合的蛋白质类型，其可例如任选地包括上述明胶。明胶可任选地包括任何类型的明胶，其包括本领域已知的蛋白质，优选包括但不限于通过部分水解动物组织和/或得自动物组织的胶原得到的明胶，该动物组织包括但不限于动物皮肤、结缔组织(包括但不限于韧带、软骨及类似物)、鹿角或角及类似物、和/或骨、和/或鱼鳞和/或骨或其他成分；和/或用细菌、酵母菌、动物、昆虫或植物系统生成的重组明胶或任何类型的细胞培养物。根据本发明的优选实施方式，动物来源的明胶优选包括哺乳动物来源的明胶，更优选包括猪皮、猪骨和牛骨或碎牛皮或任何其他猪或牛来源中的ー种或多种。更优选，这种明胶包括猪明胶，因为其具有较低的过敏反应率。动物来源的明胶可任选地为A型(酸处理)或B型(碱处理)，尽管优选A型。优选地，动物来源的明胶包括在第一提取过程中得到的明胶，其一般在较低的温度(50-60°C，虽然该准确温度范围不必是限制)下进行。此方式下生成的明胶将在250-300水的范围内，并具有至少约95-100kDa的高分子量。优选地，应用275-300水的明胶。这种明胶制造商的非限制性实例是PB GelatinsCTessenderlo Group,Belgium)。根据本发明的一些实施方式，动物来源的明胶任选地包括鱼明胶。任选地，可采用任何类型的鱼，优选冷水品种鱼如鲤鱼、鳕鱼或梭鱼或金枪鱼。这种明胶的pH(在10%的溶液下测量)优选在4-6的范围内。冷水鱼明胶在10°C下于水中形成溶液，因此所有冷水鱼明胶均被认为是O白化。对于本发明，任选并且优选采用高分子量冷水鱼明胶，更优选包括至少约95-115kDa的平均分子量。这等同于250-300白化的动物明胶的分子量。冷水鱼明胶在比动物明胶低很多的温度下进行热可逆凝胶化，这是因为其较低的脯氨酸和羟基脯氨酸水平。每1000个氨基酸残，冷水鱼明胶基具有100-130个脯氨酸和50-75个羟基脯氨酸基团，与之相比动物明胶具有135-145个脯氨酸和90-100个羟基脯氨酸(Haug U, Draget KI, Smidsr0dO. (2004).食品胶体(Food Hydrocolloids). 18:203 - 213)。这种明胶的制造商的非限制性实例是Norland Products (Cranbury, NJ)0在本发明一些实施方式中，利用低内毒性明胶形成明胶-mTG组合物的明胶溶液成分。这种明胶购自供应商如Gelita (Eberbach, Germany)。低内毒性明胶被定义为低于每克1000内毒性单位(EU)的明胶。更优选，采用内毒性低于500EU/克的明胶。对于极高敏感性的应用，如将接触脊柱或脑的材料的应用，优选内毒性低于100EU/克的明胶，更优选低于50EU/g的明胶。内毒性低于10EU/g的明胶价格非常昂贵，但也可被用作本发明至少一些实施方式敏感性应用的一部分。根据本发明一些实施方式，I型、II型或任何其他类型的水解或非水解胶原代替明胶作为正交联的蛋白物质。多种类型的胶原已证明了形成热稳定mTG-交联凝胶的能力。 根据本发明一些实施方式，采用重组人明胶。这种明胶购自供应商如Fibrogen (San Francisco, CA)。重组明胶优选至少约90%纯,更优选至少约95%纯。一些重组明胶在10°C下是非凝胶化的，因此被认为是O白化的。对于本发明一些实施方式，优选采用高分子量重组明胶,更优选包括至少约95-100kDa的分子量。如上所述，可交联的蛋白质优选包括明胶，但也可另外或取而代之包括另一类蛋白质。根据本发明一些实施方式，蛋白质也是转谷氨酰胺酶的底物，并且优选其特征在于适当的转谷氨酰胺酶特异性多肽和聚合物序列。这些蛋白质可任选地包括但不限于这样的合成聚合物序列独立地具有形成生物粘合剂或聚合物的性质，该生物粘合剂或聚合物更优选已被转谷氨酰胺酶特异性底物改性，该转谷氨酰胺酶特异性底物增强材料被转谷氨酰胺酶交联的能力。这些材料类型中每一种的非限制性实例在下文中述及。具有适当的转谷氨酰胺酶交联目标的合成多肽和聚合物序列已被开发，其具有优选约20至约40°C的转变点。优选的物理特征包括但不限于结合组织的能力和形成纤维的能力。如同凝胶型明胶(上述)，这些多肽可任选地被用于组合物中，该组合物的特征也在于降低其转变点的一种或多种物质。这种肽的非限制性实例被述及于US专利第5，428，014和5，939，385号，二者均由ZymoGenetics Inc提交，在此将其全部引入作为参考，如同在本文中得到完整描述。两专利均描述了生物相容的、生物粘合的、可转谷氨酰胺酶交联的多肽，其中已知转谷氨酰胺酶催化蛋白质结合的谷氨酰胺酰基残基的Y-氨甲酰基与Lys残基的氨基之间的转酰基反应，导致ε-(Υ-谷氨酰基)赖氨酸异构肽键的形成。根据一些实施方式，生成的组合物被用作局部药物输送的媒介物。根据一些实施方式，生成的组合物是用于组织工程的可注入支架。根据一些实施方式，组合物是止血的组合物。根据一些实施方式，组合物是密封体液的组合物。本发明的组合物优选提供迅速止血，从而最小化创伤或手术后的血液损失。 本文所用的“伤口 ”指患者任何组织的任何造成血液从循环系统流失或从任何其他体液从其生理途径如任何类型脉管流失的损伤。该组织可以是内部组织，如器官或血管；或外部组织，如皮肤。血液或体液的流失可以在内部，如来自断裂的器官；或在外部，如来自撕裂。伤ロ可在软组织，如器官；或在硬组织，如骨。损伤可由任何剂或来源引起，包括外伤性创伤、感染或外科干预。损伤可危及生命或不危及生命。外科伤ロ闭合目前通过缝合和钉合实现，其通过将组织牵引在一起而促进愈合。但是，其经常不能造成防止流体泄漏所必需的足够的密封。因此，存在对防止手术后泄漏包括经常沿钉合线和縫合线发生的泄漏的装置和方法极大的、未满足的医疗需要。这种装置和方法需要作为缝合或钉合的辅助以实现在周围血管重建、硬脑膜重建、胸部、心血管、肺部、神经和胃肠道手术过程中的止血或其他流体停滞。如果对于所有粘合剤，当前市场上的大多数高压止血的装置都是有名无实的。因此，根据至少一些实施方式，本发明的组合物克服了这些缺陷，并可任选地用于止血。本文所用的，“约”意为所述值或加或减大约10%。本发明不同实施方式的其他特征和优势将由下文详细描述和权利要求变得显而易见。附图简述本文仅为示例而參考附图对本发明进行描述。在现在具体详细參考附图的情况下要强调的是，所示细节仅是为示例和为示例性讨论本发明优选的实施方式，并且是为提供本发明的原理和概念方面被认为最有用和最容易被理解的描述而展示。在这方面，没有试图比本发明基本理解所必需更具体地显示本发明的结构细节，随同附图的说明致使本发明的几种形式如何在实践中实施对于本领域技术人员来说是显而易见的。在附图中图I :反应pH和活化PEG的浓度对PEG化产物的尺寸和分布的影响；图2 :反应时间和pH对PEG化产物的尺寸和分布的影响；图3 :利用不同浓度的PEG-NHS (2kD)对PEG化mTG的SDS-分析； 图4 mTG和PEG化mTG自相同的交联明胶洗脱；图5 mTG (左)和PEG化mTG (右)自不同的交联明胶洗脱；图6 :与非PEG化mTG和2种PEG化mTG —起制成的明胶密封剂的爆裂压カ值；图7 mTG与葡聚糖之间的结合产物的SDS-PAGE分析；图8 :辣根过氧化物酶(HRP)的PEG化产物的SDS-PAGE分析；图9 mTG的PEG化产物的SDS-PAGE分析，利用不同的反应条件，凝胶显示了不同的PEG化程度；图10 :mTG的PEG化产物SDS-PAGE分析，其中反应性PEG是双功能IOkD PEG-NHS ；图11显示由MALDI-T0F质谱仪得到的PEG化mTG —般批次的质荷谱；和图12显示mTG的PEG化产物的SDS-PAGE分析，其中PEG试剂与胺的比保持恒定，但反应物浓度改变。发明详述 下文本章节标题仅为便于描述而提供。要理解的是，其不意为以任何方式受到限制。同样，除非另外限定，本文所用的所有技术术语和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的具有相同的含义。虽然类似或等同于本文所述的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了适当的方法和材料。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，材料、方法和实例仅是示例性的，并不意为限制性的。
水凝胶中酶交联剂增加的感知量发现除含酶聚合物溶液的粘性和部分交联溶液的交联密度(反应基团的利用度)夕卜，交联基质中交联酶的催化速度也可通过控制酶分子的感知量而得到控制。根据本发明至少一些实施方式，这种控制可任选并且优选地通过在启动交联反应或前在反应本身过程中增加酶分子的感知量在基质接近预期的机械状态时导致交联的催化速度降低。在此方式下，固化基质在预期交联密度状态截留尺寸增大的酶，并防止进一步交联。酶感知量是除其他因子外酶分子量和流体动力学体积的函数。交联基质的最终交联程度可通过改造酶分子、基质材料、交联环境或这些因子的一些组合从而增加基质形成时交联基质中酶分子的感知量而被限制。不希望受到单一假设限制，可能是增加的酶感知量导致酶在交联基质中的移动性降低。酶分子在早期交联反应阶段保持移动性时降低酶移动性以控制最终交联密度是最有效的，此时溶液粘性仍低，但在交联进行时丧失移动性从而增加溶液粘性，并且在初始固体基质或水凝胶已形成后更严 重地丧失移动性。天然地，基质中酶移动性的精确水平应被调控，从而取得具体应用所需的交联特征和程度。不希望受到单一假设的限制，尺寸增大或流体动力学体积增大的酶在交联基质中比非改性酶具有较低的扩散系数或移动性，因此更加有限地进入可交联的底物。尺寸和/或流体动力学体积增大的酶分子降低酶分子在交联基质中的移动性的优选方法是增大酶分子的有效尺寸。这可通过增加酶分子的分子量(MW)、增加流体动力学体积或增加MW和流体动力学体积而实现。这是优选的方法，因为其不应影响交联基质的结构组成。为对本文所述的本发明实施方式有效，优选以不消除酶活性或其使预期聚合物底物交联为固体基质或水凝胶的能力的方式增大酶分子尺寸。该酶还优选保持足以在适当时间量内形成基质的活性。此外，尺寸增大的酶分子还优选保持在交联基质中足以在阻止在基质中的移动性前催化预期的交联程度的移动性。多种增大交联基质或水凝胶中酶分子尺寸的方法已被确定I.使酶自身交联(分子间交联)，从而形成可溶性多单元结合体。其实例在下文实施施例18中述及。2.使酶共价结合(固定化)在载体上I.固定化于可溶性蛋白质，例如白蛋白；(Allen TM et al, 1985，JPET234:250-254, α -葡萄糖苷酶-白蛋白结合体慢性给药对小鼠的影响，(Allen TM etal，1985，JPET 234:250-254，alpha-Glucosidase-albumin conjugates : effect ofchronic administration in mice))。II.固定化在可溶性聚合物上。优选地,聚合物载体大于酶,在此一个或多个酶分子被固定在各聚合物分子上。也可能是单个酶分子通过两个或更多个连接位点结合于一个以上聚合物分子。载体可以是天然、合成或半合成的。很多这种应用被开发以增加体内酶稳定性或降低免疫原性。一种该聚合物家族是纤维素醚，包括但不限于羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素等。这种固定化之前已用酶如胰蛋白酶(Villaonga et al, 2000,分子催化学报，B: 10，483-490羧甲基纤维素酶改性的胰蛋白酶酶法制备和功能特性，(Villaonga et al, 2000, Journal of Molecular CatalysisB:10,483-490 Enzymatic Preparation and functional properties of trypsinmodified by carboxymethylcellulose))和溶菌酶(Chen SH et al, 2003,酶和微生物技术，33，643-649，通过偶联可逆的水溶性聚合物溶菌酶的可逆固定化(Chen SH etal, 2003, Enzyme and Microbia丄 Technology33, 643-649，Reversible immobilization oflysozyme via coupling to reversibly soluble polymer))实现，虽然这种酶固定化之前从未被用于影响酶交联的水凝胶或基质的机械性质。III.结合于葡糖胺基葡聚糖(GAG)，包括但不限于硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素和透明质酸。如上，这种结合已被实现(Luchter-Wasylewska E etal., 1991,生物技术和应用生物化学13:36-47，用硫酸软骨素偶联的人类前列腺酸性磷酸酶的碌定(Luchter-Wasylewska E et al. , 1991, Biotechnology and applied Diochemistryl3:36-47, Stabilization of human prostatic acid phosphatase by coupling withchondroitin sulfate)),虽然从未被用于影响酶交联的水凝胶或基质的机械性质。IV.酶还可偶联至多糖，如葡聚糖和淀粉衍生物如羟こ基淀粉。其实例可示于实施例13，其中酶偶联至氧化葡聚糖。3.通过共价改性(ー个或多个)向单个酶分子添加ー个或多个部分。通常，但不一定，所述部分小于酶。这种改性的实例是交联酶的PEG化，如下文多个实施例中充分描述。4.其他共价结合类型。例如,通过在酶表面上接枝生物素分子(生物素化)和在包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的分子或聚合物上固定生物素化酶。载体可以是非可交联的可溶性聚合物，其功能是在交联反应前或中捕获交联酶。或者，捕获基团，例如。抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白，可被接枝在可交联的聚合物本身上，导致交联酶在交联反应过程中于逐步固定化于可交联的聚合物上。5.酶与载体或聚合物非共价结合。例如，酶与载体或聚合物之间的静电相互作用可提供稳定但非共价键，此时酶的净电荷与载体的净电荷符号相反。增加酶分子尺寸相关的技术虽然增加酶尺寸之前已被多次公开，但其从未被考虑在形成酶交联基质或水凝胶和/或控制酶交联基质或水凝胶形成的背景下。交联基质中尺寸増大的酶的应用完全是新颖的，因为尺寸増大的酶在这种基质中的交联反应性之前未被以任何程度表征。此外，本发明的发明人令人惊讶地证明，尺寸増大的酶的单独的酶活性——如比色法酶活性分析所测——明显不同于水凝胶形成中尺寸増大的酶的交联活性，如凝胶化速率所示。例如，实施例5描述了用比色法分析测量酶催化凝胶化速率与酶活性值的比较。PEG化作为增加酶尺寸的非限制性示例方法在该实施例被述及。PEG化是聚こニ醇(PEG)分子与酶分子的共价连接，并且是增加酶分子尺寸的优选方法。添加这样的ー种或多种PEG分子的操作被称为PEG化。PEG是用于增加酶尺寸的理想材料，因为其具有生物惰性，并已被证明了限制对PEG化的植入或注入分子的免疫源应答的能力。虽然不知道本文所述的酶PEG化是否也引起这种免疫原性掩蔽(有限的免疫源应答)，但不希望受到单一假设的限制，可能是事实上酶的PEG化确实限制对酶的免疫原性应答，并且也可能由于延伸限制对交联基质的免疫原性应答。ー种实现酶PEG化的方法是使酶与活化的甲氧基PEG (mPEG)发生反应，该活化的甲氧基PEG与酶的胺基发生反应(胺PEG化)。活化的mPEG的非限制性实例包括mPEG的琥珀酰亚胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS、mPEG_戊二酸酯-NHS、mPEG_戊酸酯-NHS、mPEG_碳酸酯-NHS、mPEG-羧甲基-NHS、mPEG_丙酸酯-NHS、mPEG_羧戊基-NHS)、mPEG_硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-异氰酸酯、mPEG-环氧化物。活化的mPEG可是与酶的巯基发生反应的mPEG (巯基PEG化)。活化的PEG可以是单功能、异双功能或同双功能的。活化的PEG可以是分支PEG或多臂PEG。活化的PEG的尺寸的范围可以是1000道尔顿至40，000道尔顿。活化的PEG与酶的赖氨酸基团的摩尔比为O. 1:1至100:1，优选O. 5:1至10:1。
优选地，PEG化反应的pH为7-9。更优选反应pH为7. 5-8. 5。根据优选的实施方式，可将PEG化酶自未反应的酶进一步纯化或从而减小PEG化产物的尺寸范围。纯化可利用尺寸排阻层析进行。或者或另外，纯化可利用离子层析如SP-琼脂糖、Q-琼脂糖、SM-琼脂糖或DEAE-琼脂糖进行。或者或另外，自未反应的酶的纯化还可利用透析、超滤或硫酸铵分级分离进行。下文提供的多个实施例描述了转谷氨酰胺酶PEG化对于控制交联水凝胶形成的应用。实施例I描述了 mTG与PEG-NHS (5kD)的PEG化反应。PEG化产物的尺寸和分布取决于PEG与mTG的比和反应的pH。实施例2描述了 MTG与PEG-NHS (5kD)的PEG化反应。PEG化产物的尺寸和分布取决于反应持续时间和pH。实施例3描述了 MTG与PEG-NHS (2kD)的PEG化反应。PEG化产物的尺寸和分布取决于PEG与mTG的比。实施例4描述了用于确定不同PEG化mTG (5kD PEG)制剂的PEG化程度的TNBS分析。结果表明，PEG化程度取决于反应中活化的PEG:mTG的比。实施例5描述了用于确定PEG化mTG的活性的分析。结果表明，PEG化mTG保持其对小底物如羟基胺和CBZ-Gln-Gly的大部分活性，但丧失其对较大底物如明胶的大部分活性。实施例6和7描述了 mTG和PEG化mTG自交联明胶凝胶的洗脱特征的SDS-PAGE分析。结果表明，PEG化mTG自凝胶洗脱比非PEG化mTG慢且程度低，可能是因为其较大的尺寸或流体动力学体积。实施例8描述了已自交联明胶凝胶洗脱的mTG的活性测量。结果表明，自交联明胶凝胶洗脱的非PEG化mTG保持其大部分活性(最大计算活性的86%)。实施例9描述了与PEG化或非PEG化mTG交联的明胶凝胶的机械测试。结果证明，与PEG化mTG交联的明胶凝胶比与非PEG化mTG交联的凝胶更具强度，且相当更具挠性。实施例10描述了不同明胶密封剂制剂的爆裂压力测试。结果表明，用PEG化mTG制成的明胶密封剂证明了爆裂压力结果相当于用非PEG化mTG制成的密封剂。实施例11描述了对于体内猪模型钉合线加固的密封剂应用。实施例12描述了交联酶非共价结合不可溶载体的影响。实施例13描述了氧化葡聚糖改性酶的影响。实施例14证明了辣根过氧化物酶(另一交联酶)通过PEG化改性可使通过过氧化物酶交联形成的基质改性。实施例15证明了交联酶部分PEG化的影响。实施例16证明了游离的PEG (PEG分子与交联酶放置于溶液，但未共价结合酶)不影响凝胶化。实施例17示例了改性酶与非改性酶混合的不同混合物对凝胶化的影响。实施例18证明了双功能PEG-酶桥对凝胶化的影响。实施例19涉及PEG化mTG (微生物转谷氨酰胺酶)的质谱分析。实施例20描述了以固定PEG:胺比用不同浓度的反应物PEG化mTG，证明了总反应物浓度对PEG化程度的巨大影响。
令人惊讶地在这些实施例中发现，虽然PEG化降低微生物转谷氨酰胺酶(mTG)交联明胶的速率，但其不降低其在氧肟酸盐分析中的活性——氧肟酸盐分析是转谷氨酰胺酶的黄金标准活性分析。这些结果与背景技术教导相矛盾，背景技术教导提出尺寸増大的酶对于水凝胶形成的应用可能是不期望的，因为其可能在引起水凝胶形成中具有明显较低的效力。应当注意的是，TG酶(转谷氨酰胺酶)有时在背景技术中的PEG化背景下被提及；但是，这些參考文献教导TG酶通过催化所述蛋白质上谷氨酰基残基与所述PEG分子连接的伯胺基的转谷氨反应而用作使其他蛋白质能够进行位点特异性PEG化或增强位点特异性PEG化(而非作为PEG化底物)的工具。但是，这种背景技术没有教导或暗示TG酶本身PEG化以改变或控制其交联活性或改变或控制由这些酶交联的水凝胶基质的机械性质。交联酶通过偶联在交联基质上而移动性降低在降低交联基质中的酶移动性的另ー实施方式中，酶本身进行与交联基质的结合反应，同时催化交联反应。在酶移动经过聚合物溶液以交联基质中的聚合物时，其逐步结合聚合物本身，因此被固定在基质中。例如，生物素化酶可与包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白涂布的聚合物的可交联聚合物成分混合。US专利6046024 (用生物素化酶和固定化抗生物素蛋白产生纤维蛋白单体的方法(Method of producing a fibrin monomerusing a biotinylated enzyme and immobilized avidin))描述 J 通过添カロ抗生物素蛋白改性的琼脂糖自纤维蛋白原溶液捕获生物素化凝血酶的方法。虽然在这种情况下琼脂糖不可溶，但可以使抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合水可溶性聚合物，如美国专利5026785 (抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白改性水溶性聚合物如聚丙烯酰胺，及其在构建可溶性多价大分子偶联物中的用途(Avidin and streptavidin modified water-solublepolymers such as polyacrylamide, and the use thereof in the construction ofsoluble multivalent macromolecular conjugates))所述。转谷氨酸胺酶的生物素化和随后吸附于经抗生物素蛋白处理的表面已显示出是可行的(Huang XL et al,农业食品化学，1995，43 (4)，pp 895 - 901 (Huang XL et al，J. Agric. Food Chem.，1995，43 (4)，pp895 - 901))。或者，交联酶可共价结合抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和加入交联反应的包含生物素化聚合物的结合体。可交联的聚合物本身可生物素化，例如，明胶或非可交联的共聚物如葡聚糖。分子量最高为500，000道尔顿的葡聚糖-生物素结合体可来自商业来源。交联酶通过静电相互作用在交联基质中移动件降低
在本发明的另一实施方式中，酶移动性通过基于酶与聚合物载体之间的静电相互作用可逆结合而降低，其中酶的净电荷与载体的净电荷符号相反。可将酶与载体一起预温育，并添加至交联反应；或可使其在交联反应过程中结合载体。例如，如果交联酶在中性pH下带正电，则其可静电结合带负电载体，例如羧甲基纤维素(CMC)。可将酶与CMC —起温育以使其结合，然后将复合物加入交联反应；或分别添加酶和CMC。在后者情况下，酶将在交联反应过程中逐步结合CMC。还可以使酶在交联反应过程中结合可交联的聚合物链本身，条件是可交联的聚合物带有相对于交联酶符号相反的电荷。或者，可改变交联酶的等电点(PD，使得酶获得与可交联的聚合物或载体相比符号相反的电荷。在另一实施方式中，交联酶以使其等电点(pi)改变的方式改性，导致酶在给定pH下具有不同的净电荷。降低酶Pl的方式的实例是通过如下处理改变赖氨酸的ε-氨基例如但不限于琥珀酰化(用琥珀酸酐)、乙酰化(用乙酸酐)、氨甲酰化(用氰酸酯)、还原烷基化(醛)和用马来酸酐处理。这导致蛋白质上每个改性氨基酸的净正电荷最高减少一个电荷单位(除琥珀酰化外，其使净正电荷最高减少两个电荷单位)和Pl降低。相反，包含羧酸如谷氨酸和天冬氨酸的侧链可被改性以减少蛋白质上的负电荷数量，由此增加P〗。例如，可以 基团，并且酰胺键在其与EDA之间形成。结果是蛋白质的净正电荷增加和Pl升高。蛋白质自水凝胶释放已被关联于水凝胶聚合物链与俘获的蛋白质之间的静电吸引力和排斥力。已提出，在蛋白质从重组明胶基质释放的实验中，静电排斥力使俘获的蛋白质的扩散系数增大，相反静电吸引力使扩散系数减小(Marc Sutter’ -JuergenSiepmann, Wim E. Hennink and Wim Jiskoot,用于蛋白质缓释的重组明胶水凝胶，受控释放学报，第 119 卷，第 3 期，2007 年 6 月 22 日，第 301-312 页(Marc Sutter’ -JuergenSiepmann, Wim E. Hennink and Wim Jiskootj Recombinant gelatin hydrogels for thesustained release of proteins, Journal of Controlled Release Volume 119，Issue3，22 June 2007，Pages 301-312))。改变水凝胶聚合物链的pi本身已被提出作为控制蛋白质从该水凝胶释放的方式。但是，与操控水凝胶中俘获的蛋白质与水凝胶链之间的静电相互作用有关的背景技术涉及控制治疗性蛋白质从水凝胶释放的速度的方法，其中蛋白质本身与水凝胶形成无关。对于本发明至少一些实施方式，静电相互作用被改变以提高水凝胶的机械性质，其可能与酶在该酶交联的水凝胶基质中的移动性和扩散系数有关。因此，改变俘获的交联酶的pi是防止过度交联的新颖方法，因为交联酶在可交联的基质中的扩散或移动性通过改变俘获的酶而非聚合物水凝胶的Pi而被严重限制。实施例I :反应DH和PEG:mTG比对PEG化产物的尺寸和分布的影响材料:活化的PEG :mPEG-戊二酸酯-NHS 5kDa( SunBright ME_050GS，N0F corporation,Japan)。21]^_利用SP-琼脂糖离子交换层析进一步纯化的Ajinimoto activalO%。活性pH 6的O. 2M柠檬酸钠中604单位/ml。朽1檬酸钠、Hepes、SDS和β巯基乙醇来自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考马斯G-250染色剂来自Bio-Rad....。
分子量标记物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I单位mTG活性在pH 6. 0、37°C下每分钟从N-CBZ-Gln-Gly和羟基胺催化形成I. O μ mol氧肟酸盐。建立一组反应，各反应具有体积O. 2ml。所有反应包括15u/ml mTG、适当的反应缓冲——pH 6的90mM柠檬酸钠或pH 7的IOOmM H印es、和不同量的活化的PEG。PEG-NHS与蛋白质中的伯胺、赖氨酸残基侧链上的ε -胺和蛋白质的氨基末端发生反应。反应混合物中PEG与赖氨酸残基的比在下文中详细描述。将反应在37°C下温育1:36hr， 然后添加甘氨酸至最终浓度IlOmM以中和未与酶发生反应的过量活化PEG分子。使各反应的样本通过在SDS和β巯基こ醇存在下于90°C加热变性，并用SDS-PAGE (8% 解析凝胶(resolving gel), 4% 积层凝胶(stacking gel), Mini-Protean 电泳系统，BioRad)进行分析。为使蛋白质显现，将凝胶用生物安全考马斯G-250染色剂染色，然后用水去染色。用CanoScan 8800F扫描仪扫描凝胶，图像显示在图I中，显示了反应pH和活化PEG浓度对PEG化产物尺寸和分布的影响。泳道分配如下泳道I :mTG (对照)泳道2 :分子尺寸标记物(由上至下250kD，150kD，100kD，75kD，50kD，37kD，25kD)泳道3 53. 3mg/ml活化的PEG ；90mM柠檬酸钠pH 6 ；PEG与赖氨酸的比9. 15泳道4 26. 6mg/ml活化的PEG ；90mM柠檬酸钠pH 6 ；PEG与赖氨酸的比4. 59泳道5:13. 3mg/ml活化的PEG ；90mM柠檬酸钠pH 6 ；PEG与赖氨酸的比2. 30泳道6 53. 3mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 与赖氨酸的比 9. 15泳道7 26. 6mg/ml 活化的 PEG ；IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 与赖氨酸的比 4. 59泳道8 13. 3mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 与赖氨酸的比 2. 30由图I可见，PEG量较大和pH増大导致导致凝胶上的酶具有増大的表观分子量。实施例2 :反应DH和持续时间对PEG化产物尺寸和分布的影响所有反应包括15u/ml mTG。材料:活化的PEG mPEG~ 戊ニ酸酯-NHS 5kDa (SunBright ME-050GS, NOFcorporation,Japan)211ら_利用SP-琼脂糖离子交换层析进ー步纯化的Ajinimoto activalO%。活性pH 6的O. 2M柠檬酸钠中604单位/ml。朽1檬酸钠、Hepes、SDS和β巯基こ醇来自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考马斯G-250染色剂来自Bio-Rad。分子量标记物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I单位mTG活性将在pH 6. 0、37°C下每分钟从N-CBZ-Gln-Gly和羟基胺催化形成I. O μ mol氧厢酸盐。建立一组反应,各反应具有体积O. 2ml,所有反应包括15u/ml mTG、适当的反应缓
冲液-pH 7的IOOmM H印es或pH 8的IOOmM H印es、和25mg/ml PEG-NHS0反应混合物
中PEG与赖氨酸残基的比为4. 59。将反应在室温下温育2hr。如下文所述在不同时间点提取样本，并添加甘氨酸至最终浓度IlOmM以中和未与酶发生反应的过量活化PEG分子。
使各反应的样本通过在SDS和β巯基乙醇存在下于90°C加热变性，并利用SDS-PAGE (8%解析凝胶,4%积层凝胶，Mini-Protean电泳系统，BioRad)进行分析。为使蛋白质显现，将凝胶用生物安全考马斯G-250染色剂染色，然后用水去染色。用CanoScan8800F扫描仪扫描凝胶，图像显示在图2中，证明反应时间和pH对PEG化产物尺寸和分布的影响。泳道分配如下泳道I :25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；15min 反应时间泳道2 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；30min 反应时间泳道3 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；60min 反应时间泳道4 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；120min 反应时间泳道5 :分子尺寸标记物(由上至下250kD，150kD，100kD，75kD，50kD，37kD，25kD)
泳道6 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；15min 反应时间泳道7 25mg/ml 活化的 PEG ；IOOmM Hepes pH 7 ；30min 反应时间泳道8 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；60min 反应时间泳道9 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；120min 反应时间如所示图2，反应时间增加和pH增大导致凝胶上的酶具有增大的表观分子量。实施例3 :用PEG-NHS (2kD)PEG化mTG PEG:mTG比对PEG化产物尺寸和分布的影
Ml材料:活化的PEG mPEG~ 戊二酸酯-NHS 2kDa( SunBright ME_020CS，N0F corporation,Japan)。利用SP-琼脂糖离子交换层析进一步纯化的Ajinimoto actival0%。活性pH 6的O. 2M柠檬酸钠中604单位/ml。朽1檬酸钠、Hepes、SDS和β巯基乙醇来自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考马斯G-250染色剂来自Bio-Rad。分子量标记物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I单位mTG活性将在pH 6. 0、37°C下每分钟从N-CBZ-Gln-Gly和羟基胺催化形成Ι.ΟμπιοΙ氧肟酸盐。反应(20(^1)包括1511/1111 mTG, pH 8的IOOmM Hepes和不同浓度的PEG NHS (2kD)。将反应在37°C下温育2小时，然后添加10 μ I I. 5Μ甘氨酸(71mM最终浓度)以中和还未与酶发生反应的PEG-NHS分子。使各反应的样本通过在SDS和β巯基乙醇存在下于90°C加热变性，并利用SDS-PAGE (8%解析凝胶，4%积层凝胶，Mini-Protean电泳系统，BioRad)进行分析。为使蛋白质显现，将凝胶用生物安全考马斯G-250染色剂染色，然后用水去染色。用CanoScan 8800F扫描仪扫描凝胶，图像显示在中图3，证明利用不同浓度PEG-NHS (2kD)得到的PEG化mTG的SDS-分析。泳道分配如下泳道I :分子尺寸标记物泳道2 1. 75mg/ml PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 0. 74泳道3 :3. 5mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 I. 48泳道4 7mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 2. 97泳道5 14mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 5. 93泳道6 28mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 11. 86
泳道7 56mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 与赖氨酸的比 23. 72如图3所示，PEG-NHS量增加导致凝胶上的酶具有増大的表观分子量。实施例4 :用于确定PEG化程度的TNBS分析材料:甘氨酸和5%TNBS溶液(苦基磺酸)来自Sigma Aldrich。碳酸氢钠来自Frutarom (Israel)。
通过在500碳酸氢盐缓冲液(pH 8. 5)中混合5%TNBS I制备稀释的TNB S溶液。分光光度计是Anthelie Advanced (Secomam)。对于校准曲线，在碳酸氢盐缓冲液(pH 8. 5)中制备下列甘氨酸溶液I μ g/ml、
2μ g/ml>4 μ g/ml>8 μ g/ml。将O. 5ml稀释TNBS溶液与Iml标准甘氨酸溶液或样本混合。混合物在37°C下温育2小时。接着，添加0.5ml 10%SDS溶液和O. 25ml IM HCL以终止反应。将溶液转移到试管，并用分光光度计在335nm下读取O. D.。基于对甘氨酸建立的校准曲线，确定各PEG化mTG的游离NH2基团的百分比。%PEG 化=100-% 游离 NH2计算得出的PEG 化 mTG 的平均 MW :38，000+ (%PEG 化100X 18X5000)。结果显示在下表I。

1.交联基质，包含通过改性酶分子交联的底物聚合物，所述改性酶分子具有在通过交联所述聚合物形成所述基质时改变所述交联基质中所述酶分子的感知量的改性。
2.权利要求I所述的基质，其中所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子实际尺寸的改性。
3.权利要求I所述的基质，其中所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子流体动力学体积的改性。
4.权利要求I所述的基质，其中所述改性酶分子具有通过相比未改性酶改变所述改性酶的等电点(Pl)使所述改性酶分子的静电荷变为与所述底物聚合物的净电荷符号相反的改性。
5.权利要求4所述的基质，其中所述改性在所述酶的赖氨酸的ε-氨基，所述改性通过选自琥珀酰化(用琥珀酸酐)、乙酰化(用乙酸酐)、氨甲酰化(用氰酸酯)、还原烷基化(醛)和用马来酸酐处理的方法。
6.权利要求4所述的基质，其中所述改性在一个或多个包含所述酶的羧酸的侧链以减少负电荷数。
7.权利要求2-6中任一项所述的基质，其中所述改性包括使至少一个分子或部分共价或非共价连接到所述改性酶分子上。
8.权利要求7所述的基质，其中所述改性包括使改性分子共价连接到所述改性酶分子上。
9.权利要求8所述的基质，其中所述改性酶分子相比于非改性酶具有降低的扩散速度和降低的交联速度，但相比于非改性酶具有至少相似的测量酶活性。
10.权利要求9所述的基质，其中降低的交联速度为非改性酶交联速度的至少10%。
11.权利要求9所述的基质，其中所述改性分子包括载体或聚合物。
12.权利要求11所述的基质，其中所述聚合物包括合成聚合物、纤维素聚合物、蛋白质或多糖。
13.权利要求12所述的基质，其中所述纤维素聚合物包括羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素中的一种或多种。
14.权利要求12所述的基质，其中所述多糖包括葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、透明质酸或淀粉衍生物中的一种或多种。
15.权利要求12所述的基质，其中所述改性分子包括PEG(聚乙二醇)。
16.权利要求15所述的基质，其中所述PEG包括PEG衍生物。
17.权利要求16所述的基质，其中所述PEG衍生物包括活化的PEG。
18.权利要求17所述的基质，其中所述活化的PEG包括甲氧基PEG(mPEG)、其衍生物、mPEG-NHS、mPEG的琥珀酰亚胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS)、mPEG-戊二酸酯-NHS、mPEG-戊酸酯-NHS、mPEG-碳酸酯-NHS、mPEG_ 羧甲基-NHS、mPEG_ 丙酸酯-NHS、mPEG_ 羧戊基-NHS)、mPEG-硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-异氰酸酯、mPEG-环氧化物中的一种或多种或其组合。
19.权利要求17或18所述的基质，其中所述活化的PEG与所述酶上的胺基或巯基发生反应。
20.权利要求17-19中任一项所述的基质，其中所述活化的PEG与所述活化酶上的赖氨酸残基的摩尔比在O. 5至25的范围内。
21.权利要求17-20中任一项所述的基质，其中所述活化的PEG是单功能、异双功能、同双功能或多功能的。
22.权利要求17-21中任一项所述的基质，其中所述活化的PEG是分支PEG或多臂PEG。
23.权利要求17-22中任一项所述的基质，其中所述活化的PEG的尺寸在1000道尔顿至40，000道尔顿的范围内。
24.上述权利要求中任一项所述的基质，进一步包括未共价结合到所述酶或所述底物聚合物上的共聚物。
25.权利要求24所述的基质，其中所述共聚物包括多糖或纤维素聚合物。
26.权利要求25所述的基质，其中所述多糖包括葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、透明质酸或淀粉衍生物。
27.权利要求25所述的基质，其中所述纤维素聚合物包括羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素。
28.上述权利要求中任一项所述的基质，其中所述改性酶分子通过使所述改性酶分子交联多个其他酶分子从而形成多个交联酶分子的聚集体而改性。
29.上述权利要求中任一项所述的基质，其中所述改性酶分子的改性或改性程度影响所述基质的至少一个性质。
30.权利要求29所述的基质，其中所述至少一个性质选自拉伸强度、刚性、所述底物聚合物的交联程度、粘性、弹性、挠性、断裂张力、断裂应力、泊松比、溶胀能力和杨氏模量或其组合。
31.上述权利要求中任一项所述的基质，其中所述改性酶的改性程度决定所述改性酶在所述基质中的移动性或自所述基质扩散。
32.权利要求31所述的基质，其中相比于非改性酶和所述蛋白质的溶液或基质，所述改性酶的所述改性降低了所述改性酶在所述改性酶和所述蛋白质的溶液中或在所述改性酶和所述蛋白质的基质中的扩散系数。
33.上述权利要求中任一项所述的基质，其中所述改性酶的改性程度决定一个或多个基质机械性质。
34.上述权利要求中任一项所述的基质，其中所述改性酶分子相于非改性酶分子显示 交联速度在交联聚合物中与在溶液中相比更大的差异。
35.控制基质形成的方法，包括使酶分子改性，其改性是在形成所述基质时改变所述交联基质中所述酶分子的感知量；混合所述改性酶分子与至少一种底物聚合物，所述至少一种底物聚合物是所述改性酶分子的底物；和通过所述改性酶分子交联所述至少一种底物聚合物形成所述基质，其中形成所述基质至少部分由所述酶分子的所述改性控制。
36.权利要求35所述的方法，其中所述改性随着所述至少一种底物聚合物的交联程度增加而降低所述改性酶分子的交联速度。
37.权利要求36所述的方法，其中将所述改性酶分子和所述至少一种底物聚合物在溶液中混合，使得所述改性随着所述溶液的粘性增加而控制所述至少一种底物聚合物的交联程度。
38.权利要求37所述的方法，其中所述改性包括在pH范围7至9下PEG化所述酶。
39.权利要求38所述的方法，其中所述PEG化反应的pH为7.5-8. 5。
40.上述权利要求中任一项所述的方法或基质，其中所述至少一种底物聚合物包括选自天然可交联的聚合物、可由所述改性酶交联的部分变性的聚合物和包含可由所述改性酶交联的官能基团或肽的改性聚合物的底物聚合物。
41.权利要求40所述的方法或基质，其中所述至少一种底物聚合物包括明胶、胶原、酪蛋白或白蛋白或改性聚合物，并且其中所述改性酶分子包括改性转谷氨酰胺酶和/或改性氧化酶。
42.权利要求41所述的方法或基质，其中所述至少一种底物聚合物包括选自由明胶组成的组，该明胶通过部分水解动物组织或从动物组织获得的胶原而获得，其中所述动物组织是选自下组，该组由以下各项组成动物皮肤、结缔组织、鹿角、角、骨、鱼鳞和用细菌、酵母菌、动物、昆虫或植物系统产生的重组明胶或任何类型的细胞培养物或其任意组合。
43.权利要求42所述的方法或基质，其中所述明胶是哺乳动物或鱼类起源的。
44.权利要求43所述的方法或基质，其中所述明胶是A型(酸处理的)或B型(碱处理的)。
45.权利要求44所述的方法或基质，其中所述明胶是250-300白化(bloom)。
46.权利要求43所述的方法或基质，其中所述明胶具有75-150kda的平均分子量。
47.权利要求41-46中任一项所述的方法或基质，其中所述改性转谷氨酰胺酶包括改性微生物转谷氨酰胺酶。
48.权利要求47所述的方法或基质，其中所述改性聚合物被改性从而允许通过所述改性微生物转谷氨