专利名称：一种快速提高10～30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法技术领域本发明属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种利用高压脉冲电场技术快速提高蛋清抗氧化肽活性的方法，能够实现物料流经高压脉冲电场双电极的时间在50 2000 μ s内，蛋清蛋白肽抗氧化活性的DPPH清除率由64%提高到80. 4%， FRAP值由1. 32提高到1. 52，稳定性由池延长至他，达到了提高活性和增强稳定性的目的。随着功能活性肽的研究不断深入，蛋清蛋白肽的研究也受到了越来越多的关注。 功能性食品是当下的研究热点，很多研究发现，由天然来源提取的功能性肽具有很强的抗氧化性，能够在一定程度上清除自由基，防止体内脂质过氧化，对于人体预防疾病、保护健康的意义重大。为了提高蛋白质资源的利用率，科学家对一些作为低值品或者作为废物处理的蛋白质进行了大量研究，主要研究方向包括乳蛋白肽、昆虫蛋白肽、深海鱼蛋白肽、大豆多肽等。而鸡蛋作为人体的重要食物来源，随着食品产业和医疗水平的不断发展，蛋清功能肽的研制受到了越来越多的关注。蛋清蛋白中含有卵白蛋白、卵铁转蛋白和溶菌酶等重要的生物活性物质，并富含Gly、Tyr, Arg等多种人体必需氨基酸，其抗氧化活性表现在可有效提高还原力，清除自由基，抑制脂质过氧化和较强的体外抗氧化能力。中国禽蛋产量居世界首位，鸡蛋占禽蛋总量的82%，蛋清作为我国来源丰富的食物蛋白，通过精深加工技术可以提高它的附加值，增加经济效益。我国对鸡蛋蛋白的精细加工研究正逐步加深，但对蛋清肽类物质发挥特定功能机理的研究仍处于初步探索阶段。因此，以蛋清蛋白为研究对象， 制备高活性、高稳定性的蛋清蛋白肽并深度探讨其机理具有重大的现实意义和社会效益。目前的研究主要集中于蛋清蛋白肽的酶解和分离纯化，对于如何稳定和提高其抗氧化活性的研究则为数不多。国内外的学者对抗氧化肽的研究主要集中在酶解工艺、分离纯化工艺参数优化及功能鉴定方面，关注于抗氧化活性的提高方法、作用机理、影响因素以及稳定性等方面的研究则相对较少。尤其蛋清蛋白肽作为一种新开发的功能性因子，研究领域还未拓宽，仍未见有研究指出可以选用何种工艺方法来稳定提高其抗氧化活性。选用高压脉冲电场技术提高蛋清蛋白肽的抗氧化活性，具有较好的可行性、高效性和环保性。高压脉冲电场技术是一项处于国际研究热点的非热加工高新技术。通过增加细胞膜通透性，减弱细胞膜强度，最终导致细胞膜破坏，膜内细胞物质外流，膜外物质渗入， 具有耗能少、处理时间短、效率高、不易引起蛋白质和核糖核酸变性的优点。PEF技术优势具体体现在=(I)PEF处理通常是选取室温、低于室温、或稍微高于室温等温度条件下进行操作，因此，对食品质量属性来说，PEF技术避免或很大程度上减少了食品感官和物理特性的有害变化；0)PEF技术具有处理时间非常短，传递快速，适合工业化生产。(3)PEF技术具有处理均勻、安全等特点。此外，相关研究发现，PEF技术对不同的抗氧化肽有快速激活或抑制作用。本发明专利是在大量试验研究的基础上，优化获得高压脉冲电场快速提高蛋清蛋白肽抗氧化活性的技术参数。经研究发现，不同分子量的蛋清蛋白肽，所表现的抗氧化活性功效也不同，所选取的原料性质对成品质量的影响很大。本专利是根据前期试验结果，采用了一整套科学、严密的蛋清蛋白肽水解制备工艺，具体工艺流程为以蛋清蛋白粉为原料，将蛋白粉用蒸馏水配制成5% (W/W)的溶液，均勻搅拌，放置在90°C的水浴锅中加热lOmin，将肽液的pH值控制在8，然后放置在50°C的水浴锅中加热，将3%的碱性蛋白酶溶液加入肽液中，为抑制酶活性将肽液在90°C的水浴锅中再加热lOmin，最后进行超滤，控制温度在40°C，膜通量在 3. 5 4. 0(L/m2 · h)，操作压力在8 lOpis，即得到分子量为10 30kDa的蛋清蛋白肽。抗氧化肽的活性大小多用DPPH清除率和FRAP值进行衡量，测试数值越大代表其活性越强，即抗氧化能力越强，蛋清蛋白肽的活性也多用这两种指标进行分析比较。不同分子量的蛋清蛋白肽具有不同的活性功效，有研究证实蛋清高F值寡肽对DPPH自由基清除率可以达到60 90%，但影响因素较多，稳定性较差。本专利选用的原料是分子量为10 30kDa的蛋清蛋白肽，旨在于利用高压脉冲电场技术，使其在短时间内迅速提高抗氧化活性，并增强稳定性。总之，本专利要求保护的是一种以10 30kDa蛋清蛋白肽为原料，利用流动式高压脉冲电场装置，安装长度与半径均适宜的电极，控制高压脉冲电场装置中的电场强度和频率在其适宜范围内，将适宜浓度和适宜PH值的肽液以一定的恒流速度泵入高压脉冲电场电极处理室进行电场处理，最后收集于成品罐中，实现了在短时间内提高肽液的抗氧化活性，增强稳定性的技术突破，其优势主要体现在以下两个方面第一，本专利技术是以高压脉冲电场技术为核心技术。特别强调的是，将高压脉冲电场技术应用于提高蛋清蛋白肽活性的研究中，其优势突出体现在=(I)PEF法提高蛋清蛋白肽活性，可使其DPPH自由基清除率可提高20%以上，FRAP值可提高15%以上，稳定性可维持6 他；(2) PEF法处理时间短，仅在2000 μ s以内，并可以进行连续工业化生产；(3) 高压脉冲电场能耗较低，更适合于蛋清蛋白肽附加值产品开发的绿色低碳主题。
第二，本专利技术是以10 30kDa蛋清蛋白肽为原料，可以由蛋清蛋白粉经酶水解制得，来源广泛，成本低廉，适于蛋品工业副产物的增值增效等技术应用。随着功能性食品产业和医疗水平的不断发展，功能性肽产品的研制受到了越来越多的关注，同时对功能性肽产品的需求量也越来越大。因此，利用高新技术深入研究蛋清蛋白肽的提取工艺，并将其转化为工业化产品，不仅推动了鸡蛋中多种功能因子的研究开发，而且为促进蛋制品的综合利用的研究进程、改善蛋白质的吸收利用率等方面奠定了科学研究基础。发明内容
本专利需要解决的技术问题
以10 30kDa蛋清蛋白肽为研究对象，以DPPH清除率和FRAP值为主要衡量抗氧化活性指标，通过单因素设计、响应面设计、正交多项式回归设计等研究方法，优选出借助高压脉冲电场技术能够实现物料流经高压脉冲电场双电极的时间在50 2000 μ s内，蛋清蛋白肽抗氧化活性的DPPH清除率由64%提高到80. 4%，FRAP值由1. 32提高到1. 52，稳定性由池延长至8h，实现快速提高抗氧化活性和增强稳定性的目的。
本专利的技术方案
1. 一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，利用高压脉冲电场技术，经过充氮调配、调节料液PH值、设定高压脉冲电场参数、调节料液恒流速度、高压脉冲电场处理的工艺过程，可以实现物料流经高压脉冲电场双电极的时间在50 2000 μ s内，其DPPH清除率由64%提高至80.4%，FRAP值由1. 32提高至1. 52，稳定性由 3h延长至8h ；
1)所述的充氮调配过程，是选用10 30kDa的蛋清蛋白肽粉为原料，选用去离子水、纯净水、渗透水、蒸馏水中的任意一种作为溶剂，配制2 lOmg/mL的蛋清蛋白肽溶液， 测定其DPPH清除率为64%，FRAP值为1. 32，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中， 并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950 1200mL/min，借助磁力搅拌1 IOmin 后，备用；
2)所述的调节料液pH值过程，是利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的PH值，使其至7 9的范围内，备用；
3)所述的设定高压脉冲电场参数过程，是将长度为0. 5 3. 5mm、半径为0. 5 0.8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2 3次，再设定装置中的电场强度为10 50kV/cm，电场频率为 500 3000Hz的工作状态下，待机；
4)所述的调节料液恒流速度过程，首先是将经步骤2)调节料液pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，并在步骤幻所设定高压脉冲电场参数条件下，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为 1 lOmL/min后，关闭装置待机；
5)所述的高压脉冲电场处理过程，是将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经步骤2)调节料液pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性表现为DPPH清除率为80. 4%, FRAP值1.52，稳定性8h的10 30kDa蛋清蛋白肽溶液。
2. 一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，经过高压脉冲电场技术处理后的DPPH清除率为80. 4%，FRAP值1. 52，稳定性他的10 30kDa蛋清蛋白肽溶液，可以分装于3 7mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30 _25°C，预冻时间为1 4h，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力30 50Pa，冻干时间12 14h，直至含水量为1 2%，即为高活性的10 30kDa蛋清蛋白肽冻干粉。
3.根据权利要求1 2所述的一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的蛋清蛋白肽粉，可以为鸡蛋蛋清蛋白肽粉、鸭蛋蛋清蛋白肽粉、 鹅蛋蛋清蛋白肽粉、鹌鹑蛋蛋清蛋白肽粉、鸵鸟蛋蛋清蛋白肽粉。
4.根据权利要求1 2所述的一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的配制溶剂，可以选用去离子水、纯净水、渗透水、蒸馏水中的任意一种。
5.根据权利要求1 2所述的一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的氮气，可以优选纯度为98%以上。
6.根据权利要求1 2所述的一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的用蒸馏水清洗高压脉冲电场内物料循环管路2 3次中的蒸馏水，可以用去离子水、纯净水、渗透水、蒸馏水中的任意一种。
7.根据权利要求1 2所述的一种快速提高10 30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的高压脉冲电场激活参数调控过程，电场强度优选为10 40kV/ cm,电场频率优选为1000 3000Hz。
8.根据权利要求1 2所述的高压脉冲电场激活处理过程，其特征在于，电极激活肽液的优选时间为150 2000 μ s，定时收集抗氧化活性表现为DPPH清除率为80. 4%, FRAP值1. 52，稳定性他的10 30kDa蛋清蛋白肽溶液。
申请发明技术效果
(1)本发明实现了 10 30kDa蛋清蛋白肽溶液流经高压脉冲电场双电极时间为 50 2000 μ s内，其DPPH清除率由64%提高至80. 4%，FRAP值由1. 32提高至1.52，稳定性由汕延长至他；
(2)本发明核心技术为高压脉冲电场技术，属于非热加工技术领域的高新技术，电场能耗较低，更适合于蛋清蛋白肽附加值产品开发的绿色低碳主题；
(3)本发明所设计10 30kDa蛋清蛋白肽的抗氧化肽产品生产技术路线简单，所需设备投资少，产品价值高，并有利于促进鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋等禽蛋类产品的综合利用和产业开发。

实施例1
选用10 30kDa的鸡蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用去离子水为溶剂，配制10mg/mL 的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为64%，FRAP值为1. 32，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的PH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为lOkV/cm，电场频率为3000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经 PH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为池，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的 10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。
实施例2
选用10 30kDa的鸭蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用蒸馏水为溶剂，配制10mg/mL的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为63%，FRAP值为1. 30，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌 Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的pH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75 %的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为lOkV/cm，电场频率为3000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为池，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。
实施例3
选用10 30kDa的鹅蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用去离子水为溶剂，配制10mg/mL 的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为63%，FRAP值为1. 30，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的PH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75%的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为lOkV/cm，电场频率为3000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经 PH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为池，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的 10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。
实施例4
选用10 30kDa的鸡蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用蒸馏水为溶剂，配制5mg/mL的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为63%，FRAP值为1. 30，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌 Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的pH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75 %的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为20kV/cm，电场频率为2000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为池，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。
实施例5
选用10 30kDa的鸭蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用去离子水为溶剂，配制5mg/mL的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为63%，FRAP值为1. 30，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌 Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的pH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75 %的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为20kV/cm，电场频率为2000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为3h，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。
实施例6
选用10 30kDa的鹅蛋蛋清蛋白肽粉为原料，用蒸馏水为溶剂，配制5mg/mL的蛋清蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率为63%，FRAP值为1. 30，稳定性可维持池，将其迅速置于密闭容器中，并将瓶塞处与氮气管路相接，要求氮气流量为950mL/min，借助磁力搅拌 Smin ；利用0. IM盐酸溶液和0. IM氢氧化钠溶液，调节经充氮调配处理后的蛋清蛋白肽溶液的pH值至7 ；将长度为2. 5mm、半径为0. 8mm的双电极安装于高压脉冲电场装置上，依次选用75 %的乙醇、蒸馏水分别清洗高压脉冲电场内物料循环管路2次，再设定装置中的电场强度为20kV/cm，电场频率为2000Hz的工作状态下，待机；将蛋清蛋白肽溶液倒入高压脉冲电场装置的物料入口，调节恒流泵工作状态，使蛋清蛋白肽溶液在高压脉冲电场装置内的恒定流速为lmL/min后，关闭装置待机；将高压脉冲电场装置全部物料管路中充满经pH值处理后的蛋清蛋白肽溶液，计算高压脉冲电场的双电极至出料口的管路溶液体积，核算出开启恒流泵后出未经电场处理的物料液体所需历经的时间，然后开启恒流泵和高压脉冲电场，定时收集抗氧化活性和稳定性均增高的10 30kDa蛋清蛋白肽处理溶液；将溶液分装于5mm的冷冻盘中，进行预冻，预冻温度为-30°C，预冻时间为池，然后再置于真空冷冻干燥机内，真空冷冻干燥的工作压力50Pa，冻干时间13h，直至含水量为2%，即为高活性的10 30kDa鸡蛋蛋清蛋白肽冻干粉。


本发明是公开一种快速提高10～30kDa蛋清蛋白肽抗氧化活性的方法，属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，特别涉及到一种利用高压脉冲电场处理为核心技术，以10～30kDa蛋清蛋白肽为研究对象，以DPPH清除率和FRAP值为主要衡量抗氧化活性指标，优选出借助高压脉冲电场技术能够实现物料流经高压脉冲电场双电极的时间在50～2000μs内，蛋清蛋白肽抗氧化活性的DPPH清除率由64％提高到80.4％，FRAP值由1.32提高到1.52，稳定性由3h延长至8h，实现快速提高抗氧化活性和增强稳定性的目的。本发明技术不仅为快速提高蛋清抗氧化肽活性的技术研究提供新思路，也为高活性蛋清蛋白肽系列化产品开发及应用提供新途径。