专利名称：包含格拉默或其药用盐的储药系统的制作方法醋酸格拉默共聚物-1，还称作醋酸格拉默并以商标Copaxone 销售，包含多肽的醋酸盐，上述多肽含有L-谷氨酸、L-丙氨酸、L-酪氨酸和L-赖氨酸。氨基酸的平均摩尔分数分别为O. 141,0. 427,0. 095和O. 338，并且共聚物-I的平均分子量为4，700至11，000道尔顿。化学上，醋酸格拉默是指定的L-谷氨酸聚合物，并具有L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸，醋 酸(盐)。它的结构式是(Glu, Ala, Lys, Tyr) xCH3C00H (C5H9NOiC3H7NO2-C6H14N2O2-C9H11NO3)XC2H4O2 [CAS-147245-92-9]，大约比率为 Glu14Ala43Tyr10Lyz34X (CH3COOH) 20。 Copaxone咒是澄清、无色至微黄色、无菌、非致热溶液，用于皮下注射。每毫升包含20mg醋酸格拉默和40mg甘露醇。溶液的pH范围大约为5. 5至7. O。作用机制醋酸格拉默是无规聚合物(平均分子质量为6. 4kD)，包括4种在髓磷脂碱性蛋白中发现的氨基酸。醋酸格拉默的作用机制是未知的，虽然已出现这种共聚物的ー些重要的免疫学特性。给予共聚物-I会使T细胞群体从促炎Thl细胞移动到调节Th2细胞，其抑制炎性反应(FDA Copaxone 标签)。鉴于它与髓磷脂碱性蛋白的相似性，共聚物-I还可以作为诱饵，来转移相对于髓磷脂的自身免疫反应。然而，至少在治疗的早期，血脑屏障的完整性并不受到共聚物-I的明显影响。共聚物-1是非自身抗原，已证明其可以抑制由各种致脑炎因子(包括小鼠脊髄匀浆(MSCH))诱导的实验性变应性脑脊髄炎(EAE)，其包括髓磷脂抗原，如髓磷脂碱性蛋白(MBP) (Sela M et al. ,Bull Inst Pasteur(1990)88 303-314)、蛋白脂质蛋白(PLP)(Teitelbaum D et al. , J Neuroimmunol (1996) 64 209-217)和在各种物种中的髓憐脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG) (Ben-Nun A et al. , J Neurol (1996) 243 (Suppl 1)S14_S22)。EAE是多发性硬化症的接受模型。已证明，当皮下、腹腔内、静脉内或肌内注射时，共聚物-1是活性的(Teitelbaum D et al. ,Eur J Tmmunol (1971)I 242-248;Teitelbaum D et al. , EurJ Immunol (1973) 3273-279)。在III期临床试验中，发现，每日皮下注射共聚物-1会放慢无能的进展并降低加剧-缓解多发性硬化症的复发率(Johnson KP, Neurology(1995) 165-70 ;www. copaxone. com)。共聚物-1治疗目前限于姆日皮下给予。在US6，214，791中披露了通过摄入或吸入共聚物-I来进行治疗，但还未表明这些给予途径在人患者中可以获得临床疗效。疗效在患有复发-缓解多发性硬化症(RR MS)的患者中支持醋酸格拉默在降低复发频率方面的有效性的证据来自两项安慰剂对照试验，其均使用20mg/天的醋酸格拉默剂量。在RR MS的安慰剂对照试验中没有研究其它剂量或剂量方案(www. copaxone. com)。认可的20mg剂量和40mg剂量的比较试验表明，在这些剂量之间疗效没有显着性差异(The 9006trial; Cohen JA et al. , Neurology (2007) 68 939-944)。醋酸格拉默的各种临床试验正在进行中。这些临床试验包括用较高剂量的醋酸格拉默进行的研究(40mg - FORTE研究)；对临床孤立性综合征患者进行的研究(PreCISe研究)；以及许多组合和诱导方案，其中和另ー种活性产物一起或在其以后给予醋酸格拉默。副作用 目前，多发性硬化症的所有特别认可的治疗涉及活性物质的自我注射。经常观察到的注射部位问题包括刺激、超敏感性、炎症、疼痛和甚至坏死(在干扰素Iβ治疗的情况下)以及低水平的患者依从性。副作用通常包括在注射部位的团块(注射部位反应)、疼痛、发热、和寒战。这些副作用的特性通常是温和的。偶尔在注射以后数分钟发生反应，其中存在潮红、呼吸短促、焦虑和快速心搏。这些副作用在30分钟内减退。随着时间的推移，可以在注射部位发展可见凹痕，这是由于脂肪组织的局部破坏，称作皮下脂肪萎縮。因而，期望ー种可替换的给予方法。按照FDA的处方标注，已报道了醋酸格拉默的更严重的副作用，它们包括对身体的心血管系统、消化系统(包括肝脏)、造血及淋巴系统、肌肉骨骼系统、神经系统、呼吸系统、特殊感官(尤其是眼)、泌尿生殖系统的严重的副作用；还报道了代谢和营养障碍；然而，还没有明确建立在醋酸格拉默和这些不利影响之间的联系(FDA Copaxonel財示签)。储药系统(depotsystem)通过静脉内(IV)、肌内(IM)、或皮下(SC)注射的胃肠道外途径是递送较小和较大分子量药物的最常见和最有效的形式。然而，起因于针扎的疼痛、不适和不方便使得这种药物递送方式成为患者最少优选的。因而，可以在最低限度減少注射总数的任何药物递送技术是优选的。在实践中，可以通过使用可注射的储药制剂来减小给予药物的频率，上述储药制剂能够以缓慢但可预见的方式来释放药物，因而可以改善依从性。对于大多数药物，取决于剂量，可以减小注射频率从每日一次到毎月一次或两次或甚至更长时间出个月)。除改善患者舒适度以外，通过消除高峰和低谷，储药制剂的药性的较小频繁注射可以缓和血浆浓度-时间曲线。血浆分布的上述缓和有可能在大多数情况下不仅提高治疗效果，而且可以减少任何不需要的事件，如免疫原性等(经常伴随较大分子量药物)。微颗粒、植入物和凝胶是在实践中使用的可生物降解聚合物装置的最常见形式，用于延长药物在体内的释放。在注射以前立刻将微颗粒悬浮在水介质中，并且可以在悬浮液中加载多达40%固体。借助于处于干燥状态的特殊针而不需要水介质，来将植入物/棒剂型递送到SC/IM组织。棒/植入物的这种特点便于递送较高质量的剂型以及药物含量。另外，在棒/植入物中，最初爆发的问题被最小化，这是由于和微颗粒相比，植入物的小得多的面积。除可生物降解系统之外，还有不可生物降解植入物和可以佩戴在体外的输注泵。不可生物降解植入物需要医生的访问不仅为了将装置植入SC/頂组织，而且为了在药物释放期以后除去它们。包含微颗粒制剂的可注射组合物特别容易出现问题。和在其它类型的可注射悬浮液中的O. 5-5%固体相比，微颗粒悬浮液可以包含多达40%的固体。另外，和建议用于IM或SC给予的小于5μπι的颗粒尺寸相比，在可注射储药产品中所使用的微颗粒的尺寸高达约250 μ m(平均60-100 μ m)。更高浓度的固体、以及更大的固体颗粒尺寸需要更大尺寸的针(约18-21号规格)来注射。总之，尽管很少使用较大的和不舒服的针，但和用较小针每天 药物注射相比，患者还是喜欢不经常给予剂型。聚乳酸(PLA)的可生物降解聚酯以及丙交酯和こ交酯的共聚物，称作聚(丙交酷-こ交酷)(PLGA)，是用于可生物降解剂型的最常见的聚合物。PLA是疏水性分子并且PLGA比PLA更快地降解，这是因为更具亲水性的こ交酯基团的存在。这些生物相容性聚合物经受酯键的随机的非酶促的水解切割以形成乳酸和こ醇酸，其是体内的正常代谢化合物。可吸收缝线、小夹和植入物是这些聚合物的最早应用。在1970年，南方研究所(Southern Research Institute)开发了第一种合成的可吸收缝线(DexOil )。描述 PLGA聚合物在缓释剂型中的应用的第一个专利出现于1973年(US 3，773，919)。今天，PLGA聚合物可商业上获自多个供应商Alkermes (Medisorb聚合物)、Absoroable Polymers International [先目U 的 Birmingham Polymers (Durect 的一个部门)]、Purac和Boehringer Ingelheim0除PLGA和PLA之外，天然纤维素聚合物如淀粉、淀粉衍生物、葡聚糖和非PLGA合成聚合物，也被开发为在上述系统中的可生物降解聚合物。目前，不能获得醋酸格拉默的长效剂型。这是巨大的未满足的医疗需求，因为这些剂型将极为有利于许多患者，尤其是有利于具有神经系统症状或身体残疾的那些患者。
本发明提供了长效胃肠道外药物组合物，该组合物包含治疗有效量的格拉默的药用盐，例如，醋酸格拉默。尤其是，本发明提供了长效药物组合物，该组合物包含治疗有效量的储药形式(cbpot form)的格拉默盐，适用于在医疗上可接受的位置胃肠道外给予对其需要的主体。本发明进一歩提供了一种用于治疗多发性硬化症的方法，该方法包括胃肠道外给予或植入组合物，该组合物包含治疗有效量的格拉默的药用盐，优选醋酸格拉默。出乎预料地，现已发现，根据本发明的原则的长效药物组合物相对于市售每日注射剂型可以提供相同或更好的疗效，并在局部和/或全身水平具有降低的副作用的发生率和/或严重性。根据ー些实施方式，醋酸格拉默包含L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸、和L-酪氨酸的醋酸盐，摩尔比率为约O. 14谷氨酸、约O. 43丙氨酸、约O. 10酪氨酸和约O. 33赖氨酸。根据其它实施方式，醋酸格拉默或格拉默的其他药用盐包含约15至约100个氨基酸。根据某些实施方式，可植入储药适合于皮下或肌内植入。根据可替换的实施方式，长效胃肠道外药物组合物包含用于格拉默盐如醋酸格拉默的药用可生物降解或不可生物降解载体。根据ー些实施方式，载体选自PLGA、PLA、PGA、聚己内酷、聚羟基丁酸酷、聚原酸酷、聚链烷酸酐、明胶、胶原、氧化纤维素、和聚磷臆。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。根据，本发明的长效药物组合物具有通过水包油包水双重乳化エ艺(water-in oil-in water double emulsification process)制备的微颗粒的形式。在目前优选的实施方式中，本发明的长效药物组合物包括内部水相，其包含治疗有效量的格拉默的药用盐；水不混溶的聚合物相，其包含选自可生物降解和不可生物降解聚合物的载体；以及外部水相。在其它目前优选的实施方式中，水不混溶的聚合物相包含选自PLA和PLGA的可生物降解聚合物。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。在另外的实施方式中，外部水相包含表面活性剤，其选自聚こ烯醇(PVA)、聚山梨酷、聚氧化こ烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物和纤维素酷。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。本发明涵盖适用于植入对其需要的个体的储药形式的醋酸格拉默或格拉默的任何其它药用盐用于治疗多发性硬化症的用途。本发明进一步涵盖使用醋酸格拉默的可植入储药，其适用于提供格拉默在主体中 的延长释放或延长作用。在本发明范围内的是储药形式的格拉默的药用盐，其适合用于治疗多发性硬化症或提供格拉默在主体中的延长释放或延长作用。本发明还包括醋酸格拉默与至少ー种另外药物，优选地，免疫抑制剂，尤其是芬戈莫德(fingoIimod)的组合。根据ー些实施方式，长效药物组合物适用于每周一次到每6个月一次的给药时间表。根据特定的实施方式，组合物适合于从每2周一次到毎月一次的给药。根据ー些实施方式，长效组合物包括20_750mg醋酸格拉默/注射的剂量。长效组合物的具体实例将包括可生物降解或不可生物降解微球体、任何适宜几何形状的植入物、可植入棒、可植入胶囊、可植入环、延长释放凝胶和易侵蚀基质。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。根据下文给出的详细描述，本发明的另外的实施方式和应用的全部范围将是显而易见的。然而，应当明了，详细描述和具体实施例，虽然指出本发明的优选实施方式，仅是说明性的，因为对于本领域技术人员来说，根据这种详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和改进将是显而易见的。
图I.在PBS中并在37° C下，醋酸格拉默自PLGA微颗粒制剂MPG-02-07的释放。表示的数据被归一化到存储在相同条件下的标准肽溶液。图2.在PBS中并在37。C下，醋酸格拉默自PLGA微颗粒制剂MPG-05R、08_11和格拉默的生育酚琥珀酸盐(1:1)的释放。表示的数据被归一化到存储在相同条件下的标准肽溶液。图3.在PBS中并在37° C下，醋酸格拉默自PLGA微颗粒制剂MPG-12 - 15的释放。表示的数据被归一化到存储在相同条件下的标准肽溶液。图4.在体外在PBS中并在37° C、pH7. 4下，醋酸格拉默自PLGA微颗粒制剂MPG-14SU-1 和 MPG-15SU-1 的释放。
图5.在体外在PBS中并在37° C、pH7. 4下，醋酸格拉默自PLGA微颗粒制剂MPG-14SU-2 和 MPG-15SU-2 的释放。

可以通过各种參数来确定“水包油包水(w/o/w)双重乳液”的颗粒尺寸，包括但不限于在此步骤中外加力的量、混合速度、表面活性剂类型和浓度等。适宜的颗粒尺寸为约I至 100 μ m。本发明的储药系统包括本领域技术人员已知的任何形式。适宜的形式包括但不限于可生物降解或不可生物降解微球体、可植入棒、可植入胶囊、和可植入环。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。另外包括延长释放凝胶储药和易侵蚀基质。每个可能性表示本发明的单独的实施方式。适宜的可植入系统描述于例如US 2008/0063687，其全部内容以引用方式结合于本文。如在本领域已知的，可以利用适宜的微型挤出机如那些例如在http://www. randcastle. com/prodinfo. html中描述的微型挤出机，来制备可植入棒。根据本发明的原则，相对于市售每日注射剂型，本发明的长效药物组合物可以提供相同或更好的疗效，并在局部和/或全身水平下，具有降低的副作用的发生率和降 低的副作用的严重性。在一些实施方式中，和大致相同剂量的醋酸格拉默的立即释放制剂相比，本发明的组合物可以提供格拉默在主体中的延长释放或延长作用。本发明包括醋酸格拉默或格拉默的任何其它药用盐与至少ー种其它活性剂的联合疗法。在本发明的范围内的活性剂包括但不限于干扰素，例如聚こニ醇化或非聚こニ醇化α-干扰素、或β_干扰素，例如干扰素β-Ia或干扰素β-lb、或τ-干扰素；具有可选的抗增生/抗肿瘤活性的免疫抑制剂，例如米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、或类固醇,例如甲泼尼龙、泼尼松或地塞米松,或类固醇分泌齐U，例如ACTH ;腺苷脱氨酶抑制剂，例如克拉屈滨(cladribine);相对于各种T细胞表面标记的IV免疫球蛋白G (例如如在Neurology, 1998, May50 (5) : 1273-81中所披露的)单克隆抗体，例如那他珠单抗(natalizumab) (ANTEGREN⑩)或阿仑单抗(alemtuzumab)；TH2促进细胞因子，例如IL-4、IL-10，或抑制THl促进细胞因子的表达的化合物，例如磷酸ニ酯酶抑制剂，例如己酮可可碱(pentoxifylline);解疫剂,其包括巴氯芬(baclofen)、地西泮(diazepam)、批拉西坦、丹曲林(dantrolene)、拉莫三嗪(lamotr igine)、利鲁唑(rifluzole)、替扎尼定、可乐定、β阻滞剂、赛庚啶、奥芬那君或大麻素；AMPA谷氨酸受体拮抗剂，例如2，3- ニ羟基-6-硝基-7-氨磺酰苯并(f)喹喔啉、[1，2，3，4，-四氢-7-吗啉基-2，3-ニ氧代-6-(三氟甲基)喹喔啉-i-基]甲基膦酸酷、I-(4-氨基苯基)-4-甲基-7，8-亚甲基-ニ氧-5H-2, 3-苯并ニB丫庚因(I- (4-aminophenyl) -4-methyl-7, 8-methylene-dioxy-5H-2, 3-benzodiazepine)、或(-)I- (4_ 氛基苯基)~4~ 甲基-7，8_ 亚甲基-ニ氧_4，5- ニ氢-3-甲基氨基甲酰基_2，3-苯并ニ吖庚因；VCAM-1表达的抑制剂或它的配体的拮抗剂，例如α 4 β I整联蛋白VLA-4和/或α -4-β ~7整联蛋白的拮抗剂,例如那他珠单抗(ANTLGRliN^.h抗巨噬细胞迁移抑制因子(Anti-MIF) ；xii)组织蛋白酶S抑制剂；xiii)mTor抑制剂。每个可能性表示本发明的単独的实施方式。目前优选的一种其它活性剂是？1￥720(2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)こ基]丙-1，3-ニ醇；芬戈莫德)，其属于免疫抑制剂。以下实施例用来更充分说明本发明的某些实施方式。然而，决不应将它们看作是限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易地设计本文披露的原则的许多变化和改进而不偏离本发明的范围。实施例
实施例I :一般制备方法某干PLGA的可沣射长效颗粒通过溶剂萃取/蒸发方法(单乳液)来制备微颗粒。将包含250mg的PLGA和200mg醋酸格拉默的50:50的ニ氯甲烷/こ醇溶液慢慢倒入包含2%PVA的水溶液(200ml)并在25° C下利用机械搅拌器(300rpm)加以乳化。在搅拌(IOOrpm)下蒸发有机溶剂2h。通过离心来收集如此形成的微颗粒并用蒸馏水洗涤以除去过多的乳化剤。然后冷冻干燥最终悬浮液以获得细粉。基于聚己内酯的可注射储药(depot)颗粒通过溶剂萃取/蒸发方法(单乳液)来制备微颗粒。将包含500mg聚己内酯和200mg醋酸格拉默的70:30的ニ氯甲烷/丙酮溶液慢慢倒入包含2%PVA、1%吐温80的水溶液(200ml),然后在25° C下利用机械搅拌器(500rpm)加以乳化。在搅拌(300rpm)下蒸发有机溶剂4h。通过离心来收集形成的微颗粒并用蒸馏水洗涤，以除去过多的乳化剤。然 后冷冻干燥最终悬浮液以获得细粉。某于PLGA的棺入棒通过溶剂萃取/蒸发方法来制备长度为20mm和直径为2mm的基于PLGA的可生物降解棒状植入物。将包含250mg的PLGA和200mg醋酸格拉默的50:50的ニ氯甲烷/こ醇溶液慢慢倒入特制的棒状模具。在室温的真空烘箱中蒸发有机溶剂12小吋。可替换地，通过在85-90° C下挤出250mg的PLGA和200mg格拉默的混合物来制备棒状植入物，其中利用模具直径为O. 8或I. Omm的螺杆式挤出机(Microtruder Rancastle RCP-0250或类似挤出机)。实施例2 :分析方法-醋酸格拉默的测定设备分光光度计分析天平,能够精确地称量到O. Olmg材料和试剂醋酸格拉默83%，作为參考标准2，4，6_ 三硝基苯横酸(TNBS,苦基横酸(picrylsulfonic acid), 170. 5mM), 5% 在MeOH 中O. IM硼酸盐缓冲液ρΗ9· 3 (十水四硼酸钠欄381. 37)纯化水O. 5、I. 0,2. O 和 7. OmL 的容量吸移管各种各样的玻璃器皿。制备格拉默储备溶液400 μ g/mL的制备将4. 8mg醋酸格拉默(效カ83%，作为參考标准的基础)称量到IOml容量瓶。添加大约7ml的O. IM硼酸盐缓冲液以在超声波浴中溶解醋酸格拉默。用O. IM硼酸盐缓冲液进ー步稀释溶液以获得格拉默储备溶液400 μ g/ml (作为基础)。O. 25%TNBS工作溶液的制备在使用前，用水(20倍；例如50 μ I和950 μ I水)稀释TNBS的5%储备溶液，以获得O. 25%TNBS工作溶液。柃准曲线标准制各 按照表1来制备8个格拉默校准标准溶液(cSTD ;各自4ml)。表1.醋酸格拉默的标准溶液


本发明提供了包含治疗有效量的格拉默的长效胃肠道外药物组合物。尤其是，本发明提供了长效药物组合物，该组合物包含治疗有效量的储药形式的醋酸格拉默，其适合于在医疗上可接受的位置给予对其需要的主体。上述储药形式适合于皮下或肌内植入或注射。