专利名称：波棱素化合物及其制法和其药物组合物与用途的制作方法 慢性病毒性肝炎是严重危害人民健康的常见传染病。据统计仅乙肝患者就占世界人口的5％。在我国病毒性肝炎的发病率高居世界首位，即约80％的肝炎患者集中在中国。目前我国现有病毒性肝炎患者达3000万人之多，每年有近50万人死于与乙肝有关的疾病。因此，慢性病毒性肝炎特别是乙型肝炎的治疗一直是世界医药界的难题。由于庞大的乙肝人群亟待得到治疗，因此，目前我国市场上慢性肝炎的治疗药物品种繁多，据不完全统计，中西药物已达700余种，但疗效肯定、副作用小的药物为数不多。尽管肝炎疫苗的推广对肝炎防治起到巨大的推动作用，但肝炎患者仍以每年近百万的速度增加。因此，研制结构新颖，作用肯定的新型抗肝炎药仍十分迫切。现有的药物中拉米夫啶是公认的抗肝炎病毒的药物，但是拉米夫啶价格昂贵，要求患者长期服药，疗程是无限期的，患者停药后反跳强烈并有较大的肝肾毒性。现在还没有既能杀肝炎病毒又能保护肝细胞的药物。葫芦科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱是一种生长在西藏的植物，未见对其的药用报道。
为了克服已有技术的不足之处，本发明的目的在于提供葫芦科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的抗病毒，抗化学性肝损伤，抗肿瘤的用途。本发明的另一目的在于提供葫芦科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物。本发明的又一目的在于提供葫芦科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物的制备方法。本发明的又一目在于提供含有波棱提取物的药物组合物，其包括作为活性成份的葫芦科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱的提取物及制药领域中常用的载体。
本发明的又一目的在于提供葫芦科植物Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物和含有其的药物组合物的抗病毒，抗化学性肝损伤，抗肿瘤的用途。
本发明的又一目的在于提供一种新的波棱素化合物。
本发明的又一目的在于提供一种新的波棱素的制备方法。
本发明的又一目的在于提供波棱素药物组合物，其包括作为活性成份的波棱素化合物及其异构体及制药领域中常用的载体。
本发明的又一目的在于提供波棱素衍生物及其组合物作为抗病毒，抗化学性肝损伤，抗肿瘤药物的应用。
本发明一方面涉及如通式(I)所示的波棱素，及其相关的对映异构体、非对映异构体、多晶形物、酯、盐和溶剂化形式 本发明也包括通式化合物I的衍生物，它们的立体异构体，它们的多晶形物，它们的药学上可接受的盐，它们的药学上可接受的溶剂化物。
本发明涉及如通式I所示化合物药效上可接受的衍生物或前药，意思是如通式I所示化合物的任何可接受的盐，酯和酯的盐；或者本发明化合物的其它衍生物，其在给予受者时，能直接或间接的提供本发明的化合物。尤其优选的衍生物和前药是，当这种化合物给予哺乳动物时，能增加本发明化合物稳定性的，和/或能增加本发明化合物生物利用度的(例如，使口服给药的化合物更易于吸收入血)，和/或能增加本化合物在相关于本物种的生物隔室(例如，肝脏，肿瘤)的分布。前药是任何和载体的通过共价键的相连的，当这种前药给予哺乳动物患者时，其在体内释放如通式I活性本化合物。优选的前药包括，但不限定于，增加水溶性或通过生物膜的活性透过性的基团连上如通式I的结构而形成的衍生物。通式I化合物的前药的制备是通过修饰在化合物中存在的取代基，用这样的方法，这种修饰对于本化合物是能分离的，无论是用常规的方法或体内。前药包括通式I的化合物中羟基连上任何的取代基，当给予哺乳动物患者时，分离后形成自由的羟基。前药的实施例包括，但不限定于，通式I化合物中羟基的乙酰化，甲酰化，等。
如通式I所示的化合物的各种多晶型物构成本发明的部分并且可以通过在不同的条件下的化合物结晶制备。例如，使用不同的通常使用的溶剂或它们的混合物来结晶；在不同的温度下结晶；各种不同的模式来冷却；在结晶过程中，从非常快到非常慢的范围。多晶形物可以通过加热或熔融化合物接着渐进的或快速的冷却获得。多晶形物的存在可以NMR，IR，热差扫描，X-光粉末衍射或其它的技术来确证。
本发明的化合物可以修饰通过连上相似的功能基来增加选择的生物性能。这种修饰在本领域是公知的，包括但不限定于，那些增加穿透进入特定的生物隔室(例如肝)，增加口服或静脉内的生物利用度，增加溶解性允许通过注射给药，改变代谢，改变排泄的速率，等等。
为了完成本发明目的，本发明采取如下的技术方案葫芦科植物波棱Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.的提取物和波棱素的制备原药材葫芦科植物波棱Herpetospermumpedunculosum(Sex.)Baill.的根、茎、叶、种子，优选是其种子波棱瓜子，经干燥并适当的粉碎，以利增大与溶剂的接触面积，提高效率。
原药材的提取溶剂可使用水、醇类、或水与醇类的混合物。优选的醇类，尤其是低分子量的醇，包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等，更优选的是乙醇。提取时溶剂量为原药重量的2-20倍。提取前可以浸泡。提取可以在静态或动态下，优选在动态条件下。为了提高提取的效率，可以使用超声波等。提取的温度是从室温(例如20℃)到溶剂回流温度的范围内，优选在回流的温度下。提取可连续或间歇进行，间歇提取时可重复1-4次。
上步结束后，合并滤液，滤去药渣。滤液在动态状态下，在常压或减压加热浓缩至没有溶剂的浸膏。
浸膏石油醚脱油后，乙酸乙酯萃取。回收乙酸乙酯，得干粉。
干粉进行纯化，进行柱层析，可以通过大孔树脂、离子树脂、吸附柱层析，优选吸附柱层析，更优选的是硅胶柱层析，是层析得到的有效部位。洗脱系统可以用薄层层析来筛分，选择使被分离组分的Rf值在0.2-0.3的溶剂系统。优选用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脱，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脱物，得波棱素粗品。
波棱素粗品再经HPLC制备，即可如通式I所示的化合物，纯度为98％以上。
本发明还提供了本发明提取物、化合物的药物组合物，它包括药物有效剂量的，作为活性成分的提取物、化合物及药学上可接受的载体。
通常本发明药物组合物含有0.1-95％重量的本发明提取物、化合物。
本发明提取物、化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明提取物、化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明提取物、化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等，优选口服给药。
本发明提取物、化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明提取物、化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明提取物、化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明提取物、化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
例如，将本发明提取物、化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明提取物、化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明提取物、化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明提取物、化合物的每天的合适剂量范围本发明的提取物的用量为0.001-100mg/Kg体重，优选为0.01-60mg/Kg体重，更优选为0.05-10mg/Kg体重，最优选为0.1-1mg/Kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的提取物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
本发明的波棱素有良好的抗病毒作用，尤其是抗肝炎病毒作用。实验表明雏鸭感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)后给予波棱素，波棱素0.08g/kg一天2次10天对感染鸭乙型肝炎病毒感染的鸭血清中DHBVDNA水平的抑制效果有显著性作用，无毒性反应；0.16g/kg组抑制作用也较强。和阳性药拉米夫啶比较，0.08g/kg组在10天时抑制作用较强，并且反跳慢。以上实验结果表明波棱素对乙肝病毒具有较强的抑制作用。
药理实验表明波棱素加入2.2.15细胞培养液中能明显抑制HBsAg和HBeAg的复制和表达，说明本发明的化合物对乙型肝炎病毒有抑制作用。
本发明波棱素有较强的保肝降酶作用。对一次性ip四氯化碳(CCl4)所致小鼠急性肝损伤实验中，各给药组大鼠血清GPT、GOT值均低于模型对照组，波棱素高、中剂量组与模型组比较有显著性差异，说明波棱素对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有较好的治疗作用。对一次性ip四氯化碳(CCl4)所致小鼠血清谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)的升高亦有较强的抑制作用。说明本发明波棱素有较强的保肝降酶作用，尤其是对化学性物质，特别是CCl4引起的肝损伤，波棱素具有很好的保护作用。
本发明波棱素有较强的抗肿瘤作用。分别以人肝癌细胞株BEL-7402、BEL-7404、及人结肠癌细胞株HCT为研究对象，以含不同稀释浓度波棱素的培养基与细胞共同培养，采用MTT法检测药物作用对癌细胞的抑制作用。结果表明波棱素对BEL-7402、BEL-7404的50％抑制率分别为1.44、1.64，对HCT的50％抑制率为2.31。说明本发明化合物对不同癌细胞体外生长具有明显的抑制作用。


葫芦科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物(以波棱瓜子为原药材)和波棱素的制备工艺图。

下面的实施例及药物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
实施例1葫芦科植物Herpetospermum pedunculosum(Sex.)Baill.波棱提取物和波棱素的制备取药材波棱的种子波棱瓜子5kg，粉碎，以95％乙醇(5倍量)浸泡，乙醇回流提取3次，每次1h，合并提取液，浓缩至无醇味，静置除去油层，石油醚(一倍量)脱去残留的油后，乙酸乙酯(一倍量、一倍量、一倍量)萃取三次。回收乙酸乙酯，得干粉。该部分经反复硅胶柱层析，依次用二氯甲烷∶丙酮50∶1、30∶1、10∶1、5∶1、1∶1梯度洗脱，收集10∶1、5∶1、1∶1洗脱物，得波棱素粗品。
波棱素粗品经HPLC制备得波棱素(HPLC条件)纯度为98％以上。具体流程见附图。

C13-NMR、C13-H1cosy

药理实验实验例1波棱素的体内抗肝炎病毒作用
1.1 试剂 拉米夫啶，英国葛兰素威康有限公司B022306。
a-32P-dCTP(北京福瑞生物技术工程公司，批号981206)；缺口翻译药盒(Promega公司，批号990426)；鸭乙型肝炎病毒为鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性上海麻鸭血清(中国医学科学院医药生物技术所病毒室提供，-70℃保存)1.2 动物 1日龄北京维鸭购自北京南苑养鸭场1.3 方法 1日龄北京鸭，经腿胫静脉注射上海麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.3ml，感染后7天取血，分离血清，检测血清中DHBVDNA含量。雏鸭血清经检测DHBV呈阳性后，将鸭随机分为5组，病毒对照组、拉米夫啶组(50mg/kg)、波棱素(160、80、40mg/kg)三个剂量组，每组6只。灌胃给药，1.5ml/只，每天2次。对照组给予同体积生理盐水，连续给药10天。分别于药物治疗后5天(T5)、10天(T10)和停药后3天(P3)自鸭胫静脉取血，分离血清，按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBVDNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，酶标仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA光密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。
表1波棱素治疗组与病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制比较药物剂量 动物数抑制率(％)g/kg(只) T5T10P3病毒对照6 -0.81 15.65 -8.56组波棱素 0.04 6 18.24*34.88* 23.060.08 6 24.99*62.48**45.85**
0.16 621.66*58.45** 37.68**拉米夫啶 0.05 645.27** 56.92** 27.35*统计处理给药治疗组HBV-DNA抑制率与病毒对照组同时间的DHBV-DNA抑制率比较(成组t检验)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
实验结果表明，波棱素0.08g/kg一天2次10天对感染鸭乙型肝炎病毒感染的鸭血清中DHBVDNA水平的抑制效果有显著性作用，无毒性反应；0.16g/kg组抑制作用也较强，与0.08g/kg组无显著性差异。与阳性药拉米夫啶口服对DHBVDNA的抑制作用比较，0.08g/kg组在10天时抑制作用较强，且反跳慢，但统计学上无显著差异。以上实验结果表明波棱素对鸭乙型肝炎病毒感染鸭具有很好的治疗作用，并优于阳性药拉米夫啶。
实验例2波棱素的抗肝炎病毒作用2.1 试剂DMEM(美国Gibco公司产品)；胎牛血清(美国Gibco公司产品)；G-418(美国Sigma公司产品)；HBeAg，HBsAg固定相放射免疫测定盒(中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品)；2.2.2.2.15细胞 为转染了HBV(Aayw亚基)全基因组，能分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA颗粒的人肝母瘤细胞系，美国Mount sinai医学中心构建，中国医学科学院医药生物技术所病毒室传代培养)2.3 方法 以每毫升10万个2.2.15细胞接种24孔培养板，每孔1ml，37℃ 5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，5个稀释度分别为4、2、1、0.5、0.25mg/ml，每浓度3孔，37℃ 5％CO2培养，收集第8天含药培养液，-20℃冰冻保存。参照固相放射免疫测定盒说明书测定，用γ计数仪测定每孔cpm值。实验设HBsAg、HBeAg阳性和阴性对照。
表2波棱素在2.2.15细胞中对HBsAg的影响药物浓度 cpm(x±s)抑制率mg/ml ％0.006 2158±17663.02**0.003 1774±63 69.60**0.0015 3206±21644.15*细胞 7069±245对照与细胞对照比较，**p＜0.01 *p＜0.05表3波棱素在2.2.15细胞中对HBeAg的影响药物浓度 cpm(x±s) 抑制率mg/ml％0.006 1073±21361.040.003 1224±12055.530.0015 1507±18545.26细胞 2753±123对照与细胞对照比较，**p＜0.01 *p＜0.05
实验表明波棱素加入2.2.15细胞培养8天，明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌，能抑制2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的复制和表达。本发明化合物对2.2.15细胞培养内对乙型肝炎病毒有抑制作用，说明其对乙肝病毒具有较强的抑制作用。
实验例3 波棱素的保肝降酶作用3.1阳性对照药99J15043L01联苯双酯，北京协和药厂，批号010309；3.2试剂谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)测定试剂盒，为北京北化康泰临床试剂有限公司产品Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美国GIBCO公司产品；3.3动物昆明种小鼠，体重18-22g，均雌雄各半，由军事医学科学院动物中心提供，动物合格证号分别为军医动字第BDW98012和军医动字第BDW95001号。动物实验条件贰级标准，合格证号军医动字第B98006。
3.4仪器BS-224型生化分析测定仪，北京生化仪器厂。
3.5方法取健康小鼠60只随机分为六组，即正常对照组、CCl4(0.02ml/kg)模型组、联苯双酯组0.029g/kg、波棱素(0.0166、0.0083、0.0042g/kg)三个剂量组，每组10只。每日ig给药2次，对照组及模型组给与相同容积的蒸馏水，连续给药7次药后，除正常对照组外，小鼠ip 0.1％CCl4(橄榄油为溶剂)0.02ml/g，造模后40小时，小鼠眶静脉采血，测血清GPT、GOT值，见表4。
表4.波棱素对CCl4致小鼠急性肝损伤的影响组别 剂量 动物数 GPTGOT(g/kg) (只)(U·L-1) (U·L-1)对照组 10 10.90±0.8549.59±5.731模型组 10 152.31±20.34##162.92±9.08##联苯双酯0.02910 30.71±2.28**70.14±8.06*波棱素 0.0166 10 34.20±10.12**72.43±9.11*0.0083 10 36.22±10.03**69.12±8.97*0.0042 10 62.75±8.21*86.28±10.23*与正常对照组比较，#p＜0.05 ##p＜0.01与模型组比较，*p＜0.05 **p＜0.01结果表明，各给药组大鼠血清GPT、GOT值均低于模型对照组，波棱素高、中剂量组与模型组比较有显著性差异，说明波棱素对CCl4所致小鼠急性肝损伤具有较好的治疗作用。
实验例4抗肿瘤作用4.1 方法分别以人肝癌细胞株BEL-7402、BEL-7404、及人结肠癌细胞株HCT为研究对象，以含不同稀释浓度波棱素的培养基与细胞共同培养，采用MTT法检测药物作用对癌细胞的抑制作用。据文献方法略加修改[1]，靶细胞以完全培养液调为1×105/mL，分别接种于96孔培养板中，每孔100μL，然后分别加入100μL不同含药血清及空白血清，总体积200μL，每组设7个平行孔，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入5mL MTT 10μL，继续培养4h后进行显色反应，加20％二甲基亚砜100μL终止反应，震荡10min，在DG3022-A型酶联免疫检测仪，波长570nm测吸光度(A)值。细胞毒活性计算公式为 结果见表5。
表5.波棱素对肿瘤细胞生长的抑制率(％)细胞株 浓度 (μg/ml)1.25 2.50 5.00 10.0020.00IC50BEL-7402 34.90 41.90100.00 98.80100.00 1.44BEL-7404 12.30 60.00100.00 98.50100.00 1.64HCT 32.00 18.0072.00 100.00 100.00 2.31结果表明波棱素对BEL-7402、BEL-7404的50％抑制率分别为1.44、1.64，对HCT的50％抑制率为2.31。说明本发明的化合物对不同癌细胞体外生长具有明显的抑制作用。


本发明公开了葫芦科植物波棱Herpetospermum pedunculo-sum(Sex.)Baill.提取物和波棱素，波棱提取物和波棱素的制备方法，波棱提取物和波棱素及其衍生物的药物组合物，波棱提取物和波棱素及其衍生物及其药物组合物作为药物的用途，尤其是制备抗病毒，抗肝损伤，抗肿瘤的药物中的用途。经细胞实验和动物实验证实，波棱素具有活性高、毒性小的优点。