秀丽新杆线虫中真核生物蛋白质和核酸分子的生产制作方法

乌韦·H·索尔, 西蒙·塔克

2005年5月18日

2002年11月26日

2001年11月27日

内克西特股份有限公司

C12P21/02GK1617930SQ02827596

新杆 中真核 线虫 秀丽 蛋白质 生物

1.用于在秀丽新杆线虫中表达的质粒载体，该载体以5’到3’的转录方向包含可操作地相互连接的热激启动子核苷酸序列；任选地含有Shine-Dalgarno序列的合成内含子核苷酸序列；任选的编码核定位信号或分泌信号的核苷酸序列；编码可识别的标记的核苷酸序列；任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列；编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列；含有编码真核生物如人类的蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的多克隆位点以及编码翻译终止的核苷酸序列2.权利要求1的质粒载体，其中对核苷酸序列顺序进行更改，以使得多克隆位点之后为编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列、任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列、任选的编码核定位信号或分泌信号的核苷酸序列和编码可识别的标记的核苷酸序列3.权利要求1或2的质粒载体，其中合成的内含子核苷酸序列含有Shine-Dalgarno序列AGGAG，编码核定位信号的核苷酸序列是SEQID NO3，编码可识别的标记的序列是编码6-His、10-His或12-His标记的序列，编码荧光蛋白质的核苷酸序列是编码绿色荧光蛋白质的具有序列SEQ ID NO8的核苷酸序列，编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列是编码TEV蛋白酶切割位点的序列4.权利要求1或3的质粒载体，其中缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO15.权利要求1或3的质粒载体，其中缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO26.权利要求2或3的质粒载体，其中缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO97.权利要求2或3的质粒载体，其中缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO108.权利要求1-7中任何一项的质粒载体，其中编码真核生物蛋白质的核苷酸序列是编码人类生长因子蛋白质的序列9.权利要求8的质粒载体，其中编码人类生长因子蛋白质的序列选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO710.在线虫中生产真核生物如人类的蛋白质或核酸分子的方法，该方法包含如下步骤，即，将一种或几种权利要求1-9中任何一项的质粒载体注射入秀丽新杆线虫雌雄同体的生殖腺中，于低于25℃的温度在生长培养基中培养线虫，随后将培养温度改变为30和33℃之间的值，以在几百个体细胞中诱导蛋白质或核酸分子的表达，在神经元和表皮细胞中具有最高表达水平，并从该细胞中分离真核生物蛋白质或核酸分子11.权利要求10的方法，其中生长培养基包含任选地进行标记的细菌作为线虫的饲料12.权利要求11的方法，其中用可鉴定标记对细菌进行标记，对于蛋白质的表达，该标记选自2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys和非天然氨基酸，对于核酸分子的表达，该标记选自2H、13C、15N的可鉴定标记13.权利要求10的方法，其中在质粒包括编码核定位信号的核苷酸序列的情形中，可通过谨慎地打开线虫以打开含有表达的蛋白质的细胞而进行分离，从而使细胞核保持完整，随后分离细胞核，并溶解核膜以释放表达的蛋白质或核酸分子，及将混合物进行层析纯化，该纯化对于蛋白质包括特异性地与可识别的标记结合的固定相，随后进行洗涤，并在通过提供特异性蛋白酶而从可识别的标记蛋白释放真核生物蛋白质的条件下进行洗脱，该特异性蛋白酶相应于由所用质粒编码的蛋白酶切割位点且具有未切割的可识别标记，同时，对从固定相释放标记的低浓度试剂进行透析，将切割混合物转移到新标记特异性的柱子上，该切割混合物含有具切除标记的真核生物蛋白质和具有未切割的可识别标记的蛋白酶，洗脱柱子以获得含有真核生物蛋白质的洗脱液，而留下切除的可识别标记和含有可识别标记的蛋白酶结合于固定相上14.权利要求10的方法，其中在质粒缺乏编码核定位信号的核苷酸序列的情形中，通过捣碎线虫而进行分离，以释放表达的蛋白质或核酸分子，并将混合物进行层析纯化，该层析纯化对于蛋白质包括特异性地与可识别的标记结合的固定相，随后进行洗涤及在从固定相中释放真核生物蛋白质的条件下进行洗脱15.权利要求10-14中任何一项的方法，该方法包含额外注射质粒载体以共表达通用的蛋白酶抑制剂，该质粒载体包含可操作地相互连接的热激启动子核苷酸序列；任选地含有Shine-Dalgarno序列的合成内含子核苷酸序列；任选的编码核定位信号的核苷酸序列；编码可识别的标记的核苷酸序列；任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列；编码通用蛋白酶抑制剂的核苷酸序列，以及编码翻译终止的核苷酸序列16.权利要求15的方法，其中编码通用蛋白酶抑制剂的核苷酸序列是编码α2-巨球蛋白的SEQ ID NO11

本发明一般涉及秀丽新杆线虫(Caenorhabditis elegans)中翻译后修饰的真核生物蛋白质和具体涉及人类蛋白质的生产本发明也包括翻译后修饰的核酸分子如tRNA的生产本发明进一步包括用可鉴定的标记如2H、13C、15N、硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸或非天然氨基酸对表达的蛋白质进行共翻译标记类似地，用2H、13C和15N对核酸分子进行标记背景有几种在不同表达系统中生产真核生物蛋白质的选择目前应用下面的表达系统细菌许多大肠杆菌表达系统是商业上可购得的一些例子为pET(Promega)、pQE(Qiagen)、pGEX(Amersham Pharmacia)、ptrcHIS(Invitrogen)、pDUAL(Stratagene)大肠杆菌的优点是价格低廉且易于应用主要的缺点是许多真核生物蛋白质当在大肠杆菌中表达时不能正确折叠并形成不溶性聚集体密码子选择与高等真核生物的非常不同真核生物蛋白质常常必须在翻译后进行修饰，以能够折叠为正确的结构和/或变为活化的大肠杆菌不能进行专由真核生物细胞进行的复杂翻译后修饰，如乙酰化、N-和O-连接的糖基化和酰化和磷酸化表达水平因蛋白质不同而有巨大变化1升大肠杆菌培养物中重组蛋白质的产量一般为约10mg在极少数情形中，可获得每升大肠杆菌培养物中数百毫克重组蛋白质的量酵母巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)是公认的表达重组蛋白质的系统几个公司销售相关的质粒载体例如，Invitrogen Corp.销售pPIC质粒系列毕赤氏酵母属的优点是作为真核生物，其翻译后修饰与那些发生于人类或高等真核生物中的更相似毕赤氏酵母属可容易且快速地进行转化它也易于大规模培养表达水平有相当大的变化已报道了高达12克/升的水平昆虫细胞昆虫细胞也可用于表达重组蛋白质几个公司销售相关的质粒载体和细胞系Invitrogen的系统为DES、InsectSelect和MaxBac昆虫细胞的优点在于，作为多细胞真核生物，昆虫比酵母更类似于人类缺点为(i)昆虫细胞比细菌或酵母细胞更难以培养和维持(ii)它们的培养更加昂贵(iii)它们需要无菌的培养箱(iv)表达水平比酵母或细菌系统的更低人类细胞系也可应用人类细胞系，但它们需要生长因子以使其存活现今，人类生长因子是非常昂贵的，这使得人类细胞系成为如生产生长因子的不利候选物线虫线虫，即小的线虫，是一枝迄今尚未开发用于大规模蛋白质或核酸生产的真核生物线虫是非常简单的动物，且自1949年以来已用作发育的模型系统(Dougherty EC和Nigon V.，J.Parasitol.(1949)35，11；Brenner S在1963年6月5日给Max Perutz的信中)尤其是秀丽新杆线虫中959个细胞中的每一个的发育均得到充分鉴定，且最近对其整个基因组进行了测序并目前可供公众使用(“The C.elegans Sequencing Consortium ”秀丽新杆线虫的基因组序列研究生物学的一个平台(Genome Sequence of the nematode C.elegansA platform for investigating biology).Science(1998)282，2012-2018)线虫是在遗传上比细菌更与人类密切相关的真核生物，其蛋白质的约60％与人类蛋白质同源使得用作生产真核生物特别是人类蛋白质的蛋白质表达系统的线虫引起关注的是如下事实，即它们具有进行翻译后蛋白质修饰所必需的机制因此，在线虫中生产的蛋白质(肽药物)事实上与天然的人类蛋白质相同，且从而具有更低的不利副作用和更高的比活性，而需要更低的剂量线虫表达系统的其他优点包括高的表达蛋白质产量、低的维持成本、易于应用及人们易于扩大生产C.D.Link已描述了人类β-淀粉样肽在转基因秀丽新杆线虫中的表达，以生产与抗-β-淀粉样多克隆和多克隆抗体免疫反应的肌肉特异性沉积物(Link C.D.，人类β-淀粉样肽在转基因秀丽新杆线虫中的表达(Expression of human beta-amyloid peptide in transgenicCaenorhabditis elegans)，Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)92，9368-9372)，且他建议其无脊椎动物模型可用于体内研究调节淀粉样蛋白形成的因子国际专利申请WO 00/54815公开了通过应用包含启动子的表达载体而在秀丽新杆线虫中表达DNA或蛋白质，该启动子指导基因在秀丽新杆线虫排泄细胞中的表达蛋白质表达的原因不是为了生产和分离蛋白质，而是为了发现参与细胞运动性、细胞形状和细胞向外生长过程的新分子，即药物，并确定其功能发明描述本发明提供了一种生产真核生物如人类蛋白质和核酸分子的体内表达系统，该表达系统易于操作、价格低廉、遗传上稳定且易于扩大本发明的线虫表达系统适合于大规模生产超纯的重组人类蛋白质生产的蛋白质和核酸分子将含有高等生物(真核生物)所有典型的修饰，如乙酰化、N-和O-连接的糖基化和酰化、磷酸化及信号序列的切割等这些修饰对于信号通路中医药上有用的蛋白质的特异性是重要的新的线虫蛋白质表达系统组合了真核生物细胞的优点如翻译后修饰和已知大肠杆菌发酵操作的简便性表达系统包含秀丽新杆线虫由于可同时注射入秀丽新杆线虫中的不同质粒的数目超过20，这使得能够同时表达具有大复合物的例如不同亚基的多个质粒，该大复合物含有蛋白质和/或核酸应用本发明可在工业规模上生产的真核生物蛋白质的例子包括用于干细胞基础研究和医学应用的人类生长因子、生长因子受体(膜结合的或可溶性部分)，该医学应用如心脏病、糖尿病、癌症和神经系统疾病的基于干细胞的治疗，该神经系统疾病包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病此外有单克隆抗体、G-蛋白、G-蛋白偶联的受体和大的多亚基蛋白质-RNA复合物，如聚合酶、端粒酶和剪接因子复合物除潜在的医学应用之外，生产的蛋白质和核酸可用于通过X-射线晶体学、电子晶体学或NMR对结构进行鉴定，其中人们可以研究翻译后修饰的蛋白质和核酸秀丽新杆线虫表达系统也可用于为了晶体学的应用而用2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys或非天然氨基酸对真核生物蛋白质进行标记，或者为了NMR实验用2H、13C或15N进行标记本发明的一个方面涉及用于在秀丽新杆线虫中表达的质粒载体，该载体以5’到3’的转录方向包含可操作地相互连接的热激启动子核苷酸序列；任选地含有用于在秀丽新杆线虫和大肠杆菌之间有效穿梭的Shine-Dalgarno序列的合成内含子核苷酸序列；任选的编码核定位信号或分泌信号，如选自天然存在的信号序列的，如来自秀丽新杆线虫的，或要进行表达的蛋白质或核酸分子的信号序列的核苷酸序列；编码可识别的标记的核苷酸序列；任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列；编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列；含有编码真核生物如人类的蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的多克隆位点以及编码翻译终止的核苷酸序列可对质粒中的核苷酸序列顺序进行更改，以使得多克隆位点之后为编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列、任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列、任选的编码核定位信号或分泌信号的核苷酸序列和编码可识别的标记的核苷酸序列编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列的例子包括蛋白酶TEV、凝血酶和凝血因子Xa在质粒载体的一个实施方案中，合成的内含子核苷酸序列含有Shine-Dalgarno序列AGGAG，编码核定位信号的核苷酸序列是SEQ IDNO3，编码可识别的标记的序列是编码6-His标记、10-His标记或12-His标记的序列，即使得在Ni螯合的柱上易于纯化的6、10或12个组氨酸残基，编码荧光蛋白质的核苷酸序列是编码绿色荧光蛋白质的具有SEQ ID NO8序列的核苷酸序列，编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列是编码使得以后能够切除6、10或12个组氨酸残基的蛋白酶切割位点的序列在一个优选实施方案中，缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO1该质粒不具有编码核定位信号的核苷酸序列人工的内含子起始于480而终止于521(gtatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca g)，随后为547～564的6-His-标记序列(cat cac cat cac cat cac)和565～594的连接体序列，该连接体序列连接His-标记与595～618的编码TEV蛋白酶识别位点的序列然后为单多克隆位点(MCS)(起始于619)在另一个优选实施方案中，缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO2人工的内含子起始于480而终止于521(gtatgtttcga atgatactaa cataacatagaacattttca g)，随后为起始于位置533而终止于580的编码核定位信号(NLS)的核苷酸序列(ctagtgctca gaaaaaatga ctgctccaaagaagaagcgt aaggtgcc)在NLS后为588～605的6-His标记序列(catcaccatc accatcac)一个连接体序列(606～635)连接该标记序列与636～656的编码TEV蛋白酶识别位点的序列，其后为多克隆位点(起始于658)为了克隆的目的，用于质粒中的NLS比基本的NLS DNA序列稍长(将NLS克隆入用限制酶Nhe I和Nco I预先切割的质粒中)基本的NLS序列(558～568ccaaagaagaagcgtaaggtgcc c，[最后的c来自Nco I切割的载体])翻译为蛋白质序列PKKKRKV，该序列可由核输入机制识别核定位信号NLS由于下述原因而是有用的当对线虫进行热激并以这样的方式强制该线虫超量生产需要的人类蛋白质时，指导生产的蛋白质进入细胞核中是更安全的这正是NLS所执行的将蛋白质转运入核中的优点是其中不存在蛋白酶这些蛋白酶可以存在于细胞质中，且尤其浓缩于称作溶酶体的细胞器中通过应用NLS将表达的蛋白质送入核内，它们被转运到与潜在危险的蛋白酶有一定距离绿色荧光蛋白质GFP的DNA序列在SEQ ID NO8中含有额外的3个内含子它主要用作发光标记，以使得秀丽新杆线虫表达预期的蛋白质“可见”在存在该DNA序列的质粒中，该序列在6His-标记之后如当整合入质粒SEQ ID NO1中时的6His-GFP-TEV-MCS，或如当整合入质粒SEQ ID NO2中时的NLS-6His-GFP-TEV-MCS在另一个优选实施方案中，缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO9相对于质粒SEQ IDNO1中的序列对质粒中序列的顺序进行了更改，并包括了具有序列SEQID NO8的绿色荧光蛋白质序列顺序为MCS-TEV-GFP-6His在另一个优选实施方案中，缺乏编码真核生物蛋白质或核酸分子的核苷酸序列的质粒具有核苷酸序列SEQ ID NO10相对于质粒SEQ IDNO2中的序列对质粒中序列的顺序进行了更改，并包括了具有序列SEQID NO8的绿色荧光蛋白质序列顺序为MCS-TEV-GFP-NLS-6His在多克隆位点(MCS)后插入绿色荧光蛋白质(GFP)使得可能快速检查正确的蛋白质折叠如果表达的目标蛋白质如人类生长因子未正确折叠，这将使得其后的绿色荧光蛋白质也不能正确折叠，从而人们不能看到绿色荧光这是蛋白质折叠的快速检验此外，通过根据公认的GFP规程应用离子交换层析或者作为应用固定的抗-GFP抗体的亲和标记，可将GFP用作纯化标记本发明优选的质粒也计划用于大肠杆菌中因此将它们命名为“穿梭载体”对上文中公开的质粒序列的唯一修饰是使所谓的“Shine-Dalgarno”序列处于转录起始密码子ATG前约10个核苷酸的中央Shine-Dalgarno序列AGGAG是大肠杆菌的翻译起始信号，而对秀丽新杆线虫无影响因而，在质粒SEQ ID NO1中，Shine-Dalgarno序列处于ATG-6His前10个核苷酸序列的中央；在质粒SEQ ID NO2中，Shine-Dalgarno序列处于ATG-NLS前10个核苷酸序列的中央；而在质粒SEQ ID NO9和10中，Shine-Dalgarno序列处于MCS(该MCS含有ATG)前10个核苷酸序列的中央质粒SEQ ID NO1、2、9和10含有使大肠杆菌细菌对抗生素如氨苄青霉素或carbicillin或卡那霉素有抗性的蛋白质然而，这些蛋白质对秀丽新杆线虫无影响(如它们不向秀丽新杆线虫提供任何抗生素抗性)在本发明最优选的实施方案中，编码人类蛋白质的核苷酸序列是编码人类生长因子蛋白质的序列一些人类生长因子蛋白质的特定例子是称作Wnt2b的生长因子序列SEQ ID NO4(智人(Homo sapiens)无翅型MMTV整合位点家族2B成员)，称作FGF10的生长因子序列SEQ ID NO5(智人角质形成细胞生长因子2(FGF10))，称作KLS的生长因子序列SEQ ID NO6(智人KIT配体可溶性组分)，和称作BMP10的生长因子序列SEQ ID NO7(智人骨形态发生蛋白10)本发明的另一个方面涉及在线虫中生产真核生物如人类的蛋白质或核酸分子的方法，该方法包含如下步骤，即，优选地同时将根据本发明的一种或几种质粒载体注射入秀丽新杆线虫雌雄同体的生殖腺中，于低于25℃的温度在生长培养基中培养线虫，随后将培养温度改变为30和33℃之间的值，以在几百个体细胞中诱导蛋白质或核酸分子的表达，在神经元和表皮细胞中具有最高表达水平，并从该细胞中分离真核生物蛋白质或核酸分子在本发明方法的一个实施方案中，生长培养基包含细菌如大肠杆菌作为线虫的饲料由于秀丽新杆线虫可以专一地以分散在基本培养基中的细菌为食物，所以可利用该事实来标记在秀丽新杆线虫中生产的蛋白质通过向虫子饲喂根据现有规程预先标记的细菌(如用2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys或某些非天然氨基酸对蛋白质的表达进行标记，及用2H、13C、15N对核酸分子的表达进行标记)，各种标记将掺入新生产的蛋白质和核苷酸中在一个优选实施方案中，在质粒包括编码核定位信号的核苷酸序列的情形中，可通过谨慎地打开线虫的细胞而进行分离，如通过应用“珠搅拌器(bead beater)”(＝充满小的锆珠的搅拌器)——从而使含有表达的蛋白质或核酸分子的细胞核保持完整这之后为分离细胞核，并通过溶解核膜以释放表达的蛋白质，及将混合物进行层析纯化对于蛋白质，这包括特异性地与可识别的标记结合的固定相，如10-His-标记的蛋白质与填充入纯化柱中的Ni-螯合的珠结合，随后洗掉未结合的蛋白质，并在从柱中释放真核生物如人类蛋白质的条件下进行洗脱，该条件如释放10-His-标记的蛋白质的咪唑梯度然后通过提供特异性的蛋白酶而切除可识别的标记，该特异性的蛋白酶相应于由所用质粒编码的蛋白酶切割位点并具有未切割的可识别标记如6-His-标记，同时，对从固定相释放标记的低浓度试剂进行透析(如果用400-700mM咪唑进行洗脱则适合应用约10-50mM)，将切割混合物转移到新标记特异性的柱子上，该切割混合物含有具切除标记的真核生物蛋白质和自身具有未切割的可识别标记如6-His-标记的蛋白酶，洗脱柱子以获得含有真核生物蛋白质的洗脱液，而留下切除的可识别标记如10-His标记和可识别标记的如6-His-标记的蛋白酶结合于固定相上在另一个优选实施方案中，在质粒缺乏编码核定位信号的核苷酸序列的情形中，可通过捣碎线虫而进行分离，以释放表达的真核生物蛋白质，并将混合物进行层析纯化，该层析纯化具有特异性地与可识别的标记结合的固定相，随后进行洗涤及在从固定相中释放真核生物蛋白质的条件下进行洗脱，如在前述段落中示例的在所用质粒缺乏核定位信号的情形中，或者在需要防止真核生物蛋白质受到存在于细胞中的非特异性蛋白酶攻击的额外预防情形中，如对于蛋白质是降解敏感性的情形，保护表达的蛋白质抗蛋白酶降解的可选择的或补充途径是注射独立的质粒，如缺乏编码蛋白酶切割位点的核苷酸序列和含有编码通用蛋白酶抑制剂如α2-巨球蛋白(α2-M)的核苷酸序列SEQ ID NO11的SEQ ID NO1或2因而，在本发明方法额外优选的实施方案中，该方法包含额外注射质粒载体以共表达通用的蛋白酶抑制剂，该质粒载体包含可操作地相互连接的热激启动子核苷酸序列；任选地含有Shine-Dalgarno序列的合成内含子核苷酸序列；任选的编码核定位信号的核苷酸序列；编码可识别的标记的核苷酸序列；任选的编码荧光蛋白质的核苷酸序列；编码通用蛋白酶抑制剂的核苷酸序列，如编码α2-巨球蛋白的通用蛋白酶抑制剂SEQ ID NO11；以及编码翻译终止的核苷酸序列在该情形中，可识别的标记仍然位于表达的通用蛋白酶抑制剂上，且它将与标记特异性的柱子结合(在第二个和最后一个特异性柱步骤中连同(如6-His-)标记的蛋白酶和从真核生物蛋白酶中切除的(如10-His-)标记一起)秀丽新杆线虫表达系统，包括质粒及在本发明的线虫中生产真核生物如人类蛋白质或核酸分子的方法特别适合于大规模生产超纯的重组真核生物蛋白质，特别是人类生长因子生产的蛋白质将含有高等生物(真核生物)典型的修饰，如乙酰化、N-和O-连接的糖基化和酰化、磷酸化及信号序列的切割等这些修饰对于信号通路中医药上有用的蛋白质的特异性是重要的可应用本发明在工业规模上生产的人类(真核生物)蛋白质的例子包括用于干细胞基础研究和医学应用的人类生长因子、生长因子受体(膜结合的或可溶性部分)此外有单克隆抗体、G-蛋白、G-蛋白偶联受体特别地，该系统设计为能够在秀丽新杆线虫和大肠杆菌之间进行穿梭，以研究翻译后修饰的作用它也使得能够通过用预先标记的细菌饲喂线虫而用可鉴定的标记(如2H、13C、15N、Se-Met、Se-Cys等)对秀丽新杆线虫生产的蛋白质和核酸分子进行标记以进行NMR和X-射线晶体学研究此外，秀丽新杆线虫中真核生物蛋白质如人类蛋白质或核酸分子的表达也可依赖于选择的信号肽而导向于细胞核保护性的蛋白酶降低的环境中或细胞的某些区室中该系统也使得如果需要大的多亚基蛋白质-RNA复合物如聚合酶、端粒酶和剪接因子复合物的重建，则能够同时从超过20个质粒中表达蛋白质本发明现在将进一步通过实验描述进行阐明，且应理解为权利要求的范围不受任何特定叙述的细节的限制实验对秀丽新杆线虫进行的所有操作均应用Methods in Cell Biology第84卷中“秀丽新杆线虫生物的现代生物学分析(Caenorhabditiselegansmodern biological analysis of an organism)”(Epstein和Shakes编，Academic Press，1995)中的技术，或应用在此处描述的方法的小的修改通过将质粒DNA连同编码unc-36(+)和hmp-1(+)的质粒一起注射入基因型为unc-36(e251)；hmp-1(zu278)/daf-11(m8ts)sma-1(e30)的虫子中而构建了转基因秀丽新杆线虫品系(Costa等人，Journal of Cell Biology 141297-308 1998)hmp-1(zu278)导致了胚胎致死表型(Costa等人，1998)确立了基因型为unc-36(e251)；hmp-1(zu278)；svEx[unc-36(+)hmp-1(+)hs-gen-1(+)]的品系，其中“gen-1”指编码人类生长因子的基因应用公认的程序将虫子在33℃热激2小时(Stringham EG和Candido，EPM，Environmental Toxicology and Chemistry131211-1220 1994)表达载体构建为了在秀丽新杆线虫中表达蛋白质，我们已基于质粒pPD49、78-umu、SEQ ID NO1、2、9和10构建了4个质粒载体，这使得基因能够在许多不同细胞中进行热诱导型表达载体含有用于异位表达外源蛋白质的秀丽新杆线虫热激启动子该启动子在低于25℃时是无活性的然而，将培养温度改变为30和33℃之间的值导致在几百个体细胞中诱导蛋白质高水平的表达，在神经元和表皮细胞中具有最高表达水平设计载体以制备翻译融合物ATG的下游是质粒SEQ ID NO1和2中编码6-His-标记的序列，其后为TEV蛋白酶切割位点和多克隆位点微注射和选择为了确定单个蛋白质的表达水平，我们制备了几个质粒，其中每一个均含有不同的检验基因及单独的质粒的适当遗传选择标记我们将质粒连同编码unc-36(+)和hmp-1(+)的质粒一起注射入基因型为unc-36(e251)；hmp-1(zu278)/daf-11(m8ts)sma-1(e30)的雌雄同体中hmp-1(zu278)导致了胚胎致死表型(Costa等人，1998)确立了基因型为unc-36(e251)；hmp-1(zu278)；svEx[unc-36(+)hmp-1(+)hs-gen-1(+)]的品系，其中“gen-1”指要检验的基因超过600bp的不同质粒之间的重组发生于体内，并获得了转化的第一代F1子代，其中不同注射的质粒一起形成附加体(称作染色体外阵列)10个F1转化体中约有1个产生稳定的品系，其中染色体外阵列不变地从一代传递到下一代染色体外阵列是相对稳定有丝分裂的，从而在任何转化的动物中，大多数细胞含有该阵列通过应用适当的编码基本基因的共注射标记，可能获得如下品系，其中群体中的所有成体和幼虫均含有该阵列蛋白质表达秀丽新杆线虫在20℃温度控制的摇床上的锥形瓶中的液体培养基中进行培养该液体生长培养基含有缓慢生长的大肠杆菌株OP50，线虫以该品系为饲料培养虫子7日，其后将培养温度从20℃改变为33℃而诱导热激启动子控制的蛋白质生产1升初始培养物中培养的湿虫子的产量为约10g绿色荧光蛋白质(GFP)在约25％的细胞中表达，并导致在荧光光学显微镜下可见的荧光信号10～20g培养的和诱导的虫子中纯蛋白质的产量约为0.2～1.0mg称作Wnt2b的人类生长因子(智人无翅型MMTV整合位点家族2B成员)成功表达于虫子中，该生长因子来自在多克隆位点包含核苷酸序列SEQ ID NO4的质粒SEQ ID NO1简言之，线虫是在简单的液体培养基中培养的它们生长于发酵罐或锥形瓶中虫子具有约2-3日的世代时间，且成体虫子生长至约1mm长每一个雌雄同体每世代生产约300-500只卵它们可在-80℃重复的长时间贮藏在向雌雄同体的生殖腺中注射高达20个不同质粒后可选择稳定的品系序列表<110>Sauer，Uwe H.Tuck，Simon<120>秀丽新杆线虫中真核生物蛋白质和核酸分子的生产.<130>110068601<140><141><160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>3914<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明修饰的质粒<400>1atgaccatga ttacgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcaagagcat 60ttgaatcaga atatggagaa cggagcatga gcattttcga agttttttag atgcactaga 120acaaagcgtg ttggcttcct ctgagcccgc tttccttata tacccgcatt ctgcagcctt 180acagaatgtt ctagaaggtc ctagatgcat tcgtttgaaa atactcccgg tgggtgcaaa 240gagacgcaga cggaaaatgt atctgggtct ctttattgtg tacactactt ttccatgtac 300cgaatgtgag tcgccctcct tttgcaacaa gcagctcgaa tgttctagaa aaaggtggaa 360aatagtataa ataccgttga aaataaatac cgaacaacat ttgctctaat tgtgaaatta 420gaaatcttca aactataatc atctcactgg atccccggga ttggccaaag gacccaaagg 480tatgtttcga atgatactaa cataacatag aacattttca ggaggacctt ggctagcaaa 540atgaaacatc accatcacca tcaccccatg agcgattacg acatccccac tactgagaat 600ctttattttc agggcgccat gggcgccagg cctcgagata tcgatgatca gatctggtac 660caagctccgc atcggccgct gtcatcagat cgccatctcg cgcccgtgcc tctgacttct 720aagtccaatt actcttcaac 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