专利名称：荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法及其应用的制作方法肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病，2002年世界卫生组织(WHO)公布全世界每年新增1000万癌症病例，目前世界上死亡人数中有12%死于癌症。在癌症的早期阶段，可能没有多少循环肿瘤细胞，因此寻找一种高灵敏度的检测方法是识别体内早期肿瘤细胞的关键所在。纳米技术为靶向识别体内早期肿瘤细胞提供了好的方法，近年来，有将纳米技术与免疫技术相结合用于检测早期肿瘤细胞的研究，这种方法具有灵敏度高、特异性好等优点，但是这种方法包覆抗体的步骤复杂，纯化过程复杂，产量小，具有耗时长，技术要求高等限制。干细胞技术识别体内肿瘤细胞已经受到广泛的关注，有研究报道，骨髓间充质干细胞对乳腺癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞具有归巢性，可以在体内主动识别分布在肿瘤组织部位的肿瘤细胞。但是关于小鼠胚胎干细胞识别体内肿瘤细胞的研究还未见有报道。小鼠胚胎干细胞作为分子探针在体内成像的关键是荧光标记技术，有大量研究报道荧光染料标记各种细胞的研究，比如免疫细胞，肿瘤细胞，成体干细胞等，但是用荧光染料标记胚胎干细胞的报道还非常的少。用于体内识别肿瘤细胞的胚胎干细胞探针要具有较强的荧光强度，高的荧光产量，和避免自发荧光的干扰等特点。因此，荧光染料标记小鼠胚胎干细胞是体内成像的关键，荧光标记的染料主要分为传统的有机染料，比如亲脂性近红外的膜染料，和现代的无机染料，比如量子点、荧光磁性纳米粒子等。本发明选用有机染料和无机染料标记胚胎干细胞，制备出具有良好的生物安全性、强的荧光强度、较持久的抗荧光淬灭性、以及较长的发射波长等特性的胚胎干细胞探针，并应用于体内识别肿瘤细胞。到目前为止，经对现有技术的文献检索，发现聂书明等在《Biomedical Engineering))(生物医学工程)杂志2007年第9卷257-288页上发表文章“Nanotechnology Applications in Cancer”(纳米技术在肿瘤科学中的应用)，该文提出纳米材料可以偶联生物标记物，如抗体、多肽、蛋白等，在体内特异性靶向肿瘤细胞，但是这种纳米探针具有制备以及纯化步骤复杂，产量小，耗时长等缺点；而陈小元在《Future Oncology))杂志2008 年第 4 卷 623-628 页上发表文章 “Imaging mesenchymal stem cell migration and the implications for stem cell-based cancer therapies”(间充质干细胞迁移成像预不干细胞基的肿瘤治疗)，该文提出间充质干细胞在肿瘤的治疗研究中是一类有前景的基因、蛋白递送载体，但间充质干细胞不是全能性细胞，不适用于所有类型的肿瘤细胞。针对以上缺点，胚胎干细胞探针可以实现体内识别各种肿瘤细胞并且具有制备步骤简单，特异性好等优点，是一种有应用前景的干细胞基治疗肿瘤的工具。发明内容针对上述的现有技术的不足，本发明的一个目的是提供一种荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法。本发明的另一目的是将上述荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞作为识别体内肿瘤细胞的胚胎干细胞探针。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案本发明提供一种荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法，包括如下步骤步骤一，采用条件培养基用无滋养层培养方法培养小鼠胚胎干细胞；
所述条件培养基的制备方法为将第4代或者第5代的滋养层细胞按照 lxl06cells/10cm密度培养在明胶包被的培养皿中，贴壁后第二天用IOmL pH 7. 4的PBS缓冲液冲洗细胞，并添加小鼠胚胎干细胞培养基，接下来每天收集上清液，持续收集7天，保存在-20度冰箱保存，临用前用0. 22 ii m的超滤膜进行过滤,并且添加10 u g/mL的重组人白血病抑制因子。
所述无滋养层培养胚胎干细胞具体方法为用质量百分比为0. 1%明胶包被细胞培养皿并在室温下放置至少30分钟，将小鼠胚胎干细胞传代到包被后的培养皿中，并且用条件培养基进行培养，无滋养层培养至少3代。
步骤二，选取荧光染料标记小鼠胚胎干细胞；
本发明选用有机染料和无机染料标记小鼠胚胎干细胞，制备出具有良好的生物安全性、强的荧光强度、较持久的抗荧光淬灭性、以及较长的发射波长等特性的胚胎干细胞探针，可以用于体内识别肿瘤细胞。
所述无机荧光染料包括量子点，荧光磁性纳米粒子，二氧化硅包覆的荧光纳米粒子。
所述无机荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法为将无滋养层培养的小鼠胚胎干细胞和无机荧光染料共同孵育2个小时，之后弃掉多余的染料，并用pH 7. 4的PBS缓冲液洗涤细胞三次，再消化细胞并用PH 7. 4的PBS缓冲液重悬至单细胞悬液待用。
所述有机荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法为将无滋养层培养的小鼠胚胎干细胞消化为单细胞与D iR染料共同孵育30分钟，然后在4°C IOOOrpm离心弃掉多余的染料，并用PH 7. 4的PBS缓冲液洗涤细胞两次，用pH 7. 4的PBS缓冲液重悬至单细胞悬液待用。
本发明提供一种荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的应用，即将上述荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞作为识别体内肿瘤细胞的胚胎干细胞探针。具体为收集5X IO6荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞，尾静脉注射进入生物发光的肿瘤动物模型体内，选取7个时间点检测24小时内小鼠胚胎干细胞在体内的分布情况与识别肿瘤细胞的能力。
所述的选取7个时间点检测24小时内胚胎干细胞在体内的分布情况与靶向识别肿瘤细胞的能力的具体方法为将标记好的胚胎干细胞，尾静脉注射进入生物发光的肿瘤模型小鼠体内后，分别在注射后的0. 5，1,2,4,6,12，24小时通过可见光小动物成像系统对小鼠进行荧光成像检测。
所述生物发光的肿瘤动物模型，是指生物放光的皮下肿瘤动物模型或者原位肿瘤动物模型。5
所述生物放光的皮下肿瘤动物模型建立方法为培养生物发光的肿瘤细胞，注射 200 u L 2 X IO6的肿瘤细胞在裸鼠皮下，饲养4周后待用。
所述生物发光的原位肿瘤动物模型建立方法为首先培养生物发光的肿瘤细胞， 注射200 UL 2 X IO6的细胞在裸鼠皮下，培养4周后待皮下肿瘤直径长大为约5mm左右，剥离皮下肿瘤组织，并用眼科手术剪将肿瘤组织裁剪为大小约为2_左右的小块待用；接下来将待建模的小鼠用质量百分比为4. 3%的水和氯醛麻醉并用碘酒和酒精消毒皮肤，用眼科剪在小鼠胸腔隔膜的突起结点处以下Icm的地方开口 Icm长度，将建模部位的器官取出暴露在腹腔外，用医用砂纸将建模部位处磨伤，用可吸收手术缝合线(7-0DEX0N线)采用囊包法在建模部位处缝挂肿瘤组织小块，最后用可吸收手术缝合线(5-0DEX0N线)缝合腹膜和皮肤；建1吴后的小鼠精心词养4周后待用。
所述的生物发光的肿瘤动物模型，模型建立4周后验证是否成功，具体方法为 将建模后的小鼠腹腔注射D-荧光素钠盐工作液(按10 ii L/g体重浓度，加入相应体积的 15mg/mL荧光素工作液)，注射入体内5_10分钟后，采用可见光小动物成像系统进行生物发光成像分析，曝光时间为I分钟。
与现有技术相比，本发明提供一种荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法，得到的荧光标记的小鼠胚胎干细胞作为识别体内肿瘤细胞的胚胎干细胞探针，具有操作简单，速度快，灵敏度高，和特异性好的优点，并且为肿瘤的治疗提供了中间信息，同时为该领域的研究提供了新的方向。


图I为实施例I中的无滋养层培养方法培养的小鼠胚胎干细胞的形态图2为实施例2中的小鼠皮下胃癌肿瘤模型建模4周后的小鼠可见光成像图3为实施例2中的DiR标记的小鼠胚胎干细胞24小时内识别小鼠皮下肿瘤模型体内胃癌细胞的小鼠荧光成像图4为实施例3中的量子点标记的小鼠胚胎干细胞的细胞形态和荧光成像复合图5为实施例4中的胃部原位肿瘤动物模型建模4周后的生物发光成像图。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照研究者所建议的条件。
实施例I
DiR标记的小鼠胚胎干细胞的培养方法
步骤一，用0. I %明胶包被细胞培养皿并在室温下放置至少30分钟，将小鼠胚胎干细胞(SV129品系)传代到包被后的培养皿，并且用小鼠胚胎干细胞条件培养基进行培养，无滋养层培养至少3代。无滋养层培养方法培养得到的小鼠胚胎干细胞如图I所示。
条件培养基制备方法将第4代滋养层细胞按照lxlOYells/lOcm密度培养在0.I %明胶包被的细胞培养皿中，贴壁后第二天用IOmL pH 7.4的PBS缓冲液冲洗细胞，并添加小鼠胚胎干细胞培养基，接下来每天收集上清液，持续收集7天，临用前用0. 22 y m的超滤膜进行过滤，并添加IOii g/mL的重组人白血病抑制因子(LIF因子，购买于Millipore 公司)。
小鼠胚胎干细胞的培养基组成为knockout-DMEM细胞培养基，添加20% FBS, I % 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺，I %青链霉素，0. 1% ^ -巯基乙醇，IOii g/mL重组人白血病抑制因子(LIF因子)。
步骤二，用0. 05%的胰酶消化液将小鼠胚胎干细胞消化为单细胞并加入320 U g/ mL的DiR染料(购买于Xenogeny公司)在室温下孵育30分钟,然后在4°C IOOOrpm离心弃掉多余的染料，并用PH 7. 4的PBS缓冲液洗涤细胞两次，计数5 X IO6DiR标记的小鼠胚胎干细胞并重悬在200 ii L的pH 7. 4的PBS缓冲液中待用。
实施例2
用实施例I所得到的DiR标记的小鼠胚胎干细胞作为识别小鼠皮下肿瘤模型体内胃癌细胞的胚胎干细胞探针。
小鼠皮下肿瘤模型的建立方法培养2106生物发光的胃癌细胞1 ^803(410细胞株)，注射在裸鼠的皮下，建模后的小鼠精心饲养4周后,皮下肿瘤直径长大为约5-10_ 左右可待用。
将5X IO6DiR标记的小鼠胚胎干细胞尾静脉注射进入皮下胃癌模型的小鼠体内， 分别在注射后的0. 5，I，2，4，6，12，24小时通过可见光小动物体内成像系统对小鼠进行荧光成像检测，成像条件为激发波长710nm和发射波长760nm，自动曝光模式。
如图2所示，为实施例2中的小鼠皮下胃癌肿瘤模型建模4周后的小鼠可见光成像图；如图3所示，为实施例2中的DiR标记的小鼠胚胎干细胞24小时内识别小鼠皮下肿瘤模型体内胃癌细胞的小鼠荧光成像图。
实施例3
量子点标记的小鼠胚胎干细胞的培养方法
步骤一，用0. I %明胶包被细胞培养皿并在室温下放置至少30分钟，将小鼠胚胎干细胞传代到包被后的培养皿，并且用小鼠胚胎干细胞条件培养基进行培养，无滋养层培养至少3代。
条件培养基制备方法将第4代滋养层细胞按照lxlOYells/lOcm密度培养在0.I %明胶包被的细胞培养皿中，贴壁后第二天用IOmL pH 7. 4的PBS缓冲液冲洗细胞，并添加胚胎干细胞培养基，接下来每天收集上清液，持续收集7天，临用前用0. 22 y m的超滤膜进行过滤，并添加10 V- g/mL的重组人白血病抑制因子(LIF因子,购买于Millipore公司)。
小鼠胚胎干细胞的培养基组成为knockout-DMEM细胞培养基，添加20% FBS, I % 非必需氨基酸，1% L-谷氨酰胺，I %青链霉素，0. 1% ^ -巯基乙醇，IOii g/mL重组人白血病抑制因子(LIF因子)。
步骤二，用50 ii g/mL的量子点溶液(实验室自制)在37°C培养箱内孵育无滋养层培养的小鼠胚胎干细胞2个小时，之后弃掉多余的量子点溶液并用pH 7. 4的PBS缓冲液洗涤小鼠胚胎干细胞两次，再用0. 05%的胰酶消化液将小鼠胚胎干细胞消化为单细胞，计数5 X IO6标记的小鼠胚胎干细胞并重悬在200 ii L的pH 7. 4的PBS缓冲液中待用。
如图4所示,为实施例3中的量子点标记的小鼠胚胎干细胞的细胞形态和突光成像复合图。
实施例4
用实施例3得到的量子点标记的小鼠胚胎干细胞作为识别胃部原位肿瘤动物模型体内胃癌细胞的探针
胃部原位肿瘤动物模型的建立方法培养2X IO6生物发光的胃癌细胞 MGC803 (ATCC细胞株)，注射在裸鼠的皮下，培养4周后皮下肿瘤长大为约5_左右，剥离皮下肿瘤组织，并用眼科手术剪将肿瘤组织裁剪为大小约为2_左右的小块待用；待建模的小鼠用4. 3%的水和氯醛麻醉并用碘酒和酒精消毒皮肤，用眼科剪在小鼠胸腔隔膜的突起结点处以下Icm的地方开口 Icm长度，将胃取出暴露在腹腔外，用医用砂纸将胃的大弯处磨伤，用可吸收手术缝合线(7-0DEX0N线)采用囊包法在胃的大弯处缝挂肿瘤组织小块，最后用可吸收手术缝合线(5-0DEX0N线)缝合腹膜和皮肤；建模后的小鼠精心饲养4周后，在腹腔内注射D-荧光素钠盐工作液(按10 ii L/g体重浓度，加入相应体积的15mg/mL荧光素工作液)，注射入体内5-10分钟后，采用可见光小动物体内成像系统对小鼠进行生物发光成像，曝光时间为I分钟，检测到胃部出现明显的生物发光信号，则胃癌原位模型建立成功待用。
将5X IO6量子点标记的小鼠胚胎干细胞尾静脉注射进入胃癌原位模型小鼠体内， 分别在注射后的0. 5，1,2,4,6,12，24小时通过可见光小动物体内成像系统对小鼠进行荧光成像检测，成像条件为激发波长460nm和发射波长630nm,自动曝光模式。
如图5所示，为实施例4中的胃部原位肿瘤动物模型建模4周后的生物发光成像图。
上述应用实施例中，所述的荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞作为胚胎干细胞探针，可以应用于体内识别肿瘤细胞，相对于现有的纳米探针以及间充质干细胞探针，具有特异性好、灵敏度高、操作简单等优点。同时，从上述实施例中也可以看出，荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞作为识别小鼠体内肿瘤细胞的胚胎干细胞探针不是为了得到诊断结果和治疗肿瘤，而是为临床上应用胚胎干细胞技术治疗肿瘤提供了中间信息，并为该领域提供了新的科研方向。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。


本发明公开一种荧光染料标记小鼠胚胎干细胞的方法及其应用，步骤用0.1％明胶包被细胞培养皿并在室温下放置至少30分钟，将小鼠胚胎干细胞传代到包被后的培养皿中，并且用条件培养基进行培养，无滋养层培养至少3代；再将无滋养层培养的小鼠胚胎干细胞用无机荧光染料和有机荧光染料标记待用；最后将荧光染料标记的小鼠胚胎干细胞应用于体内识别肿瘤细胞。本发明用荧光染料标记小鼠胚胎干细胞，制备出具有良好的生物安全性、强的荧光强度、较持久的抗荧光淬灭性、以及较长的发射波长等特性的胚胎干细胞探针，可以用于识别体内肿瘤细胞，为临床上应用胚胎干细胞技术治疗肿瘤提出了创新点和科研方向。