专利名称：大黄鱼刺激隐核虫的lamp检测试剂盒及检测方法刺激隐核虫iCiyptocaiyon irriia/^)是一种寄生于海水硬骨鱼类皮肤和鳃上皮组织的纤毛虫，引起鱼的活动异常、上皮增生、呼吸困难以及机械损伤，继而带来病菌的继发感染。已被列为农业部2008年12月发布的新版“一、二、三类动物疫病病种名录”，其所引发的“白点病”及继发性细菌性感染(白鳃病、细菌性溃疡等)给我国海水养殖带来巨大损失，如2009年，整个宁德市均爆发了大规模大黄鱼刺激隐核虫病，蕉城区的发病率竟达 100%，全市损失超过2亿元。2009年10月底宁波象山也爆发了大规模的刺激隐核虫病，大黄鱼的死亡率达90%以上，经济损失惨重。因此预先分析、检测确定发病病原体就显得尤为重要。目前检测刺激隐核虫感染的方法主要包括组织病理学观察、显微镜检以及PCR等生物技术诊断方法。但是组织病理学观察、显微镜检这些传统检测方法有时候并不能严格的区分感染刺激隐核虫与感染症状相似的其他寄生虫，缺乏灵敏度和特异性。聚合酶链式反应(PCR)虽具有极高的灵敏度和特异性，已被应用于多种寄生虫病的诊断实践，但其需要 PCR仪等诸多精密仪器的配套使用，使其无法满足现场和基层检验的需要。为有效控制大黄鱼刺激隐核虫病，需建立灵敏、高效和简便的检测技术。
本发明所要解决的技术问题是提供大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒，该 LAMP检测试剂盒具有高灵敏度、高特异性、适用于海水养殖场中大黄鱼刺激隐核虫病的现场快速检测；应用该LAMP检测试剂盒的检测大黄鱼寄生虫的方法具有操作简单，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，为刺激隐核虫病的早期防治提供技术支持。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒，包括IOXThermoPol反应缓冲液、浓度为IOOmM的MgSO4溶液、浓度为10 mM的 dNTP液、浓度为8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / Β3引物溶液和双蒸水，所述FIP / BIP引物溶液含有FIP引物和BIP引物，所述FIP引物的核苷酸序列为ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG,所述 BIP 引物的核苷酸序列为 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG,所述 FIP 引物和所述 BIP 引物的浓度都为1.6 2.4μM，所述F3 / Β3引物溶液含有F3引物和Β3引物，所述F3引物的核苷酸序列为AAGTGCAAGT CATCAGCT，所述B3引物的核苷酸序列为CGGAAACCTT GTTACGACT,所述 F3引物和B3引物都为0. 4 0.6 μ M。该LAMP检测试剂盒可以为100 X 25 μ 1反应体系10 X ThermPol缓冲液2. 5 μ 1， dNTP 溶液 2.0 μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. 0 μ 1，MgSO4 溶液 0. 5 μ 1，FIP / BIP 引物溶液 0.5 μ 1, F3 / Β3引物溶液0. 5μ1，样品DNA模板1 μ 1，余量用双蒸水补足。ThermoPol反应缓冲液(含 200mMTris-Hcl，100 mM KCl, 20 mM MgSO4 ； 100 mM (NH4)2SO4 ； 1. 0 % TritonX-IOO ；8M betaine)、dNTP 液和 Bst DNA 聚合酶液均购于 TaKaRa 公司。该LAMP检测试剂盒还可以有阳性对照液和阴性对照液，阳性对照液含有刺激隐核虫阳性DNA，阴性对照液为双蒸水，用以对比、验证检测。该LAMP检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤A、取寄生大黄鱼的虫体5(Γ150μ g用450 μ 1的TE缓冲液洗涤离心一次，倒掉上清液， 虫体中再加入所述TE缓冲液450μ 1，浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液3μ 1，质量百分浓度为20%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液20 μ 1，混勻，于37°C首次温浴30min，首次温浴结束， 加入浓度为5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基铵-氯化钠混合液80 μ 1，混勻，于65°C再次温浴lOmin，得到虫体温浴液，所述TE缓冲液的pH 8. 0，所述TE缓冲液中三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)的浓度为lOmmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)的浓度为 lmmol/L，所述溴化十六烷三甲基铵-氯化钠混合液中溴化十六烷三甲基铵(CTAB)的质量百分浓度为10%，NaCl的浓度为0. 7mol/L ；TE缓冲液可以自配，也可以从TaKaRa公司等购买，蛋白酶K溶液购于TaKaRa公司；B、再次温浴结束，虫体温浴液中加入与该虫体温浴液等体积的氯仿-异戊醇混合液， 混勻，10000r/min离心5min，保留上清，所述氯仿-异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为 24:1 ；C、上述上清中加入与该上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液混勻，10000r/min离心 5min,所得上清继续用与所得上清等体积的所述酚-氯仿-异戊醇混合液混勻，10000r/min 离心5min，如此重复混勻、离心至无白色物质为止，得到去杂上清，所述酚-氯仿-异戊醇混合液中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25:24:1 ；D、在上述去杂上清中加入该去杂上清两倍体积的无水乙醇，室温放置纩12min，然后在 40C，15000r/min离心20min，弃上清，沉淀用质量百分浓度为70%的乙醇洗涤两次，然后在空气中晾晒5 20min，再加入所述TE缓冲液20 μ 1，_20°C保存，得到样品DNA模板；E、取样品DNA模板1μ 1，与所述大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒组成25 μ 1反应体系10 X ThermPol 缓冲液 2. 5 μ 1，dNTP 溶液 2. O μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. O μ 1，MgSO4 溶液0. 5μ1，ΡΙΡ / BIP引物溶液0. 5μ1，F3 / Β3引物溶液0. 5μ1，样品DNA模板Ιμ ， 余量用双蒸水补足；60 63°C下反应，反应完毕出现白色沉淀或反应液浑浊则该虫体为刺激隐核虫。若反应液清澈也未出现白色沉淀则不是刺激隐核虫。有条件也可以取4.0μ1 的清澈与浑浊之间的反应液，进一步用经溴化乙锭(EB)染色后的1. 5%的琼脂糖凝胶电泳， 在紫外灯下分析扩增结果，显示阶梯状的特异性条带为阳性，无条带为阴性。与现有技术相比，本发明的优点在于大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒及检测方法，包括反应缓冲液、MgSO4溶液、dNTP液、Bst DNA聚合酶液、FIP / BIP引物溶液、F3 / B3引物溶液和双蒸水，FIP引物的核苷酸序列为ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG, BIP 引物的核苷酸序列为 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG, F3引物的核苷酸序列为AAGTGCAAGT CATCAGCT，B3引物的核苷酸序列为CGGAAACCTT GTTACGACT ；该LAMP检测试剂盒对大黄鱼刺激隐核虫具有高灵敏度、高特异性，适用于海水养殖场中大黄鱼刺激隐核虫病的现场快速检测；用该LAMP检测试剂盒检测大黄鱼刺激隐核虫具有操作简单，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，为刺激隐核虫病的早期防治提供技术支持。

大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒，包括lOXThermoPol反应缓冲液250 μ 1、浓度为IOOmM的MgSO4溶液50 μ 1、浓度为10 mM的dNTP液200 μ 1、浓度为8 U / μ L的Bst DNA聚合酶液100 μ 1、引物浓度都为1.6 2. 4μ M的FIP / BIP引物溶液50 μ 1、浓度都为0.4 0.6μΜ的F3 / Β3引物溶液50 μ 1和双蒸水2 X 300ml，FIP引物的核苷酸序列为 ACTCGAAATC GGTAGGAGCG TGTACTGATT ACGTCCCTG，BIP 引物的核苷酸序列为 GATCCGGTGA ACCTTCTGGA TCCTTCCTCT AAGTGAAGTG, F3 引物的核苷酸序列为 AAGTGCAAGT CATCAGCT, B3 引物的核苷酸序列为CGGAAACCTT GTTACGACT，FIP引物、BIP引物、F3引物和B3引物是 GENBANK，登陆号JN636814. 1的保守的18S-ITS2基因特异性片段，用primer explorer 4 软件自动挑选及人工筛选(特异性和灵敏性试验)后设计完成；引物由上海生工合成。实施例2
取寄生大黄鱼的虫体5(Γ150 μ g或含虫体的大黄鱼组织(肌肉、鳃、粘液等)Ig左右，用 450 μ 1 的 TE 缓冲液(ρΗ 8. 0，Tris-HCl 浓度 10mmol/L，EDTA 浓度 lmmol/L)洗涤离心一次，倒掉上清液，虫体中再加入TE缓冲液450 μ 1，浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液3 μ 1， 质量百分浓度为20%的SDS溶液20 μ 1，混勻，于37°C首次温浴30min，首次温浴结束，加入浓度为5mol/L的NaCl溶液100 μ 1，溴化十六烷三甲基铵-氯化钠混合液(CTAB浓度10%， NaCl浓度0. 7mol/L ) 80 μ 1，混勻，于65°C再次温浴lOmin，得到虫体温浴液；加入与该虫体温浴液等体积的氯仿-异戊醇混合液(体积比1)，混勻，10000r/min离心5min，保留上清，上清用与该上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(体积比25:24:1)混勻，IOOOOr/ min离心5min，离心所得上清继续重复用与该所得上清等体积的所述酚_氯仿_异戊醇混合液混勻，10000r/min离心5min，按如此混勻、离心方法，经5_6次重复混勻、离心，溶液已无白色物质，得到去杂上清；去杂上清中加入该去杂上清两倍体积的无水乙醇，室温放置 8 12min，然后在4°C，15000r/min离心20min，弃上清，沉淀用质量百分浓度为70%的乙醇洗涤两次，然后在空气中晾晒5 20min，再加入所述TE缓冲液20 μ 1，_20°C保存，得到样品 DNA模板；取样品DNA模板1 μ 1，与大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒组成25 μ 1反应体系10 X ThermPol 缓冲液 2. 5 μ 1，dNTP 溶液 2. 0 μ 1，Bst DNA 聚合酶液 1. 0 μ 1，MgSO4 溶液0.5 μ 1，FIP / BIP引物溶液0. 5yl，F3 / B3引物溶液0. 5 μ 1，样品DNA模板1 μ 1，余量用双蒸水补足；60 63°C下反应，反应完毕出现白色沉淀或反应液浑浊则该虫体为刺激隐核虫。实施例3
取大黄鱼刺激隐核虫，同时以海水养殖常见细菌哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及淡水小瓜虫，瓣体虫和本尼登虫等寄生虫为样本测试LAMP反应的特异性，用实施例2相同的提取和检测方法进行提取检测，同时对大黄鱼刺激隐核虫提取的DNA用紫外分光光度计测得提取的刺激隐核虫基因组DNA浓度，并以此为母液将DNA浓度以10—1 l(T8ng/y 1梯度稀释，每种浓度取1 μ 1为模板进行LAMP扩增。LAMP检测结果刺激隐核虫样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明本发明的试剂盒与其他海水养殖常见细菌及寄生虫无交叉反应，说明本发明的试剂盒对大黄鱼刺激隐核虫特异。LAMP检测刺激隐核虫最低检出量为 10_7 ng/μ 1，说明本发明的试剂盒对大黄鱼刺激隐核虫灵敏。


本发明公开了大黄鱼刺激隐核虫的LAMP检测试剂盒及检测方法，包括反应缓冲液、MgSO4溶液、dNTP液、BstDNA聚合酶液、FIP/BIP引物溶液、F3/B3引物溶液和双蒸水；该LAMP检测试剂盒对大黄鱼刺激隐核虫具有高灵敏度、高特异性，适用于海水养殖场中大黄鱼刺激隐核虫病的现场快速检测；用该LAMP检测试剂盒检测大黄鱼刺激隐核虫具有操作简单，对仪器要求简单，结果易于观察等优点，为刺激隐核虫病的早期防治提供技术支持。