专利名称：一种山乌龟的离体快速繁殖方法一种山乌龟的离体快速繁殖方法技术 领域本发明涉及一种植物快速繁殖方法，尤其是山乌龟的离体快速繁殖方法，属于 植物栽培技术领域。山乌龟是我国传统中药，主要分布于我国云南、贵州、四川等地。由于其肉质 块根古雅、奇特，果实玲珑，叶色清秀，植株外形别致可爱，因此，除了用作药材外， 还可作为极具观赏价值的盆栽植物，或者园林、绿化用植物。山乌龟植物最具药用价值 的是其硕大的根块，其成分中富含生物碱，随着新分离技术和高灵敏检测仪器的出现， 大量的生物碱被分离出来，含量高达3% 4%，在临床上被广泛用于抗菌消炎、镇静、 理气止痛等，同时山乌龟根块是颅痛定的主要生产原料。随着山乌龟的药用价值和观赏 价值被不断发掘，市场对山乌龟的需求时也逐渐加大。然而由于山乌龟为雌雄异株，且 种子小，种壳坚硬，在自然条件下萌发较为困难，因此繁殖能力极差，加上近年来受人 为造成的环境因素影响，使山乌龟的种群及个体数量急剧减少。仅通过传统的播种、分 块的方法，远不能满足日益增长的市场需求。因此，需要研发出新的成本低、时间短、 成活率高的无性繁殖体系，以扩大山乌龟繁殖量，实现山乌龟的产业化生产。
本发明的目的在于提供一种山乌龟的组织培养与快速繁殖方法，以建立山乌龟 种群，扩大山乌龟繁殖量，提高增殖率及生根率，为山乌龟的规模化、产业化生产提供 优质种苗。为实现上述目的，本发明提供这样一种山乌龟的离体快速繁殖方法，其特征在 于经过以下工艺步骤A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中 至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2 3cm长的茎段，用常规的 加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒1 4min,用无菌水漂洗3 4次，得无菌茎段；B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中MS培养基6-苄胺基嘌呤(6-BA) 0.5 1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) O 0.05mg/L萘乙酸(NAA)O 0.05mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值5.8 6.0在培养温度为22 28°C，光照强度为1500 2000Lx，光照时间为8 12h/d的条件下，诱导培养16 30天，在茎段基部萌发出1 4个不定芽；C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中MS培 养基6-苄胺基嘌呤(6-BA) 1.0 2.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.02 0.04mg/L萘乙酸(NAA)0.02 0.04mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值5.8 6.0在培养温度为22 28°C，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为8 12h/d 的条件下，增殖培养20 25天，每个不定芽新增殖1 9个增殖芽，切下新增的高度为 2 5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；D、将C步骤的增殖芽按节切成2 3cm长的茎段，接种在下列继代培养中3-吲哚丁酸(IBA)0.1 0.3mg/L萘乙酸(NAA)0.1 0.3mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值5.8 6.0在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中1/2MS 培养基6-苄胺基嘌呤(6-BA) 0 0.2mg/L3-吲哚丁酸(IBA)0 1.0mg/L萘乙酸(NAA)O l.Omg/L琼脂7.0g/L白糖30g/LpH 值5.8 6.0在培养温度为22 28°C，光照强度为2000 2500Lx，光照时间为8 12h/d 的条件下，培养15 20天，得生根苗；F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼5 7天，取苗，用清水洗净苗上 培养基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1 2分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩= 1:1: 1质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、 病虫害防治管理，成活率达85%以上，当苗长至3 5cm高，并生出大量须根时，即得 到种植苗。本发明具有下列优点和效果1、采用上述方案，可对山乌龟的茎段进行快速增殖，同时保持和固定了山乌龟 块根硕大、高产、形状奇特等优良种性，从而在保证药用需求的同时，又能满足观赏价 值的特殊需求；2、种苗来源单一，易于控制，解决了常规种子繁育体系很难将山乌龟优良性状 固定或保持下来的难题，有效地提高了种苗质量；3、能有效缩短生产周期，繁殖速度快，20 25d为一个周期，繁殖倍数达1 9，易于优质种苗的规模化、标准化和工厂化生产；4、利用组织培养技术在培养室内实现周年生产，节约了土地资源，提高了经济 效益，克服了种苗无法周年进行生产的难点；5、本发明对山乌龟种苗生产技术流程中的关键环节进行优化整合，采取低激素 配比、激素混用和轮用的方式，达到提高增殖率和减少变异的目的，所生产的增殖苗和 生根苗，苗株健壮、节间短而粗壮、叶色浓绿，质量优，移栽成活率高达85%以上；6、无菌生根苗直接移栽进入育苗袋中，省去了组培苗营养钵移栽的环节，移栽 成活的种苗便于运输，摘去育苗袋后即可直接栽种。天，得生根苗；F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼5天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩=1 1 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3 5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。实施例2 A、选择体积硕大、形状优美特别、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠 岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2 3cm长的茎段，用常 规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒 4min,用无菌水漂洗4次，得无菌茎段；B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中MS培养基6-苄胺基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.05mg/L萘乙酸(NAA)0.05mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值6.0在培养温度为28°C，光照强度为2000Lx，光照时间为8h/d的条件下，诱导培养 30天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中MS培养基3-吲哚丁酸(IBA)萘乙酸(NAA)O.lmg/L O.lmg/L琼脂白糖pH 值
6.5g/L 30g/L 5.8
7
6-苄胺基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.04mg/L萘乙酸(NAA)0.04mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值6.0在培养温度为28°C，光照强度为2500Lx，光照时间为8h/d的条件下，增殖培 养25天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为 2 5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；D、将C步骤的增殖芽按节切成2 3cm长的茎段，接种在下列继代培养中3-吲哚丁酸(IBA)0.3mg/L萘乙酸(NAA)0.3mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值6.0在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下 长2 3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为1/2MS 培养基6-苄胺基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L3-吲哚丁酸(IBA)1.0mg/L萘乙酸(NAA)l.Omg/L琼脂7.0g/L白糖30g/LpH 值6.0在培养温度为28°C，光照强度为2500Lx，光照时间为8h/d的条件下，培养20
天，得生根苗；F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼7天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩=1 1 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3 5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。实施例3A、选择体积硕大、形状优美奇特、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠 岩中至长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2 3cm长的茎段，用常 规的加有适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒 2min,用无菌水漂洗3次，得无菌茎段；0120]B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中
0121]MS培养基
0122]6-苄胺基嘌呤(6-BA)0.8mg/L
0123]萘乙酸(NAA)0.03mg/L
0124]琼脂6.5g/L
0125]白糖30g/L
0126]pH 值5.9
0127]在培养温度为25°C，光照强度为1800Lx，光照时间为10h/d的条件下，诱导培 养22天，在茎段基部萌发出不定芽，少的为一个芽，多的为四个芽；
0128]C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中
0129]MS培养基
0130]6-苄胺基嘌呤(6-BA)1.5mg/L
0131]2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.03mg/L
0132]萘乙酸(NAA)0.03mg/L
0133]琼脂6.5g/L
0134]白糖30g/L
0135]pH 值5.9
0136]在培养温度为25°C，光照强度为2200Lx，光照时间为10h/d的条件下，增殖培 养22天，每个不定芽新增出增殖芽。最少的为一个芽，最多的为九个芽，切下新增的高 度为2 5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养 条件继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；D、将C步骤的增殖芽按节切成2 3cm长的茎段，接种在下列继代培养中3-吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L萘乙酸(NAA)0.2mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值5.9在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下 长2 3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为1/2MS 培养基6-苄胺基嘌呤(6-BA)0.1mg/L3-吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L琼脂7.0g/L白糖30g/LpH 值5.9在培养温度为25°C，光照强度为2300Lx，光照时间为10h/d的条件下，培养18
天，得生根苗；
F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒1分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩=1 1 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3 5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。实施例4A、选择体积硕大、形状优美、芽眼较多的山乌龟块根，栽种于室内珍珠岩中至 长出新梢，并切下该新梢作为外植体，去掉叶片，切成2 3cm长的茎段，用常规的加有 适量洗涤剂的水清洗茎段，再用清水洗净，用质量浓度为0.1%的升汞溶液消毒3min，用 无菌水漂洗4次，得无菌茎段；
0155]B、将A步骤的无菌茎段接种于下列诱导培养基中
0156]MS培养基
0157]6-苄胺基嘌呤(6-BA)0.6mg/L
0158]2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.02mg/L
0159]琼脂6.5g/L
0160]白糖30g/L
0161]pH 值5.8
0162]在培养温度为26°C，光照强度为1800Lx，光照时间为9h/d的条件下，诱导培养 20天，在茎段基部萌发出不定芽，最少的一个芽，最多的四个芽；
0163]C、将B步骤的不定芽切下，接于下列增殖培养基中
0164]MS培养基
0165]6-苄胺基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L
0166]2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.02mg/L
0167]萘乙酸(NAA)0.04mg/L
0168]琼脂6.5g/L
0169]白糖30g/L
0170]pH 值5.8
0171]在培养温度为26°C，光照强度为2300Lx，光照时间为9h/d的条件下，增殖培 养23天，每个不定芽新增出增殖芽，最少的一个芽，最多的九个芽，切下新增的高度为 2 5cm的增殖芽，接种在新的与本步骤相同的增殖培养基中，按本步骤相同的培养条件 继续增殖培养，如此继代培养至获得足够量的增殖芽；D、将C步骤的增殖芽按节切成2 3cm长的茎段，接种在下列继代培养中3-吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L萘乙酸(NAA)0.3mg/L琼脂6.5g/L白糖30g/LpH 值5.8在与C步骤相同的培养条件下进行壮苗培养，得健壮、带叶的丛生苗；E、将D步骤的丛生苗分成单株，接入下列生根培养基中，芽苗过高的，可切下长2 3cm的苗尖转接至下列生根培养基中，余下的基部返回接种到C步骤的增殖培养 基中，继续进行增殖培养，所述生根培养基为1/2MS 培养基萘乙酸(NAA)1.0mg/L琼脂7.0g/L白糖30g/LpH 值5.8在培养温度为26°C，光照强度为2300Lx，光照时间为9h/d的条件下，培养18
天，得生根苗；F、将E步骤的生根苗在室外散射光下锻炼6天，取苗，用清水洗净苗上培养 基，放入0.1%多菌灵溶液中消毒2分钟，移栽至装有红土河沙珍珠岩=1 1 1 质量比基质的育苗袋中，并在基质表面撒上适量腐殖土，按常规浇水、施肥、病虫害防 治管理，成活率达85%以上，当苗长至3 5cm高，并生出大量须根时，即得到直接种 植在大田中的种植苗。


本发明提供一种山乌龟的离体快速繁殖方法，经过外植体的选择、外植体灭菌、不定芽诱导培养、不定芽增殖培养、继代培养、生根培养、过渡移栽等工艺步骤，在所对应的各种培养基上进行培养，炼苗后直接移栽即可。进种率可达90％，移栽成活率在85％以上。该方法解决了山乌龟用常规方法繁殖能力差，繁殖速度慢的难题，建立了山乌龟无菌繁殖技术体系。达到了进种效率高，增殖速度快的目的。实现了山乌龟优良品种种苗的规模化和标准化生产。