专利名称：一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法蟆叶秋海棠(Begonia rex),秋海棠科(Begoniaceae)秋海棠属(Begonia)多年生草本观叶植物，原产巴西和鳊东部一带，叶形优美，叶色绚丽，是室内极好的观叶植物。性喜温暖、湿润、半阴及空气湿度大的环境，忌强光直射。生长适温为22-25°C，不耐高温，气温超过32 °C则生长缓慢。蟆叶秋海棠，根茎肥厚，粗短，叶宽卵形，边缘有深波状齿牙。叶绿色，叶面上有深 绿色纹，中间有银白色斑纹，叶背为紫红色。叶和叶柄上密生茸毛，花较小，为淡红色。6-9月开花，聚伞花序，花朵饱满呈水红色，袅娜娇艳，亦颇具观赏价值然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于蟆叶秋海棠组织培养的报道较少，何勇等通过蟆叶秋海棠的幼嫩叶片外植体进行组织培养，得出了再生植株，但只是重点研究了愈伤组织的诱导试验，并没有对增殖方法进行摸索(《蟆叶秋海棠离体培养的研究》，湖北农业科学，2009年第8期，1814-1816页)，本申请实验室之前申请相关专利申请201010504126扦插时间较长，且增殖率较低。本申请课题组曾发表文章《蟆叶秋海棠“光灿”组织培养技术研究》，江西农业学报，2011年12期，然而，其整体增殖率较低，一个培养周期(70d左右)增殖率仅为80.5倍，且组培周期相对较长，现有技术中亟需一种蟆叶秋海棠高效离体快繁方法。
本发明的目的是为了建立蟆叶秋海棠组织培养繁殖体系。为了达到上述目的，本发明提供了一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，包括如下步骤(I)外植体的选取与消毒选取3个月左右叶龄的叶片作为外植体，冲洗干净后，进行消毒，消毒过程为先以适量洗衣粉溶液浸泡清洗，后用自来水反复冲洗，放入质量份数为3%的H2O2中浸泡3min，取出后立即转入含有2% (质量浓度)吐温_80的0.1%升汞溶液中消毒3min，再以无菌水冲洗5-6次，每次6_8min，消毒滤纸吸干表面水分，将叶片边缘切除后切成0. 5-1 cm2的方形小块。(2)不定芽的诱导取步骤⑴中处理得到的外植体，切割为0. 5-1. Ocm2大小的方块，将叶片以远轴面接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为25±2°C，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养15d ;所述正常光照培养条件为光照时间为14h/d，光照强度为 13001x ;所述诱导培养基为 MS+0. 8mg/L6-BA+0. 3mg/L IBA+0. 5mg/L GA3, pH值为6. O ;(3)高压静电场HVEF处理，利用高压静电场仪器，进行静电场处理，强度为5KV/cm,时间I小时；(4)不定芽的继代增殖将诱导得到的不定芽切割后，接入继代增殖培养基中进行继代培养20d，培养温度为25±2°C，光照时间为14h/d，光照强度为16001x ;所述继代增殖培养基为 MS+1. 2mg/L6-BA+0. 2mg/L IBA+0. 2mg/LKT, pH 值为 6. 0 ；(5)根的诱导将步骤(4)中继代增殖得到的蟆叶秋海棠试管苗进行切割后，每株均有一个不定芽，接入生根培养基中进行生根培养15d，培养温度为25±2°C，光照时间为14h/d，光照强度为16001x ;所述生根培养基为1/2MS+ 0. 2mg/L IBA+0. lmg/LNAA, pH值为6. 0 ;待不定跟数5条左右，植株整体生长稳健时，可准备移苗出瓶。以上所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L，且 pH 值为 6. O0(6)将培养瓶的瓶盖打开，炼苗2-3天，移栽入扦插基质中，所述扦插基质为按照3:2:1: I的重量比例将马肝土、黄土、泥炭土和珍珠岩混匀，地上部分喷洒0. 1%的多菌灵，每天喷水2次，保证湿度，避免阳光直射。对于本发明的进一步改进在于，所述步骤(I)中外植体的选取，以3个月叶龄的叶片为外植体，在诱导15后即可有效获得大量不定芽，数量多且生长迅速；所述步骤(2)中的最佳暗培养时间为24h，最佳不定芽诱导培养时间为15d ;所述步骤(4)中的最佳继代增殖培养时间为20d ;所述步骤(5)中的最佳生根培养时间为15d。本发明蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法具有以下优点I外植体的消毒处理，本申请发明人经过大量创造性劳动及多因子实验，全面改进现有技术中的操作参数，发现，按照常规的消毒方式即洗衣粉浸泡-升汞消毒-无菌水冲洗，存在一定的污染率，而采用本申请的操作过程，不仅取得了理想的灭菌效果，还能够保证诱导培养所需的外植体数。2外植体的放置方式放置方式的不同导致培养效果不同，远轴面放置的外植体出芽早，数量多，增长极快，显著优于近轴面放置的叶片。3组织培养方法其步骤都具有相似性，其结果却具有显著的不同，本领域公知组织培养方法一般分为暗培养和光培养两个阶段，暗培养一般是诱导愈伤组织，光培养诱导分化。暗培养要求避光，其实是防止迅速分裂的愈伤细胞老化，本申请发明人经过反复实验得出，蟆叶秋海棠先经过一段时间的暗培养，使外植体迅速分裂，然后光诱导培养，其萌发率最高，外植体出芽更加迅速,缩短组培时间。4本领域公知，对于植物组培领域研究如何利用植物组织分化再生植株，提高植物的繁殖数量，是科学家研究重要的技术重点也是技术难点，而激素种类及激素浓度使用范围，培养基类型更是重中之重，本申请发明人经过大量创造性劳动，筛选的到最佳的蟆叶秋海棠诱导培养基、增殖培养基及生根培养基的成分及激素组合，不仅诱导、增殖效果明显，且出芽时间大大缩短，仅15d就能出芽，且增殖、生根效果显著。且对于蟆叶秋海棠而言，pH值要求相对严格，PH低于6.0的情况下培养材料生长两周会发黄及容易出现玻璃化现象，且生长缓慢，其最适pH为6. O。5愈伤组织生长周期中因受损伤、营养状况、环境因子的限制和影响呈S型生长曲线，但是静电场的处理影响了膜的通透性及其它极性分子的运动，改善了细胞的吸收和转运物质能力，从而能够促进组织的生长，使得继代延迟期缩短，很快进入对数生长期。利用静电场处理，不同的强度和时间组合会产生不同的效果，如果处理电场强度过大，或处理时间过长，会使得植物细胞受到伤害甚至死亡，而电场强度过小或时间过短，又会造成处理效果不明显，本申请发明人经过大量实验得出对蟆叶秋海棠采用强度为5KV/cm，时间I小时的静电场处理可以显著改善生长状况，鲜重增加明显，生长速度为107. 3mg/d，而不采用静电场处理，生长速度仅为81. 5mg/d，生长速度提高了 31%，大大促进了细胞的分裂和生长，缩短了离体培养的时间。6马肝土是长江下游地区特有的一种土壤，沙性强，干可固根，湿可保水，透水能力强，最适宜于插穗生根前的水分控制，其缺点是透水能力强，失水过快、容易风干，单一使用会使扦插苗成活后基部失水干枯。而黄土过于粘稠，不透气。泥炭土具有良好的通透性和较大的盐分平衡能力，珍珠岩吸水、透气，本申请发明人经过多年创造性劳动，进行筛选对比实验，从大量扦插基质中筛选得出马肝土、黄土，泥炭、珍珠岩这四种基质按照3:2:1: I的重量比例结合使用，最适宜蟆叶秋海棠生根存活，各基质间互作互应，达到透气、保湿、固根的效果。既能够快速促进插穗生根，又可促进扦插成活后植株的生长。利用组合基质培养蟆叶秋海棠，能够快速有效的得到大量蟆叶秋海棠，解决其短缺的问题；通过对灭菌、高压静电场处理、基质、激素等操作的优化，能够使得蟆叶秋海棠增殖率达到243. I倍，成活后快速达到种苗规格，能够高效的得到蟆叶秋海棠种苗，大大满足了市场的需求。本发明公开了一种蟆叶秋海棠叶片离体再生体系建立的方法，该方法包括以下步骤(1)选取外植体并进行消毒；(2)将处理后的叶片切割后，进行不定芽诱导培养；(3)高压静电场处理；(4)将叶片诱导的不定芽进行继代增殖培养；(5)对继代增殖培养后的试管苗进行生根培养；(6)扦插生根。采用该繁殖方法对蟆叶秋海棠进行组织培养，一个培养周期(51d)增殖率为243.1倍，繁殖速度快，有效解决了蟆叶秋海棠种苗繁殖的难题。