专利名称：一种利用离体叶片鉴别辣椒耐热性的方法辣椒(Capsicum annuum L.)是典型的“喜温不耐热”植物,超过32°C就会发生热胁迫，引起严重的授粉受精不良和落花落果，坐果率降至10% 20%，导致产量锐减，目前全球气候有明显地变暖趋势，严重影响辣椒的品质和产量，尤其是我国长江以南地区夏季酷热，辣椒在越夏生产中面临着高温胁迫的严峻挑战。 辣椒耐热新品种的选育是防治或减轻其热胁迫危害的有效途径。准确鉴定辣椒的耐热性是研究辣椒热胁迫和提高辣椒耐热性的重要基础。目前，鉴定辣椒耐热性的常用方法有田间鉴定、人工模拟逆境鉴定法，以及逆境生理鉴定法等，其中田间鉴定受环境条件影响很大，结果重演性差，所需时间长，工作量大；人工模拟逆境鉴定法需一定的设施条件，难以大批量进行；逆境生理鉴定是ー种间接鉴定方法，其可靠性较差。上述现有这些鉴定方法费时费力，效率较低，特别是对于ー些可供鉴定样品较少的品系和转基因株系，更是具有很大的局限性。以下是相关的參考文献Cloning and Expression under Heat Stress of A Small Heat Shock ProteinGene CaHSP24 from Pepper. Wei Zhu, Minghui Lu, Zhenhui Gong, and Rugang Chen.African Journal of Biotechnology, 2011, 10(25) :4968_4976。
针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于，提供ー种利用离体叶片鉴别辣椒耐热性的方法，该方法步骤简单快捷、稳定可靠，鉴别结果与田间自然鉴定结果ー致、重复性好，特别适用于株系群体小，以及转基因株系等珍贵辣椒育种品系的耐热性鉴定与遗传分析，能够很好地提高辣椒耐热性筛选效率，加速育种进程。为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案ー种利用离体叶片鉴别辣椒耐热性的方法，其特征在干，该方法利用辣椒7 8叶幼苗期离体带柄功能叶，在人工气候箱中进行耐热性鉴定，通过计算待检某一品系群体的热害指数，井根据创制的群体热害分级标准，能鉴定出辣椒的耐热性。具体步骤如下I)选择辣椒耐热品系B35为耐热对照，辣椒不耐热品系B6作为热敏对照(WeiZhu, Minghui Lu, Znenhui Gong, and Rugang Chen. Cloning and Expression under HeatStress of A Small Heat Shock Protein Gene CaHSP24 from Pepper[J]. AfricanJournal of Biotechnology, 2011，10(25):4968_4976)。2)将耐热性未知的待检辣椒材料种子，以及耐热对照和热敏对照的种子分别经55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4(1种子露白，播于穴盘中。然后将穴盘置于昼夜温光周期条件下进行培养，所述的昼夜温光周期条件为相对湿度50% 70%，光照3000 40001x，白天温度25°C 30°C，16h，夜间温度18°C，8h，培养期间烧Hoagland’ s营养液。3)待幼苗长至7 8片真叶时，选取辣椒子叶上方第4、5、6片生长正常的带柄功能叶作为鉴定其耐热性的样品，每个待检辣椒品系供试离体叶样品10片，重复3次。4)将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中(三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号)。然后，将插有待检样品的三角瓶立即置于38°C的光照培养箱中，光照3000 40001x，连续光照处理60h后，统计热害指数。在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶的叶柄一直浸在水中。 5)按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数0级全叶青绿，无热害症状；I级叶片失水，轻度萎蔫；3级叶片轻度失绿，轻度萎蔫；5级全叶转色为浅黄緑色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；7级全叶转色为黄緑色，叶尖坏死，叶缘翻卷；9级全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷。6)按下式计算热害指数热害指数=E (各级热害指数叶片数X该热害级别值)+ (调查总叶片数X最高级值)X 100。热害指数计算吋，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数。最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性；热吾指数< 35. 0为耐热品系；热害指数在35. I 59. 9为较耐热品系；热害指数彡60. 0为热敏品系。本发明创制的利用离体叶片鉴别辣椒耐热性的方法，主要通过采集植株少量的可再生叶片进行离体高温处理，通过统计热害指数而鉴定出辣椒品系的耐热性。此法稳定可靠，鉴别结果与田间自然鉴定结果一致、重复性好，速度快，省时省力，对植株造成的创伤小，特别是解决了在辣椒珍贵种质资源，以及转基因植株的耐热性鉴定过程中，可供选用的植株少的问题，又能进行鉴定株系留种与后代遗传分析，从而大大提高辣椒耐热育种的进程。图I高温胁迫下不同级别辣椒叶片症状。图中从左到右依次为0级、I级、3级、5级、7级和9级。以下结合附图和实施例对本发明作进ー步的详细说明。
LEE SELN-I和83-2018-2 (均引自亚洲蔬菜发展研究中心)。2.将耐热性未知的待检辣椒材料种子，以及耐热对照和热敏对照的种子分别经55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4(1种子露白，播于穴盘中。然后置于25°C 30°C /18°C，16h/8h，相対湿度50% 70%，光照3000 40001x的昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’s营养液。3.功能叶的采集。待幼苗长至7 8片真叶时，选取辣椒子叶上方第4、5、6片生长正常的带柄功能叶作为鉴定其耐热性的样品，每个待检辣椒品系供试离体叶样品10片，重复3次。4.将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中(三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号)。然后，将插有待检样品的三角瓶立即置于38°C的光照培养箱中，光照3000 40001x，连续高温光照处理60h后，统计热害指数。在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体的辣椒功能叶叶柄一直浸在水中。5.按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数。0级——全叶青绿,无热害症状；I级——叶片失水，轻度萎蔫；3级——叶片轻度失緑，轻度萎蔫；5级——全叶转色为浅黄緑色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；7级——全叶转色为黄緑色，叶尖坏死，叶缘翻卷；9级——全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷。6.按下式计算热害指数热害指数=E (各级热害指数叶片数X该热害级别值)+ (调查总叶片数X最高级值)X 100。在热害指数计算吋，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数。最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性；热吾指数< 35. 0为耐热品系；热害指数在35. I 59. 9为较耐热品系；热害指数彡60. 0为热敏品系。
根据本发明提供的方法，检测结果如下MC4的热害指数=24. 0，为耐热品系；MIT0 LEE SELN-I的热害指数=33. 2，为耐热品系；83-2018-2的热害指数=55. 0，为较耐热品系。这ー结果与田间鉴定结果(MC4的热害指数=18. 2，为耐热品系；MIT0 LEE SELN-I的热害指数=32. 6，为耐热品系；83_2018_2的热害指数=52. 6，为较耐热品系)一致，说明本发明创制的离体叶片鉴定辣椒耐热性的方法能真实反映辣椒田间的耐热性，适用于辣椒的耐热性鉴定。实施例2 I.以辣椒耐热品系B35为耐热对照，以辣椒不耐热品系B6作为热敏对照(WeiZhu, Minghui Lu, Znenhui Gong, and Rugang Chen. Cloning and Expression under HeatStress of A Small Heat Shock Protein Gene CaHSP24 from Pepper[J]. AfricanJournal of Biotechnology, 2011, 10(25) : 4968-4976)，供检测辣椒品系分别为黄元帅 2 号选系、美玉选系、饱子椒和Early Calwonder (简称EC)(均为本领域公知的材料，由申请人 的发明人课题组提供)。2.将耐热性未知的待检辣椒材料种子，以及耐热对照和热敏对照的种子分别经55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4(1种子露白，播于穴盘中。然后置于25°C 30°C /18°C，16h/8h，相対湿度50% 70%，光照3000 40001x的昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’s营养液。3.待幼苗长至7 8片真叶时，选取辣椒子叶上方第4、5、6片生长正常的带柄功能叶作为鉴定其耐热性的样品，每个待检辣椒品系供试离体叶样品10片，重复3次。将采集的辣椒功能叶按待检辣椒品系编号，插入装满蒸馏水的250mL三角瓶中(三角瓶壁上用记号笔标明待检辣椒品系编号)。然后，将插有待检样品的三角瓶立即置于38°C的光照培养箱中，光照3000 40001x，连续高温光照处理60h后，统计热害指数。在鉴定期间，每天检查三角瓶中水位并及时补加蒸馏水，使离体叶叶柄一直浸在水中。5.按照以下辣椒离体叶片耐热性鉴定分级标准统计待检辣椒品系叶片级数。0级——全叶青绿,无热害症状；I级——叶片失水，轻度萎蔫；3级——叶片轻度失緑，轻度萎蔫；5级——全叶转色为浅黄緑色，叶片萎蔫，叶尖部分坏死；7级——全叶转色为黄緑色，叶尖坏死，叶缘翻卷；9级——全叶发黄，叶尖叶缘重度坏死焦枯，叶缘重度翻卷。6.热害指数计算。按下式计算热害指数热害指数=E (各级热害指数叶片数X该热害级别值)+ (调查总叶片数X最高级值)X 100。热害指数计算吋，如重复间差异不显著，取3次重复的平均值；如差异显著，再重复3次，取其3次差异不显著的平均值作为该检测辣椒耐热性品系的热害指数。最后，根据以下群体分级标准确定待测辣椒品系的耐热性；热吾指数< 35. 0为耐热品系；热害指数在35. I 59. 9为较耐热品系；热害指数彡60. 0为热敏品系。
根据本发明提供的方法，检测结果如下黄兀帅2号选系的热咅指数=61. 8,为热敏品系；美玉选系的热咅指数=55. 1，为较耐热品系；饱子椒的热害指数=40. 2,为较耐热品系；EarlyCalwonder的热害指数=38. 0,为较耐热品系。这ー结果与田间鉴定结果(黄元帅2号选系的热害指数=78.0，为热敏品系 ；美玉选系的热咅指数=52. 8,为较耐热品系；饱子椒的热咅指数=37. 6,为较耐热品系；EarlyCalwonder的热害指数=36. 6,为较耐热品系)一致,说明本发明创制的离体叶片鉴定辣椒耐热性的方法能真实反映辣椒田间的耐热性，适用于辣椒的耐热性鉴定。


本发明公开了一种利用离体叶片鉴定辣椒耐热性的方法，包括以辣椒耐热品系B35为耐热对照，以辣椒不耐热品系B6作为热敏对照的选定，辣椒离体叶片的耐热性鉴定方法，离体叶片热害分级标准与群体热害分级标准的制定等，其特征在于，在特定温度和时间处理下的辣椒离体叶片，不同耐热品系间在叶片表观症状上存在明显差异，以此通过计算待检某一品系群体的热害指数，并根据制定的群体热害分级标准，能鉴定出辣椒耐热性品系和热敏性品系。这一方法特别适宜于株系群体小，以及转基因株系等珍贵辣椒育种株系的耐热性鉴定与遗传分析，是一种操作简单、快速、有效鉴定大量辣椒种质资源耐热性的方法，能极大地加快辣椒耐热育种进程。