专利名称：多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法及多态性检测用试剂盒的制作方法多药耐药基因MDRl (ABCBl)为编码各种药剂的转运蛋白的基因，其限定了以地高辛为代表的各种药剂的体内动力学。一般认为，外显子26的第3435位的C置换为T的突变(C3435T突变)存在时， 源自MDRl基因的P糖蛋白的表达量变动，各种药剂的体内动力学改变(例如Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，2000 年，第 97 卷，第 7 号，p. 3473-3478)。已知源自MDRl基因的P糖蛋白的表达量也由于MDRl基因的外显子21的第 2677位的G置换为A或T的突变(G2677A/T突变)而受影响。还已知上述C3435T突变和G2677A/T突变以高频率同时发生。作为C3435T突变的检测方法，已知有以下方法使用为了扩增包含MDRl基因的外显子26的第3435位的碱基的部分而设计的引物进行PCR，用能根据第3435位的碱基中有无突变来区分切断与否的限制性酶进行切断，然后用电泳检测是否切断(PCR-RFIi^i)(例如=Genet. Mol. Res.，2010 年，第 9 卷，第 1 号，p. 34-40)。作为检测C3435突变及G2677A/T突变的方法，已知有下述方法通过PCR-RFLP法检测C3435突变，通过序列分析法检测G2677A/T突变(例如Br. J. Clin. Pharmco 1. ,2005 年、第 59 卷、第 3 号、p. 365-370)。—方面，已知有下述方法在用PCR法扩增包含突变的区域后，使用用荧光染料标记的核酸探针进行解链曲线分析，基于解链曲线分析的结果分析碱基序列的突变(例如 Clin. Chen.，2000 年，第 46 卷，第 5 号，p. 631-635，日本特开 2002-119291 号公报)。已知有使用与上述同样的核酸探针来检测MDRl基因的外显子26中C3435T突变的方法(例如日本特许4454366号公报)。
发明要解决的问题在Genet. Mol. Res.，2010 年，第 9 卷，第 1 号，ρ· 34-40 及 Br. J. Clin. Pharmcol.， 2005年，第59卷，第3号，p. 365-370中记载的PCR-RFLP法中，需要在PCR反应后取出扩增产物并进行限制性酶处理。因此，有时扩增产物有可能混入之后的反应体系中，由此得到假阳性、假阴性的结果。并且，在PCR结束后，用限制性酶进行处理，然后进行电泳，因此，有时到检测出为止所需要的时间也会非常长。另外，由于操作复杂，因此难以自动化。在日本特许4454366号公报中记载的技术中，即使能够检测MDRl基因的外显子26 中的C3435T突变，也无法检测MDRl基因的外显子21中的G2677A/T突变。本发明提供了能够以高灵敏度简便地检测MDRl基因的外显子21中的G2677A/T 突变的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法及药效评价方法以及多态性检测用试齐U盒。用于解决问题的手段用于解决上述问题的具体方法如下所示。<1>MRD1基因的多态性检测用探针，其包含选自包括下述Pl寡核苷酸及P2寡核苷酸的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸，其中，(Pl)寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288 300位的碱基的碱基长为13 68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列，所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记，(P2)寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300 305位的碱基的碱基长为6 93的第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列，所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。<2>如上述<1>所述的多态性检测用探针，其中，上述Pl寡核苷酸在从上述Pl寡核苷酸的3’末端起数第1 3位中的任意位置具有用上述第一荧光染料标记的碱基，上述P2寡核苷酸在从上述P2寡核苷酸的5’末端起数第1 3位中的任意位置具有用上述第二荧光染料标记的碱基。<3>如上述<1>或<2>所述的多态性检测用探针，其中，上述Pl寡核苷酸在上述 Pl寡核苷酸的3’末端具有用上述第一荧光染料标记的碱基，上述P2寡核苷酸在上述P2寡核苷酸的5’末端具有用上述第二荧光染料标记的碱基。<4>如上述<1>至<3>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述荧光标记寡核苷酸与目标序列杂交时的荧光强度比未与目标序列杂交时的荧光强度小或大。<5>如上述<1>至<4>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述荧光标记寡核苷酸与标记的序列杂交时的荧光强度比未与标记的序列杂交时的荧光强度小<6>如上述<1>至<5>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述Pl寡核苷酸的碱基长为13 56，上述P2寡核苷酸的碱基长为6 29。<7>如上述<1>至<6>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述Pl寡核苷酸的碱基长为13 26，上述P2寡核苷酸的碱基长为6 23。<8>如上述<1>至<7>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述Pl寡核苷酸的碱基长为13 21，上述P2寡核苷酸的碱基长为6 18。<9>如上述<1>至<8>中任一项所述的多态性检测用探针，其中，上述探针为用于解链曲线分析的探针。<10>如上述<1>至<9>中任一项所述的多态性检测用探针，所述探针包含下述至少两种荧光标记寡核苷酸，所述至少两种荧光标记寡核苷酸中与序列号2所示的碱基序列的第300位的碱基互补的碱基互不相同且上述互补的碱基为C、T或A。< 11 >MDR1基因的多态性检测方法，其使用上述< 1 >至< 10>中任一项所述的多态性检测用探针。<12>如上述<11>所述的多态性检测方法，包含5(I)使上述<1>至<10>中任一项所述的多态性检测用探针和试样中的单链核酸接触，使上述荧光标记寡核苷酸及上述单链核酸杂交而得到杂交体；(II)通过改变包含上述杂交体的上述试样的温度，使上述杂交体解离，测定基于上述杂交体的解离的荧光信号的变动；(III)基于上述荧光信号的变动，评价杂交体的解离温度的Tm值；和(IV)基于上述Tm值，确认MDRl基因的多态性的存在。<13>如上述<11>或<12>所述的多态性检测方法，还包括得到上述单链核酸的步骤，上述得到单链核酸的步骤包括在上述(1)之前或与(1)同时扩增核酸。<14>如上述<11>至<13>中任一项所述的多态性检测方法，其还包括使能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针与上述试样中的上述单链核酸接触。<15>如上述<14>所述的多态性检测方法，其中，上述能够检测序列号1所示的碱基序列的第256位的碱基的突变的多态性检测用探针为具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始9 50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。<16>药剂的药效评价方法，包括通过上述<11>至<15>中任一项所述的多态性检测方法，检测MDRl基因中的多态性；和基于检测的多态性的有无，对针对源自上述试样的药剂的耐受性或源自上述试样的药剂的药效进行评价。<17>多态性检测用试剂盒，其包含上述<1>至<10>中任一项所述的多态性检测用探针。<18>如上述<17>所述的多态性检测用试剂盒，其还包含能够以序列号2所示的碱基序列中包含与上述Pl或P2寡核苷酸杂交的碱基序列的区域为模板进行扩增的引物。<19>如上述<17>至<18>中任一项所述的多态性检测用试剂盒，其还包含具有与序列号1所示的碱基序列中从第248位的碱基开始的9 50个碱基长的碱基序列互补的碱基序列的荧光标记寡核苷酸。根据本发明，可以提供能够以高灵敏度简便地检测MDRl基因的外显子21中 G2677A/T突变的多态性检测用探针、使用该探针的多态性检测方法以及药效评价方法及多态性检测用试剂盒。

图1 (A)是表示核酸混合物的解链曲线的一个示例的图，以及图1⑶是表示微分解链曲线的一个示例的图；图2(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图2(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图3(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图3(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图4(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图4(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图。图5(A)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图5(B)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图。图6(A)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图；图6(B)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图；图7(A)是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图；图7(B)是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图8是表示本发明的多态性检测用探针和与其不互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图9是表示本发明的多态性检测用探针和与其互补的核酸的微分解链曲线的一个示例的图；图10是表示本发明的多态性检测用探针和包含与其不互补的核酸及互补的核酸的核酸混合物的微分解链曲线的一个示例的图。



本发明涉及多态性检测用探针、多态性检测方法、药效评价方法及多态性检测用试剂盒。具体地，本发明提供了MRD1基因的多态性检测用探针，所述探针包含选自包括下述P1寡核苷酸及P2寡核苷酸的组中的至少一种荧光标记寡核苷酸，(P1)寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第288～300位的碱基的碱基长为13～68的第一碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列，所述寡核苷酸中与第288位的碱基互补的碱基用第一荧光染料标记，(P2)寡核苷酸，其具有与序列号2所示的碱基序列中包含第300～305位的碱基的碱基长为6～93的第二碱基序列互补的序列或与该互补序列同源的序列，所述寡核苷酸中与第305位的碱基互补的碱基用第二荧光染料标记。