专利名称：一种猪病毒基因芯片及其检测方法动物检疫问题一直是国际社会和各国政府关注的热点问题，特别是在我国加入 WTO以后，受技术性贸易措施的影响，国外对我国牲畜产品的卫生质量要求越来越高，要求检测项目越来越多，如致病性细菌、病毒等。同时，为了确保食品卫生质量，保护我国消费者健康安全，必须加强对牲畜产品的安全检测。目前用于猪患传染性病毒的检测的传统方法大致有病毒分离法、电镜观察、聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术、 酶联免疫吸附试验等，上述方法存在较多的缺陷聚合酶链式反应(PCR)方法的优点是灵敏度高，但是通过凝胶电泳对PCR结果进行检测有可能因为非特异扩增导致假阳性判断， 或者有可能引物扩增条带信号很微弱在凝胶电泳上不可见，造成假阴性判断，而对PCR产物进行测序则比较繁琐并且费时。临床上表明猪患传染病常为多种病毒混合感染，而上述的方法检测通量都不高，操作起来费时费力，不利于同时大批量复合致病源的检测。生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展并成熟的一项高新技术，主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，可实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他多种生物成份的准确、快速、大量信息的检测。生物芯片的主要特点是高通量、 微型化和自动化。我国专利“猪常见传染病诊断性基因芯片及其用途”(专利申请号 200410078907.6)中，公开了一种猪常见传染病诊断性基因芯片，所述的基因芯片包括固定在固定载体上的与待测治病病原种类相对应的待测治病病原特征性DNA/cDNA片段，其中采用的特征性片段选自猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖和呼吸综合症病毒原基因特征性片段；所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜；待测样品的标记采用生物素。 该基因芯片每次检测的病毒种类较少，且灵敏度有限，不适用于大规模、高通量的猪病毒检测。所以，病毒检测领域需要提出一种能够同时检测多种猪病毒、灵敏度高的常见猪病毒检测芯片及其检测方法。
本发明提供一种猪病毒基因芯片及其检测方法。所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)。本发明能够同时检测多种常见猪病毒、灵敏度高。本发明是通过以下技术方案实现的一种猪病毒基因芯片，其特征在于所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)。所述的基质载体为经过醛基化处理的玻片。本发明是通过以下另一技术方案实现的一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒 (PCV)、猪细小病毒(PPV);该方法包括的步骤为A、将已经感染上述病毒死亡的猪尸体内的粪便样品进行核酸提取处理，得到待测样品、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；再将所述的扩增产物进行纯化处理，得到纯化的扩增产物；C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。本发明相比现有技术的有益效果为1、本发明能够同时检测古典猪瘟病毒 (CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)，因此检测的病毒种类多样，基本涵盖了常见猪病毒。2、本发明采用随机引物PCR、 多重PCR并进行标记，都是在对病毒核酸进行有效扩增的基础上进行了芯片杂交，相当于进行了测序；因此避免了凝胶电泳对PCR结果进行检测容易导致的假阳性，实现在短时间内高通量的准确检测。3、本发明的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片，因此有利于探针和靶标的结合；且不会给检测带来较大的噪音。图I :实施例2中玻片醛基修饰原理示意图。图2 :实施例2中醛基修饰的玻片表面固定DNA的主要反应原理示意图。图3 :实施例2中醛基修饰的玻片表面固定DNA的副反应原理示意图。图4:实施例2中基因芯片上探针的布局设计示意图。]图5:实施例3中基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图6:实施例3中HCLV杂交结果图。图7:实施例 3中CSFV杂交结果图。图8 实施例3中BVDV杂交结果图。图9 实施例3中PCV I杂交结果图。图10 :实施例3中PRV杂交结果图。图11 :实施例3中PRRSV-I杂交结果。图 12 实施例3中PRRSV-2杂交结果图。图13 实施例3中HCLV调整探针后杂交结果图。 图14 :实施例3中优化的基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图15 :实施例4中基因芯片每个点阵中的探针排列示意图。图16 :实施例4中PRRSV的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图17 :实施例4中CSFV的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图18 实施例4中PCV I的理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图19 :实施例4中的PCV II 理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图20 :实施例4中的PRV理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。图21 :实施例4中的PPV理论杂交图和实际杂交图的对比示意图。一种猪病毒基因芯片，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)。所述的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片。本实施例中的探针名称详见表4、表6、表9,各个探针的核苷酸序列详见表10。一种猪病毒基因芯片检测猪病毒的方法，所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV);该方法包括的步骤为A、将已经感染上述病毒死亡的猪尸体内的粪便样品进行核酸提取处理，得到待测样品；
B、将所述的待测样品进行PCR反应处理，得到扩增产物；再将所述的扩增产物进行纯化处理，得到纯化的扩增产物；C、将所述的纯化的扩增产物进行杂交处理，得到杂交产物；D、将所述的杂交产物进行扫描分析处理，得到检测结果。本实施例中,选取的病毒基本涵盖了常见猪病毒。I、古典猪痕(classical swine fever, CSF)是由古典猪痕病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种猪的高度传染性疾病。此病以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，除可引起败血症以外， 还可引起一系列其它临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸变、慢性营养性消耗及淋巴细胞和血小板减少等。CSFV为RNA病毒，含有单股正链RNA (+ssRNA)的基因组，长约12. 3kb。含有一个开放阅读框(0RF)。它编码一个大的多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主酶的作用， 形成4个成熟的结构蛋白和至少7个非结构蛋白。CSFV病毒粒子的直径为34-50nm，有二十面体对称的核衣壳，内部核心直径约30nm。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜。在蔗糖密度梯度的浮密度为I. 15-1. 168/(^3，等电点是4.8。猪瘟病毒不耐热，56°C 60分钟可被灭活。60°C 10分钟使其完全丧失致病力。猪瘟病毒在pH 5-10稳定，但对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感，迅速丧失感染性。畜牧猪和野猪是古典猪瘟病毒的天然宿主，而且只有它们才是宿主。感染家猪及野猪的血液、分泌物、排泄物和组织均是猪瘟病毒不同的带毒源。已经证实在实验室条件下空气能够传播猪瘟病毒，但这很不容易实现。目前，猪瘟仍然是严重危害全球养猪业的重要传染病，该病流行于除北美和大洋洲外的世界上各大洲和地区。被国际兽疫局(Office of International des E’pizooties , 0IE)列为 16 种 A 类动物传染病之一。也是我国主要的畜禽疫病之一，据统计，我近几年因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8%-10%，其中1/3以上由猪瘟致死，每年直接经济损失有数十亿元，造成了巨大的人力和物力资源浪费。2、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Respiratory and Reproduction Syndrome Virus, PRRSV)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Respiratory and Reproduction Syndrome Virus, PRRSV)引起的一种高度传染性疾病，又称“猪蓝耳病”。该病以怀孕母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪和育肥猪的呼吸道症状为特征。PRRSV为 RNA病毒，其基因组为不分节的单股正链RNA，全长约15kb具有5’帽状结构和3’ poly (A) 尾。含9个开放阅读框，多数相邻的ORF之间存在部分重叠区。ORFl占全长的80%，编码病毒的RNA聚合酶等非结构蛋白，其余编码结构蛋白。PRRSV的病毒粒子呈球形或卵圆形，直径约为45 65 nm，呈20面体对称，囊膜表面有较小纤突，在蔗糖中的浮密度为I. 14 g / mL，在氯化铯梯度中浮密度为I. 19g / cms0 PRRSV对外界环境的抵抗力相对较弱，对脂溶剂、热、低于5或高于7的pH值敏感。PRRSV分两种基因型，分别为欧洲型和美洲型，前者主要流行于欧洲，后者主要流行于美洲和亚太地区，但近来在欧洲也分离到美洲型毒株，在北美分离到类欧洲型的美洲型毒株。我国目前的流行毒株仍属于美洲型。不同的PRRSV毒株对猪的致病力差异很大，而且PRRSV还可引起免疫抑制和持续性感染。1987年该病首发于美国，随后2 3年内迅速在北美和欧洲广泛流行，以后蔓延至亚太地区，造成世界范围的大流行，给世界养猪业造成巨大的经济损失，成为危害当今养猪业的主要疫病之一。我国于 1996年首次从PRRS血清阳性猪群中分离出PRRSV，证实我国也有该病流行。由于没有有效的防治手段，PRRS在国内愈演愈烈，直接和间接造成了 2006年流行我国大部分省份的所谓 “猪无名高热”，又称“猪高热综合症”。据粗略估计在2006年该病导致1000万-3000万头生猪死亡。3、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)
伪狂犬病(Pseudorabies)又称奥捷士奇病(Aujeszky，s disease, AD),是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的自然宿主和贮存者。伪狂犬病可引起多种动物的发热、奇痒及脑脊髓炎等急性致死性感染症状并可引起潜伏性感染，已成为严重危害畜牧业的疾病之一。PRV为 DNA病毒。基因组为线状双链DNA，大小约为150kb，由独特长区段(UL，101. lkb)、独特短区段(US，8. 7kb)以及US两侧的重复序列构成。PRV基因组含有70多个基因，可编码70-100 种蛋白质。PRV呈圆形或椭圆形外观，直径约180nm左右，分子量约9. 5X 106Da，对脂溶剂如乙醚、丙酮、氯仿、酒精等高度敏感，对消毒剂无抵抗力，最适pH为6-8。猪是PRV的贮存宿主，其它家畜如牛、羊、猫、犬，许多野生动物、肉食动物、野生啮齿类动物都易感，实验动物如兔、小鼠人工接种PRV后也能发病。目前许多证据表明，空气传播是其主要传播途径。 自1902年发现以来，伪狂犬病已在全球范围内流行，欧、美、亚、非各洲均已报道有该病的发生，我国于1949年首次报道。该病给全球养猪业造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业的重大传染病之一。4、猪圆环病毒(Porcine circovirus , PCV)猪圆环病毒(Porcine circovirus ，PCV)，PCV分2种血清型，即PCV-I和PCV-2。PCV-I在猪的原代和传代细胞中形成持续感染状态，不表现致细胞病变(CPE)作用，对猪没有致病性，所以通常认为可被动物免疫机制抵抗。PCV-2可引起部分断奶仔猪和育肥猪生长缓慢、消瘦、贫血及黄疸。剖检后可见淋巴结肿大，肝硬变、多灶性黏液性气管炎，间质性肺炎和肾炎，称为断奶仔猪多系统综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。PCV 为 DNA 病毒，基因组为单股环状双向DNA，病毒DNA及其在宿主细胞内复制的中间产物(cDNA)均指导病毒蛋白合成，编码7个潜在的开放阅读框。PCV-I和PCV-2基因组大小分别为1759bpl768 bp。 PCV相同基因型不同毒株间序列同源性大于90%,不同基因型毒株间同源性为68% 79%。 系统发生分析结果表明，PCV-I和PCV-2属于不同基因群，但其基因组仍存在较高的同源性，与病毒复制相关的DNA复制起始区(Ori)和复制酶编码基因(r印)序列同源性分别为79. 5%和82%，衣壳蛋白编码基因(cap)存在较大差异，同源性仅为62%。病毒粒子直径约17 20 nm，二十面体对称，是迄今已知的最小的动物病毒之一。自1991年加拿大首次报道PMWS以来，已有许多国家相继报道此病，。目前，美国、日本、法国、中国等都有该病的报道。PMWS的流行给养猪业造成巨大的经济损失，为此各国进行了广泛深入的研究，证实 PMWS的发生与PCV-2感染密切相关。最近又有报道称PCV-2感染可导致猪发生A2型先天性震颤(congenital tremors type A2)及猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)。5、猪细小病毒(Porcine parvo virus, PPV)猪细小病毒(Porcineparvovirus,PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可引起母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，还可引起仔猪的皮炎和腹泻。成熟的PPV病毒粒子基因组是一条长约5000bp的单股负链DNA，主要有2个开放的阅读框， 编码区内基因相互重叠。PPV基因组在其3’端和5’端分别有两段折叠配对序列，长度约 102bp和127bp，这种二级结构与其它脊椎动物细小病毒DNA十分相似。PPV病毒粒子呈圆形或六边形、无囊膜，直径为20nm，PPV病毒耐热性强，在56°C 30min加热处理后其感染性和凝集红细胞的能力不丧失，在70°C 2h仍不丧失起感染性和血凝活性，到85°C 5min才失活。该病毒对各种消毒剂有很强的抵抗力。对乙醚、氯仿等脂溶剂不敏感，甲醛蒸汽和紫外线也需要很长时间才能杀死病毒。用O. 5%漂白粉或氢氧化钠5min可杀死PPV，而2%戊二醛则需20分钟，3%甲醛需2小时。PPV于1967年在英国首次报道，目前已广泛流行于世界各地。我国于1980年代初开始研究PPV，相关统计资料显示PPV在我国污染非常严重， 部分地区阳性率达90%以上。实施例2:
本实施例为实施例I中基因芯片的制备方法。该方法的步骤如下
A、选择合适的玻片。所述的玻片的应符合以下条件选择光学载玻璃片作为醛基基片制备的原材料，尺寸为长75. 5 mm，宽25. 2 mm，厚I. O mm ;根据大批量的玻璃片测定结果和点样仪对点样基片的要求，要求长宽尺寸误差小于等于正负O. 2 mm，厚度误差小于等于正负O. 05 mm ;同时要求外观无划痕、无缺损。本实施例中选用玻片是因为基因芯片分析对基片表面的要求很高，而表面的制备是一个严格的过程。表面处理的优劣决定了目标分子在其上的固定程度、随后的生化反应效率、检测精确度以及最终数据结论的准确性。一个理想的芯片表面应该是尺寸精确，平滑，平整，均一，耐受性强，荧光惰性，反应效率高和可结合的。用于固定DNA探针的基质载体包括尼龙膜、纤维素膜、玻璃片(玻片)、金属片、硅片、陶瓷片、各种有机高分子制作的薄膜等，其中以玻璃片的应用最为广泛。玻璃片的优点在于来源方便；其表面经过化学处理后，能够共价结合DNA ;玻璃片能耐受高温、高离子溶液环境；玻璃片表面光滑，对液体来说是非浸透性的，故杂交体系的体积可以很小，有利于探针和靶标的结合；玻璃片的背景荧光低，不会给检测带来较大的噪音。本实施例中选用醛基化处理玻片是因为
玻璃片表面要经过化学修饰后，才能牢固地固定DNA。现有的玻璃片表面化学修饰主要有氨基修饰、醛基修饰和巯基修饰。最常用的就是氨基修饰和醛基修饰，二者的比较见表 表1氨基化表面和醛基化表面的比较


本发明提供一种猪病毒基因芯片及其检测方法。所述的基因芯片包括固定在基质载体上的探针，所述的探针为选自以下病毒的特征片段古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)。本发明检测的病毒种类多样，基本涵盖了常见猪病毒；采用随机引物PCR、多重PCR并进行标记，避免了凝胶电泳对PCR结果进行检测容易导致的假阳性，实现在短时间内高通量的准确检测；本发明的基质载体为经过醛基化处理的玻璃片，因此有利于探针和靶标的结合，且不会给检测带来较大的噪音。