专利名称：兔波氏杆菌lamp检测用引物组、检测试剂盒和检测方法兔波氏杆菌病是由波氏杆菌(BordetellabornchispeticEiJb)引起的一种多发性呼吸道疾病，主要引起哺乳仔兔和断乳仔兔的急性死亡，成年兔的鼻炎、支气管炎和脓疱性肺炎等，部分兔场波氏杆菌感染率高达70%。近年来在我省乃至我国各养兔地区波氏杆菌发病日趋严重，是引起家兔呼吸系统疾病的最主要病原，该病病程长，反复发生，难治愈，易造成患兔生长障碍，饲料利用率低，给养兔业带来了很大的经济损失。此外，机体感染该菌后，往往容易继发或并发感染其他细菌和病毒，导致更严重的呼吸道疾病，带来更加严重的损失。并且也可感染人，尤其是免疫力低下的人群。国外对波氏杆菌的研究主要集中在猪， 特别是和多杀性巴氏杆菌混合感染所引起的猪萎缩性鼻炎，而国内对兔的波氏杆菌病的研究多在于该病的普通细菌学方法的诊断和最基本的防治措施。目前，在病原体检测方面主要检测方法有形态学观察、免疫学检测和核酸检测。兔波氏杆菌病的诊断主要还是依靠普通细菌学检测方法，进行各项生化指标的鉴定，动物回归试验等。传统的细菌学诊断方法，繁琐费时，检出率低，且检测工作量大，效率不大。血清学诊断方法主要集中在乳胶凝集试验、微量凝集试验、Dot-ELISA和间接ELISA， ELISA检测方法在敏感性和特异性上都有很大提高，操作相对简单，但存在空窗期、交叉反应等问题。核酸检测是一种较理想的病原学检测方法，PCR及其衍生技术在敏感性及特异性上均表现良好，但这些技术存在仪器昂贵，对操作人员要求高的缺点，在基层和流行病调查前线难以应用。环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification, LAMP)是 Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术，其特点是针对靶基因上的6个特定区域的4 条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、 快速灵敏、高效、操作简便等特点。经过对现有技术的文献检索未发现兔巴氏杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法相关研究报道，因此研制兔巴氏杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法十分必要。
本发明目的在于克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种兔波氏杆菌LAMP检测用弓I物组，本发明的第二个目的是提供兔波氏杆菌LAMP检测试剂盒，本发明的第三个目的是提供兔波氏杆菌LAMP检测方法。本发明的检测方法经过一次简单的恒温扩增，就可以达到快速检测兔波氏杆菌的目的。采用该试剂盒和检测方法具有操作简单、灵敏度高的特点。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案兔波氏杆菌LAMP检测用引物组，引物组包括 外引物组 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物组 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT内引物组 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 内引物组 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案兔波氏杆菌LAMP检测试剂盒，该试剂盒包含如下组分引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液，所述引物组为 外引物组 1 GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物组 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT内引物组 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 内引物组 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。作为优选，所述引物组中外引物组对和内引物组对添加的摩尔比为1 :4 12 作为优选，所述的阳性对照品为含有兔波氏杆菌的基因组DNA。作为优选，所述的反应液中含有0.6 1.8 mmol/L dNTP，1.25 3 mmol/L Mg2+， 0. 2-1. 4mol/L Betaine, 2 X Thermopol Buffer (市售)。作为优选，所述的Bst DNA聚合酶和显色液为市售，显色液优选为STOR Green L为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案 兔波氏杆菌LAMP检测方法，该方法包括以下的步骤1)提供待测样品DNA;2)在LAMP反应体系中加入权利要求1所述的引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶，混勻，进行恒温扩增反应后灭活；
3)取灭活后部分产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余产物加入显色液，观察显色结果， 并同时对比阳性对照品的显色结果，若显色结果一致，说明待测样品中含有兔波氏杆菌，若显色结果不一致，则说明待测样品中不含有兔波氏杆菌。作为优选，所述的恒温反应的温度范围为60_65°C，反应时间为50-60min。最优选，恒温反应的温度范围为61°C，反应时间为50min。作为优选，所述灭活的温度为80°C，灭活时间为lOmin。与现有的技术相比，本发明的有益效果
1、该兔波氏杆菌LAMP方法操作简单，具有良好的特异性，对同种细菌的不同菌株具有广泛的适用性；
2、具有较高的灵敏度，可以检出痕量级的模板兔波氏杆菌最低模板检出量为10拷贝；
3、该快速反应试剂盒反应条件温和，所需仪器简单，扩增快速高效，不到Ih可完成，产率高，与PCR相比更快速、经济。


图1为兔波氏杆菌LAMP检测结果图，其中左-右1000DNA Marker、1 6 临床样品、7:阳性对照、8 阴性对照。

本实施例提供利用LAMP检测兔波氏杆菌的引物组，该引物组由如下外引物对和内引物对组成
外引物组 1: GCTAGTTGGTGGGGTAACG 外引物组 2 TTAGCCCGTGCCGTTTGT
内引物组 1 TAGGAGTCTGGGCCGTGTCGTCCGTAGCTGGTTTGAGAGG 内引物组 2 GGACAATGGGGGCAACCCTGCCTGCCAAAAGTGCTTTCCA。实施例2
本实施例的兔波氏杆菌LAMP检测试剂盒，包括，9个冻存管和说明书。9个冻存管分别为代号冻存管A (4个)装有2XLAMP核心试剂预混物(dNTP、Mg2+、Betaine、 2 X Thermopol Buffer )，冻存管B装有50ul兔波氏杆菌DNA溶液，冻存管C装有LAMP检测体系所用引物混合物，冻存管D装有Bst DNA聚合酶，冻存管F装有显色液优选为STOR Green I，冻存管G装有去离子水。本实施例试剂盒的检测方法，按常规方法提取待测样品基因组DNA，取 μ ，在 LAMP反应体系中加入上述引物组4 ul、LAMP反应液12. 5 Pl、Bst DNA聚合酶1. 5μ1、混勻， 去离子水调至25μ1，6 进行恒温扩增反应，80°C灭活时间为IOmin后，取3μ1灭活产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余液体产物加入显色液，观察显色结果，并同时对比阳性对照品的显色结果，若显色结果一致，而与不加模板阴性样品不一致，则说明待测样品中含有兔波氏杆菌；若显色结果与阳性样品不一致，与阴性样品一致，则说明待测样品中不含有兔波氏杆菌；若待测样品、阳性样品、阴性样品显色结果一致，则需重新检测。试验例
将兔波氏杆菌参考菌株、分离株单克隆接种于2ml增菌肉汤培养基，37°C培养过夜，按常规方法提取DNA，然后进行以下试验
25μ1 兔波氏杆菌 Lamp 反应体系FIP μ (1. 8Mmol/L)、BIP μ (1. 8Mmol/L ) F3 μ (0. 3Mmol/L)、B3 μ (0. 3Mmol/L)、Betaine 5μ1 (0. 4mol/L)、MgS04 1. 5μ1 (2.5mmol/L)、Bst DNA 聚合酶 1· 5μ1 (8υ/μ1)、dNTPl. 5μ1 (1. 2mmol/L) Thermopol Buffer :2. 5μ1,模板 μ , ddH20 补至 25μ1。61°C进行恒温扩增反应，80°C灭活时间为IOmin后，取3ul灭活产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，剩余液体产物加入显色液，观察显色结果，结果显示二者结果一致，对波氏杆菌分离株、阳性对照检测结果为阳性，而没加DNA模板的对照检测结果为阴性。


本发明涉及家畜细菌病的诊断技术领域，尤其涉及用于兔波氏杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法。兔波氏杆菌LAMP检测的引物组，外引物组1如SEQNO1所示，外引物组2如SEQNO2所示，内引物组1如SEQNO3所示，内引物组2如SEQNO4所示。本发明还同时公开了采用上述的引物组的检测试剂盒和检测方法。本发明所建立的兔波氏杆菌LAMP检测方法特异、灵敏、简便快捷，约1h内可完成，能用于基层临床样品的快速检测及波氏杆菌的分子流行病学调查研究。