专利名称：小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒的制作方法2009年，Nature上的一篇社论指出在数以千计的使用细胞系的生物实验室中， 许多实验室并不知道介于1/5-1/3之间的常用细胞系可能已不是原先认为的那样了。过去的25年里，大量的研究，加上美国、英国、德国和日本细胞库的经验发现18-36%的培养物含有错误鉴定的物种或其它细胞类型。就连管理严格的美国国家癌症研究所的细胞库都出现了细胞系遭污染的现象。现在实验室研究人员唯一的办法是给细胞验明正身，使用DNA 指纹图谱(STR分型技术)验证所使用的细胞是否与数据库的数据一致以鉴定身份。Nature 杂志社希望这一身份鉴定工作能持续下去，将主要的无限制增殖的细胞系(癌细胞)鉴定完毕。Nature杂志将会要求投稿人为文章中的所有细胞系提供身份验证。2010 $ 5 月 ATCC SDO (Standards Development Organization)Nature review cancer杂志上发表了题为〈〈Cell line misidentification :the beginning of the end》前瞻性报道。报道指出细胞系作为正常或肿瘤组织的模式细胞被广泛应用于科学研究和药物开发，然而很大一部分的细胞系被错误标记或被其它个体、组织、种系来源的细胞所替代，由于科学界无法解决此类问题以致大量因使用错误鉴定的细胞系而导致误导或存在潜在错误的学术论文发表。通过近年来的努力而开发出的STR分型方法已成为对人源细胞进行鉴定的标准方法，STR分型的应用成为根除细胞错误鉴定这一问题的重要一步。STR位点是由不同数目重复单元组成的重复DNA序列。STR分型的原理为在一单管中同时扩增多个多态性DNA片段。每一个STR位点均能被扩增且扩增产物标记上不同颜色的荧光，使得扩增产物很容易通过片段大小和颜色来区分。STR分型最先应用于亲缘鉴定、法医鉴定、以及鉴定在20年之前的大灾难中遇难的受害者。随后，STR分型用于细胞鉴定中。用STR分型来做细胞鉴定具有其它方法所不具备的优势1.高度丰富信息同时分析多个STR位点，可以建立每个细胞的标准分型图谱，便于不同来源细胞进行比对。2.灵敏度高，能够检测Ing或更低的DNA量，能够检测早期细胞污染。3.分型快速、且结果稳定可靠，易于操作及自动化。许多方法已被用来检测细胞系交叉污染，包括同工酶分析、核型分析、人类白细胞抗原(HLA)分型，免疫分型和DNA指纹识别。这些方法都可以鉴别出某一种细胞系，但是分辨能力各不一样。然而，这些方法在不同实验室所得到的数据却不尽相同，以致没有任何一种方法可以用来建立一个标准参考数据库。由于STR分型具有快速、鉴定的细胞系结果明确等无以伦比的优点，故STR分型的应用价值最大。目前STR分型技术已被广泛应用于人源细胞系的鉴定，并已建立起标准的 STRMarker组合，用于鉴定1000多种细胞。但对于小鼠细胞系的鉴定，由于没有成型的多重STR扩增体系和相关的产品，STR分型并未得到广泛应用。在过去一个世纪的研究中，小鼠已经成为建立人类遗传性疾病的动物模型的最佳实验材料，小鼠细胞系已广泛应用于生命科学研究的各个领域。如在疾病研究和疫苗生产方面常用的小鼠细胞系有A9、3T3、NS-1、J774A. 1、CTLL_2、SC_1等多种，是除了人类细胞外被应用数量最多的动物细胞，数量有几百种。建立小鼠细胞系的STR分型方法，对于每一位使用小鼠细胞系的研究者来说无疑是一个福音，也必将极大地促进人类健康事业的发展。
针对上述领域中的不足和需求，本发明提供一种鉴定小鼠细胞系的复合扩增体系，其扩增的位点是一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，在鉴定小鼠细胞系时，其分型快速、结果准确、操作简单、便于大规模推广，这种方法随着试剂盒开发成功可以批量生产，使用条件可以模式化，全部过程都有自动化设备，不再依赖于人的操作经验，可以实现自动化，所需时间短，整个检测时间需要6小时左右。小鼠短串联重复序列的复合扩增体系，所述扩增体系中同时扩增STR位点 D2Mit395. l、D4Mitl70. l、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6 和 D17Mit51. 1。所述扩增体系中还包括性别决定位点Jaridl。所述扩增体系中的被扩增位点，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为第一组D15Mitl6、DllMit4、D2Mit395. 1 ；第二组D4Mitl70. 1、D7Mit40、 D5Mit201. 1 ；第三组D17Mit51. 1、Jaridl。所述三组中可以分别标记为FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。所述第一组的标记为FAM或荧光素；所述第二组标记为HEX或JOE ；所述第三组标记为TMR或VIC。所述STR位点由一对引物扩增，其中一条引物的5’末端带有标记。所述引物分别为D2Mit395. 1 引物:引物 1 GCCAAAGCTAGGTTTTCTGGTA， 引物 2 TCCAAAGGTACCAAGGCATAAT ；D4Mitl70. 1 引物引物 1 TTCCATCGAGTGACTTGATC，引物 2 CAGAGTGGCTGTCATCTGG ；D5Mit201. 1 引物:引物 1 TAACCTCTCTTAGGCTCGGAT，引物 2 :ACAGTGGAGTTGGACTGTGTT ；D7Mit40 引物引物 1 :GTCAACAGTCAGGAAAGCTG，引物 2 CAGATGCTTGTATTTGCAAAG ；DllMit4 引物引物 1 CAGTGGGTCATCAGTACAGC，引物 2 :AAGCCAGCCCAGTCTTCATA ；D15Mitl6 引物:引物 1 :AGACTCAGAGGGCAAAAT，引物 2 TCGGCTTTTGTCTGTCTG ；D17Mit51. 1 引物引物 1 TCTGCCCTGTAACAGGAG，引物 2 CTTCTGGAATCAGAGGAT ；Jaridl 引物: 引物 1 :GCTGACTACTTCAACATGC，引物 2 CCGCTGCCAAATTCTTTGG ；一种试剂盒，包括一扩增体系，其特征在于包括STR位点D2MU395. 1、 D4Mitl70. 1、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1 的特异性引物对的混合物。用于扩增D2Mit395. 1的引物对是由位于SEQ ID NOl中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID NOl中400 450位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增D4Mitl70. 1的引物对是由位于SEQ ID N02中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N02中170 220位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增D5Mit201. 1的引物对是由位于SEQ ID N03中90 140位18 27个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N03中370 420位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增D7Mit40的引物对是由位于SEQ ID N04中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N04中270 320位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增DllMit4的引物对是由位于SEQ ID N05中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N05中320 370位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增D15Mitl6的引物对是由位于SEQ ID N06中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N06中200 250位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增D17Mit51. 1的引物对是由位于SEQ ID N07中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N07中220 270位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合，用于扩增Jaridl的引物对是由位于SEQ ID N08中70 120位18 25个连续碱基构成的引物，和与SEQ ID N08中290 340位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。优选引物对分别为上述8对引物。所述扩增体系的总体积为20μ1，其中IOX缓冲液2μ1，2.5πιΜ each dNTP 1. 6μ 1，引物对混合物4. 0μ 1，2. 5U Taq酶0. 4 μ 1，去离子水10 μ 1，加入模板DNA为2 μ 1。所述引物对混合物中的引物对浓度分别为0. 3 μ M的D15MU16引物对、0. 2 μ M的 DllMit4 引物对、1. ΟμΜ 的 D2Mit395. 1 引物对、1. ΟμΜ 的 D4Mitl70. 1 引物对、0. 7μΜ 的 D7Mit40 引物对、0. 5μΜ 的 D5Mit201. 1 引物对、0. 7 μ M 的 D17Mit51. 1 引物对和 0. 3 μ M 的 Jaridl引物对。所述扩增体系的扩增条件为94 0C变性，5-10min ；59-61 °C退火，30_60sec ； 70-72°C延伸，30-60sec ；60°C最后延伸，30_60min。经过多年的不断努力，我们目前已筛选出一些可以用来鉴定小鼠细胞系的STR位点，如 DlMitl59. 1、D2Mit395. 1、D4Mitl70. 1、D5Mit201. 1、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、 D17MU51. 1等。本发明选取其中7个具有高度灵敏性及特异性的STR位点(D2MU395. 1、 D4Mitl70. l、D5Mit201. l、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1)对小鼠细胞系进行分型检测。同时，我们加入1个性别决定位点(Jaridl)，建立8个位点的多重复合扩增体系。 本发明的整个方法过程1、引物组合的设计首先，我们选择了具有高度灵敏性及扩增特异性的STR位点，选择的位点包括 D2Mit395. l、D4Mitl70. l、D5Mit201. l、D7Mit40、DllMit4、D15Mitl6、D17Mit51. 1，以及性别决定位点Jaridl。我们从小鼠的基因组数据中筛选了这些STR位点，具有高度多态性，和很强的种属特异性，跟人、豚鼠、大鼠、仓鼠等物种均没有高度同源序列。根据候选的位点所在基因的GeneBank序列号从NCBI核酸数据库下载基因序列，各位点所在基因的部分序列见序列表。用于扩增D2Mit395. 1的引物对是由位于序列1中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列1中400 450位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D4Mitl70. 1的引物对是由位于序列2中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列2中170 220位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D5Mit2011的引物对是由位于序列3中90 140位18 27个连续碱基构成的引物，和与序列3中370 420位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D7MU40位点的引物对是由位于序列4中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列4中270 320位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D11MU4的引物对是由位于序列5中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列5中320 370位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D15MU16的引物对是由位于序列6中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列6中200 250位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增D17Mit51. 1的引物对是由位于序列7中90 140位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列7中220 270位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组合。用于扩增Jaridl的引物对是由位于序列8中70 120位18 25个连续碱基构成的引物，和与序列8中290 340位的互补序列的18 25个连续碱基构成的引物的组
口 O以上引物由Primer3、Primer Premier 5和NCBIBlast等软件设计而成。设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(60士2) °C的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差IOObp以上。设计完成后，用AutoDimer等软件分析引物二聚体和不同引物之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。选用任一小鼠DNA模板，分别用8对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1. 5 2. 0 %的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到8对引物共同的扩增条件。最终要达成的效果是在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。然后，将满足要求的8对引物，分为三组进行荧光标记。每组采用一种荧光素，分别可以是FAM或荧光素、HEX或JOE、TMR或VIC。获得荧光标记引物后，用与之相配对的非荧光引物组合后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3130x1遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。其后，将同一荧光素标记的2对或3对引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3130x1遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率以及此2对或3对引物的混合扩增是否引起非特异扩增。最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将8对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的峰高上)基本一致为准。最终确定的8对引物序列分别见序列表。2.扩增体系及条件的建立2. ITaq酶的选择Taq酶是扩增体系的重要组分，多种Taq酶都满足本发明的需要，如Takara公司的 rTaq 酶和 HS Taq 酶、KAPA Biosystems 公司的 Taq 酶、Roche 公司的 AmpliTaq Gold 酶等均能得到较好的扩增效率和特异性，采用热启动Taq酶比非热启动酶的扩增特异性要好。2. 2Mg2+浓度的选择我们摸索了在不同Mg2+浓度梯度下复合扩增，其中在1. 0-2. OmM的浓度范围内均能得到较好的扩增。2. 3反应体积的选择我们分别采用了 50 μ 1、20 μ 1和10 μ 1体系进行了复合扩增，结果显示20 μ 1与 50 μ 1的体系效果基本相当。2. 4反应程序的优化退火及延伸温度我们摸索了退火温度从55°C到62°C之间各温度下的扩增情况， 结果显示在59-61°C范围内均能得到较好结果。扩增循环数在观-32个有较好的效果。我们摸索了在以下变性、退火及延伸温度下各时间范围内(见表1)的扩增可以得到较好的结果


本发明涉及小鼠短串联重复序列的复合扩增体系及检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明涉及在一个PCR体系中同时扩增多个小鼠的短串联重复序列(D2Mit395.1、D4Mit170.1、D5Mit201.1、D7Mit40、D11Mit4、D15Mit16、D17Mit51.1)及1个性别决定位点(Jarid1)，对小鼠DNA进行复合扩增、毛细管电泳检测。该体系可以用于小鼠细胞的基因分型，由于各个位点采用荧光标记的引物，得到的产物带有荧光标记，可以在遗传分析仪等仪器上进行检测，得到的片段长度更精确，可重复性更高。本体系操作简单、便于大规模推广，全部过程都有自动化设备，整个检测时间只需6小时左右。