专利名称：一种高效的黑穗病孢子侵染甘蔗的方法甘蔗黑穗病是世界上最严重的甘蔗病害之一，加强甘蔗抗黑穗病品种的选育和研究对提高甘蔗产量具有重要的意义。获得高抗甘蔗的黑穗病植株，有利于观察抗性品种在感病期的表现及生理生化指标的科学研究，为抗黑穗病育种研究提供优良的研究样本。因此高效的黑穗病侵染方法显得尤为重要，目前获得足够量的抗病品种的感病植株较为困难，黑粉孢子在不断的进化中形成了不同的生理小种，不同的甘蔗品种对这些黑穗病生理小种有不同的抗性。例如甘蔗品种NCO 376对我国存在的生理小种I和2都存在抗性，获得一定数量的抗病植株具有一定的困难。甘蔗对黑穗病菌的抗性存在形态学抗性和生理 生化抗性，前者主要是由芽鳞对外界病原菌起到一种隔离作用，从而免受外界病原菌侵染(Astiz 1988, Padmanaban et al 1988, Lloyd et al 1983, Robinson 1959);后者存在的最直接证据是芽中生化物质，从甘蔗芽鳞内分离的糖苷类物质能抑制孢子萌发的实验，芽鳞内正二羟酚、总糖、游离氨基酸和糖苷类物质的含量与抗病性的关系等方面也证实了生理生化抗性的存在(Lloyd H L et al 1980, Anon G C et al 1988)。但目前我国对甘蔗黑穗病的侵染主要还是在抗性鉴定水平上，方法主要包括浸溃法、针刺法、真空渗透接种和催芽法等，采用侵染的方法也比较单一，在抗性植株感病材料的获得方面还没有成熟的经验。
本发明的目的是提供一种高效的黑穗病孢子侵染甘蔗的方法，能够提高抗性甘蔗品种的感病率。 本发明包括以下步骤 (I)供试样品浸溃处理。将供试甘蔗样品切成单芽，用清水洗净、消毒处理后，置于温箱中28°C恒温预催芽处理14. 5h，；黑穗病孢子按有效活性菌数制成2 X IO7个孢子/ml的菌悬液，将预催芽的甘蔗置于浓度为2 X IO7个孢子/ml的菌液中浸溃25 min，并不断搅动菌悬液，种植前在28°C的培养箱中保湿20 h。(2)割苗处理。待蔗苗长出15-20cm时，将长出土表的部分割去，然后将新鲜的黑粉孢子涂抹于基部，待分蘖苗长出时进行同样的处理，每株苗处理一次。根据甘蔗品种的抗性差异，不同品种会在45天起陆续发病。此发明为不同抗性水平的甘蔗提供了一种高效的黑穗病菌侵染方法，可为不同试验提供可靠感病材料。该发明的有益效果是建立了高效获得感黑穗病甘蔗的技术，利用高浓度的菌悬液对预催芽的甘蔗进行初次侵染，可解决受芽鳞包裹而降低侵染效率问题，同时利用侵染效率较高的割苗涂菌处理，能再次加强侵染几率，从而降低因生理生化抗性带来的干扰，提高中抗、高抗黑穗病甘蔗的侵染率，为各种甘蔗黑穗病实验研究提供充足的实验材料，确保实验的顺利进行。本发明通过不同侵染方法的实验，证明割苗涂抹黑粉孢子的侵染率能够达到25. 8%，是侵染方法中较为有效的一种，通过国内外不同侵染方法的侵染效率分析，不同的方法感病率差别很大。本发明通过试验和方法的创新，建立了高效的黑穗病孢子侵染甘蔗技术体系，能够为抗黑穗病甘蔗感病材料的获得和抗黑穗病研究提供有力的技术支撑。图I为本发明的黑穗病孢子侵染甘蔗的流程图。
(I)供试样品浸溃处理。将健康的甘蔗样品(例如抗性品种NC0376)通过恒温水浴锅进行温水脱毒，保持样品不带黑穗病菌，然后切成10 cm左右的单芽，用清水洗净，后用杀菌剂进行消毒处理，再用报纸包裹起来，置于温箱中28°C恒温处理14. 5 h，进行预催芽，确保芽鳞包裹的嫩芽露出；将采集的黑穗病孢子(不分生理小种)进行适当的晾晒之后，取适量孢子在显微镜下进行镜检，利用显微计数法计算孢子活性比率，然后按有效活性菌数制成
2X IO7个孢子/ml的混合黑穗病孢子菌悬液。(2)割苗处理。将预催芽的甘蔗材料浸泡在浓度为2X IO7个孢子/ml的菌液中浸溃25 min，并不断搅动菌悬液，让甘蔗萌动的芽充分接触黑粉孢子，种植前在28°C的培养箱中保湿20 h，然后种植于桶中，待蔗苗长出15-20 cm时，将长出土表的部分割去，然后将新鲜的黑粉孢子涂抹于下部，待分蘖苗长出时进行同样的处理，每株苗处理一次。根据甘蔗品种的抗性差异，不同品种会在45天起陆续发病，高抗品种NC0376在最后的发病率在30%以上。此发明为不同抗性水平的甘蔗提供了一种高效的黑穗病侵染方法，为各种甘蔗黑穗病实验研究提供充足的实验材料。


本发明提供一种黑穗病孢子侵染甘蔗的方法，将甘蔗样品切成10cm的单芽，洗净后用杀菌剂消毒，报纸包裹后置于温箱中280C处理14.5h；取适当晾晒的黑粉孢子在显微镜下计算孢子活性比率，然后制成2×107个孢子/ml的菌液浓度。将预催芽的甘蔗在2×107个孢子/ml的菌液中浸泡25min，并搅动菌悬液，种植前在28℃保湿20h，待蔗苗长出15-20cm时，割去土表部分，将新鲜的黑粉孢子涂抹于下部，待分蘖苗长出时进行同样处理，每株苗处理一次。不同品种在45天起陆续发病。此发明为获得不同抗性的感黑穗病甘蔗提供了一种高效的侵染方法，可为不同试验提供材料。