专利名称：以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料的制作方法一、所属领域本发明涉及医学临床应用的一种骨修复材料，特别涉及一种用于临床骨折、骨不连、骨缺损、骨质疏松等疾病，并可用于兽医学的以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料。本发明的构思是，采用哺乳动物血液为原料提取纤维蛋白原，并通过凝血酶作用使之在应用时转化为纤维蛋白凝块。将纤维蛋白凝块作为骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的缓释载体，利用上述生物因子的骨诱导作用和促进创伤修复作用治疗骨折、骨不连、骨缺损及骨质疏松症等。本发明采取的技术方案是以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，其特征在于，按以下方法制备1)无菌取猪、牛等哺乳动物抗凝血，分离血浆后以低温离心法提取纤维蛋白原，冻干制成海绵状纤维蛋白原为本系统的第一部分；2)凝血酶中加入一定剂量的重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子组成本系统的第二部分。3)第一部分以双蒸水为溶剂，使用前配成悬液；其中纤维蛋白的浓度为70mg/ml～110mg/ml；4)第二部分以40mM/L的氯化钙为溶剂，凝血酶的浓度为500IU/ml，重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的浓度分别为5μg/ml～20μg/ml、5mg/ml和1mg/ml。本发明的另一特点是，所述重组人骨形态发生蛋白是基因工程表达的BMP-2、BMP-4或BMP-7以及它们的混合物。本发明利用纤维蛋白在和凝血酶作用前可溶解于液体的特点制成注射剂，因而不仅可用于需要手术治疗的骨不连、骨缺损患者，还可以使用普通注射器经皮直接注射，因而可用于闭合性骨折、骨质疏松症等不需要手术的病例。具有临床使用范围广泛、操作简便、治疗效果确切等优点。三种生物因子通过基因工程学方法生产，均为水容性，纯度高，生物活性好。纤维蛋白为生物性材料，因此生物相容性好，可以在短时间内被完全吸收。随着载体的吸收降解，骨形态发生蛋白等生物因子缓慢释放出来，可以在创伤修复的全过程充分发挥其生物学作用。研究表明，纤维蛋白免疫原性很低，植入体内后无不良反应。由于取材于猪、牛等哺乳动物血液，因而不仅来源广泛，成本低，而且还避免了传播肝炎、艾滋病等通过血液传播的疾病。液态的纤维蛋白溶液与溶解有生物因子的凝血酶混合后，在体内迅速固化，并可以任意塑型成损伤部位的形状，使新骨形状完全恢复原由的生理形状，对于肢体功能的恢复有重要意义。同时，纤维蛋白的止血、粘接作用有利于防治局部血肿的形成，加速软组织愈合，为骨的再生和愈合提供良好的局部环境。 以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1按照本发明的技术方案，以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，按以下方法制备1)无菌取猪、牛等哺乳动物抗凝血，分离血浆后以低温离心法提取纤维蛋白原，冻干制成海绵状纤维蛋白原为本系统的第一部分；2)凝血酶中加入一定剂量的重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子组成本系统的第二部分。
3)第一部分以双蒸水为溶剂，使用前配成悬液；其中纤维蛋白的浓度为70mg/ml；4)第二部分以40mM/L的氯化钙为溶剂，凝血酶的浓度为500IU/ml，重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的浓度分别为20μg/ml、5mg/ml和1mg/ml。
重组人骨形态发生蛋白是基因工程表达的BMP-4。
实施例2按照本发明的技术方案，以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，按以下方法制备1)无菌取猪、牛等哺乳动物抗凝血，分离血浆后以低温离心法提取纤维蛋白原，冻干制成海绵状纤维蛋白原为本系统的第一部分；2)凝血酶中加入一定剂量的重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子组成本系统的第二部分。
3)第一部分以双蒸水为溶剂，使用前配成悬液；其中纤维蛋白的浓度为110mg/ml；4)第二部分以40mM/L的氯化钙为溶剂，凝血酶的浓度为500IU/ml，重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的浓度分别为10μg/ml、5mg/ml和1mg/ml。
重组人骨形态发生蛋白是基因工程表达的BMP-2。
实施例3按照本发明的技术方案，以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，按以下方法制备1)无菌取猪、牛等哺乳动物抗凝血，分离血浆后以低温离心法提取纤维蛋白原，冻干制成海绵状纤维蛋白原为本系统的第一部分；2)凝血酶中加入一定剂量的重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子组成本系统的第二部分。
3)第一部分以双蒸水为溶剂，使用前配成悬液；其中纤维蛋白的浓度为90mg/ml；4)第二部分以40mM/L的氯化钙为溶剂，凝血酶的浓度为500IU/ml，重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的浓度分别为5μg/ml、5mg/ml和1mg/ml。
重组人骨形态发生蛋白是基因工程表达的BMP-7。
实施例4按照本发明的技术方案，以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料，按以下方法制备1)无菌取猪、牛等哺乳动物抗凝血，分离血浆后以低温离心法提取纤维蛋白原，冻干制成海绵状纤维蛋白原为本系统的第一部分；2)凝血酶中加入一定剂量的重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子组成本系统的第二部分。
3)第一部分以双蒸水为溶剂，使用前配成悬液；其中纤维蛋白的浓度为110mg/ml；
4)第二部分以40mM/L的氯化钙为溶剂，凝血酶的浓度为500IU/ml，重组人骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子的浓度分别为15μg/ml、5mg/ml和1mg/ml。
重组人骨形态发生蛋白是基因工程表达的BMP-2、BMP-4、BMP-7的混合物。
具体实例1桡骨远端闭合性骨折(克氏骨折)，或不伴有血管神经伤的肱骨、股骨、胫腓骨闭合性骨折，因无手术指征可采取保守治疗。用本修复材料治疗过程如下手法牵引复位，在电视X光机透视下观察骨折端对位满意，取本材料5～10ml，透视下经皮注射到骨折断端。石膏固定4～6周，骨折愈合良好。表明本材料能有效地加快骨折愈合速度，改善新骨质量，预防骨延迟愈合或骨不连的发生。
具体实例2四肢长骨伴有碎片(或碟形块)的开放性骨折，手术复位并采取适当的方式固定骨折，用本材料均匀喷涂于骨折断端，将碎骨片放回到原来的解剖位置，常规方法关闭伤口。在此类创伤治疗中，本材料不仅能够促进骨折愈合，还能发挥其粘合作用使骨折碎片与骨干粘接在一起，对于完整地恢复骨骼原有形状、预防骨缺损和骨不连发生有很好的效果。
本发明主要以注射方式使用，采用双筒注射器。使用前将等体积的第一和第二部分分别加入双筒注射器的两个筒内，外接专用针头，可以经皮注射，也可以手术中使用。
本发明的优点是促进骨修复，加速骨形成和骨愈合效果确切；使用简便，适应症广泛；组织相容性好，安全可靠。
本发明在骨科、神经外科、胸外科、颌面外科等医学领域以及用于家畜、畜牧业、观赏动物、保护动物的治疗等兽医学方面的应用有较广阔的前景。


本发明公开了一种以动物纤维蛋白为载体的注射型多种生物因子复合骨修复材料,广泛适用于骨折、骨不连、骨缺损及骨质疏松症等的治疗,它是以哺乳动物血液中纤维蛋白为载体,将基因重组骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和β转化生长因子用于损伤局部,随着载体的吸收降解,骨形态发生蛋白等生物因子缓慢释放出来,在体内迅速固化,并可以任意塑型成损伤部位的形状,使新骨形状完全恢复原由的生理形状,实现促进新骨生长、加速创伤修复和促进骨折愈合的作用。本发明经动物实验和临床试验证实,治疗效果确切,适用范围广泛,操作简便,安全可靠。