专利名称：止血海绵的制作方法人们很早就知道基于人或者动物来源的凝血因子的生物胶。美国专利4，362，567、美国专利4，298，598和美国专利4，377，572已经描述了用于基于纤维蛋白原和凝血因子XIII的生产组织粘结剂的方法。这种组织粘结剂通常和含凝血酶的单独成分一起应用，凝血酶对纤维蛋白原有酶促 作用以便形成纤维蛋白，对凝血因子XIII有酶促作用以便形成活性因子Xllla，该活性因子XIIIa可与纤维蛋白交联以便得到稳定的纤维蛋白凝块。胶原垫已经使用了很多年，以便改进伤口愈合或者终止流血。它们在止血中的作用机制是基于血小板凝集和活化，在活化的血小板表面上形成凝血酶，并且通过凝血酶在纤维蛋白原上的催化作用而形成止血纤维蛋白凝块。为了改进胶原垫或者胶原片的止血作用，建议在这种胶原垫内部包含止血因子。在美国专利4，600, 574中，描述了一种基于与纤维蛋白原和凝血因子XIII结合的胶原的组织粘结剂。此物质是以冻干的形式备用。通过用含纤维蛋白原和凝血因子XIII的溶液浸透胶原扁平材料，并且冻干所述材料，使纤维蛋白原和凝血因子XIII与胶原相结口 OW097/37694公开一种基于胶原和均匀分布其中的凝血活化剂或者活化剂前体的止血海绵。该海绵以干燥形式提供，可以是空气干燥的或者冻干的。但是，它的含水率至少是 2 。美国专利5，614，587论述了含交联胶原(其通过使用多官能地活化的合成亲水聚合物进行交联)的生物粘结剂组合物，以及使用这种组合物以使第一表面和第二表面之间发生粘结的方法，其中第一和第二表面中的至少一个可以是天然组织表面。美国专利5，428，024、美国专利5，352，715和美国专利5，204，382描述了含胶原的组合物被机械破坏，以便改变它们的物理性能。这些专利通常涉及纤维状的和不溶性的胶原。美国专利4，803，075描述了可注射的胶原组合物。美国专利5，516，532描述了可注射的骨/软骨组合物。W096/39159描述了一种基于胶原的传递基质，该传递基质包含的干燥颗粒的尺寸的范围是5 y m至850 y m，该颗粒可以悬浮在水中并且具有特定的表面电荷密度。美国专利5，196，185描述了一种粒径是Iiim至50 iim的胶原制品，用作气溶胶喷雾剂以便形成伤口敷料。描述胶原组合物的其它专利包括美国专利5，672，336和美国专利5，356，614。
本发明的主题涉及一种止血多孔复合海绵，其包含生物材料基质和用于增强所述海绵对于被施用组织的粘附性的材料，施用时所述海绵的至少一个表面牢固地与所述被施用组织相连接，其中所述材料基本上不含水凝胶形成成分。人们已经发现，以前的用于伤口愈合的纤维状生物材料衬垫，尤其是胶原衬垫，在止血减损(impaired hemostasis)的状况下(例如在肝素化后)不能诱导止血。本发明的海绵可改善止血性。人们进一步发现，如果另一种材料存在于生物基质材料的表面上作为活性止血层，则该层趋向于不稳定，因为所述另一种材料倾向于与海绵相分离，特别是在将海绵施用于组织上期间、并且当被调节成所述组织的几何形状时。人们还发现，缺少其他水凝胶形成成分比如颗粒材料、例如明胶颗粒时，会有有利的特性，特别是就海绵总体而言具有较低的膨胀性质。本发明的海绵可以 克服这些缺陷。本发明的另一个方面涉及一种制造止血多孔海绵的方法，该方法包括a)提供一种具有生物材料基质的多孔海绵，b)提供一种用于增强所述海绵对于被施用组织的粘附性的材料，该材料呈悬浮液、溶液或者粉末形式，其中所述材料基本上不含水凝胶形成成分，c)使得步骤a)的多孔海绵与步骤b)的材料相接触，以使得b)的材料牢固地与所述海绵的至少一个面相连接，从而得到止血复合海绵，任选地d)对步骤c)中获得的复合海绵进行干燥，任选地e)对在步骤c)或d)中获得的所述复合海绵进行灭菌。本发明的另一个方面涉及一种处理损伤的方法，包括将止血多孔复合海绵给药至损伤位点。本发明还提供一种用于制备伤口敷层的试剂盒，其包含在此公开的海绵和药物活性物质。该试剂盒及其组分尤其可用于制造用于处理损伤的医用海绵。本领域的技术人员会容易地理解，下面所公开的优选的实施方式是具体的实施方式的例子，并不是必要地限制本发明的一般构思。此外，如果不是互相排斥的情况，所有具体的实施方式可以从任何组合的所有发明方面和实施方式上理解。本领域的技术人员认为的所有等同的或者显而易见的改变或变型都包括在本发明中。干燥可以包括冷冻干燥或者空气干燥，并且包括除去液体中的挥发性组分。在另一个方面，本发明提供了一种可通过如上所述根据本发明的方法获得的止血多孔海绵。如上所述止血海绵的所有优选实施方式还可以适用于该可获得的海绵。本发明还提供了一种处理损伤的方法，包括施用止血多孔复合海绵，所述海绵包含生物材料基质和用于增强所述海绵对于被施用组织的粘附性的材料。损伤可以包含伤口、出血、受损组织和/或出血组织。

图I至4显示了根据实施例1(图1)、4( 图2)、5(图3)和6(图4)制备的海绵在实施例10中描述的动物模型中的止血性能。以下通过实施例进一步例举本发明，但并不限制本发明。使用下面的缩写
COHl02 季戊四醇聚(乙二醇)醚四琥珀酰亚胺戊二酸酯
COH206 季戊四醇聚(乙二醇)醚四硫醇
EtOH 乙醇
PEG 聚乙二醇
PET 聚对苯二甲酸乙二醇酯
实施例实施例I :用两种反应性PEG的酸性溶液处理的胶原海绵制备出PEG 浓度(C0H102 和 C0H206 为 I : I)为 10mg/cm3、35mg/cm3、70mg/cm3 和100mg/cm3的C0H102和C0H206的酸性水溶液(pH 3. 0，HCl)，并且装入9x7cm的PET托盘中。将市售的与此前填充了 PEG溶液的托盘体积相同的9x7cm牛胶原海绵(Matristypt )置于溶液的顶部。在吸收PEG溶液后,胶原材料被冻干。在冻干后，干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进一步进行Y-灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。实施例2 :用两种反应性PEG的EtOH溶液处理的胶原海绵将C0H102和C0H206溶于完全干燥的EtOH中。制备出PEG浓度(C0H102和C0H206为I : I)为10mg/cm3、35mg/cm3、70mg/cm3和100mg/cm3的溶液，并且将所述溶液装入9x7cm的PET托盘中。将市售的与此前填充了 PEG溶液的托盘体积相同的9x7cm牛胶原海绵(Matristypt )置于溶液的顶部。在吸收PEG溶液后，胶原材料在真空箱中被干燥。干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。 实施例3 :胶原/反应性PEG构造物的制备制备出22ml含有不同牛真皮胶原浓度(2. 15mg/cm3>4. 3mg/cm3和7. 2mg/cm3)和PEG (C0H102 和 C0H206 为 I : I)浓度(7. 2mg/cm3、14. 3mg/cm3、28. 6mg/cm3 和 57. 3mg/cm3)的酸性水溶液(pH 3. 0，HCl)，装入9x7cm的PET托盘中，并且冻干。
干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。实施例4 :双层胶原/反应性PEG构造物的制备Ilml和22ml在实施例3中描述的胶原/PEG酸性溶液(pH 3. 0，HCl)被装入PET托盘中，并且立即在_20°C下冷冻。在冰相的顶部，施加Ilml或者22ml的I %牛真皮胶原溶液，pH 3. 0 (HCl)，并且获得的构造物被冻干。干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。
实施例5 :用反应性PEG均匀涂覆胶原海绵将C0H102和C0H206的I : I粉末混合物均匀地分布到市售胶原海绵、或者按照实施例1、2、3和4中之一描述的方法制备的海绵的一个表面上。含量为2mg/cm3、7mg/cm3、IOmg/cm3、14mg/cm3和20mg/cm3的PEG被用于涂敷。PEG粉末混合物例如通过熔化、比如通过将海绵与PEG粉末混合物一起置入60至65°C预热的烘箱中保持4分钟而被固定在海绵的表面上。干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。实施例6 :用反应性PEG不连续地涂覆胶原海绵按照在实施例5中描述的方法制备衬垫，不同之处在于，在涂敷之前将网格放置到胶原海绵的表面上，以使得衬垫的表面被部分地遮蔽、并且部分地不被PEG粉体覆盖。筛孔尺寸为5mm和IOmm的网格模具被使用，并且在粉末分布之后被除去。按照在实施例5中描述的方法进行粉体的固定、包装和灭菌。这些模型允许血液更好地渗透入胶原衬垫，其中由于胶原的促凝血活性而发生凝血。反应性PEG保障了衬垫对于伤口表面的粘附性。实施例7 :具有交联PEG的胶原构造物的制备a)用市售的喷雾施加器在牛胶原海绵上面喷雾反应性PEG(C0H102和C0H206为I 1)，所述喷雾施加器由两重注射器和气驱喷头(Duplospray，百特)组成。一个注射器含有pH 3. 0的C0H102和C0H206，第二个注射器含有pH 9. 4的缓冲液。两种PEG成分的聚合作用在沉积后即刻发生在胶原的表面上。海绵可以在真空箱中干燥。b)按照在实施例I中描述的方法用酸性PEG溶液处理胶原海绵。为了启动在两个PEG成分和胶原基质之间的交联反应，湿海锦用碱性缓冲体系处理，然后可以被冻干。实施例8 :用反应性PEG连续涂敷壳聚糖/明胶海绵将I : I的C0H102和C0H206粉末混合物均匀地分布到市售壳聚糖/明胶(Chitoskin , Beese Medical)海绵的一个表面上。含量为14mg/cm3的PEG被用于涂敷。PEG粉末混合物例如通过熔化、比如通过将海绵与PEG粉末混合物一起置入60至65°C预热的供箱中保持4分钟而被固定在海绵的表面上。干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。实施例9 :用反应性PEG涂敷氧化纤维素织物将I : I的C0H102和C0H206粉末混合物均匀地分布到市售氧化纤维素织物(Traumstem , Bioster)的一个表面上。含量为14mg/cm3的PEG被用于涂敷。PEG粉末混合物例如通过熔化、比如通过将海绵与PEG粉末混合物一起置于60至65°C预热的烘箱中保持4分钟而被固定在海绵的表面上。干燥后的海绵可以与干燥剂一起被包装在不渗透水蒸气的袋中，并且可以进行Y灭菌，例如用25kGray的、射线灭菌。实施例10 :临床前的应用
在肝脏磨损模型的肝素化猪(I. 5倍ACT)中，对根据上述实施例制备的海绵进行测试。使用旋转研磨机，在肝叶的表面上产生直径I. 8cm的圆形流血伤口。施用3x 3cm的海绵，并且用一片浸了盐水缓冲液的纱布适度地压在伤口上保持2分钟。在除去纱布后，取得了较好的止血性能，如图I至4所示。


本发明提供了一种止血复合海绵，其包含生物材料多孔基质和用于增强所述海绵对于被施用组织的粘附性的材料，施用时所述海绵的至少一个表面牢固地与所述被施用组织相连接；还提供了一种生产这些海绵的方法、以及它们在止血中的用途。