专利名称：一种从海绵细胞分离能产生生物活性物质微生物的方法海绵是最原始、最低等的多细胞动物，无组织无器官分化，是地球生命起源与进化的独立分支，是海洋中的无脊椎动物。国内外多年来的研究表明，海绵中超过10％的次生代谢产物都有细胞毒性，为生物活性物质，而在海洋的其他海洋生物中这一比例只有2％，在陆地上的植物和微生物则远低于1％。因此，海绵中活性物质的研究，受到世界各国科学家的重视。但到目前为止，海绵能产生活性物质的机制还不清楚，是否与海绵细胞中共生存的微生物有关，至今也没有结论，这种机制是十分复杂的。据初步估计，在海绵细胞中的共生存的微生物约占海绵体积的40％，美国马里兰大学发现海绵中存在复杂的微生物类群，海绵中的抗癌活性物质是由其共生存的微生物所产生，并从海绵中分离得到一株亮桔色微球菌可以发酵产生与海绵中一样的活性物质(Diketopiperagines)。Althoff等人对DNA的研究还确定了Rhodobacter和海绵Halichondria panicea的共生存关系。另外，中国科学院沈阳应用生态研究所已从渤海膜海绵细胞中获得多株产农用抗菌素及抗肿瘤先导化合物等活性物质的微生物菌株。目前，如何从海绵细胞中能分离纯化得到其共生的微生物、产生活性物质的海绵微生物，并利用这些宝贵资源，研究海洋微生物制药，农用抗菌素等等，已成为国内外关注的焦点，目前采用传统常规分离方法，不加陈海水、海绵，只能得到少部分海绵细胞中的微生物，不能获得海绵生态系统中微生物多样性的属种群落。至今国内外尚没有一个理想的分离海绵细胞中微生物的方法的报道。
本发明的目的在于提供一种从海绵细胞中分离能产生生物活性物质微生物的方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为可按如下步骤操作(1)从海洋中选取健康的、活的海绵有机体(选取健康的、活的、无病虫害的)，在无菌条件下清洗，取海绵内部细胞体切成1～5mm小块，研磨3～5分钟，获得新鲜海绵细胞提取液；；所述清洗采用酒精或无菌生理盐水；(2)对新鲜海绵细胞提取液，采用平板稀释法，分别以10-1～10-7浓度稀释液，在均添加有0.005～0.05％海绵的分离海洋真菌、细菌或放线菌培养基的平皿上，涂刮平板，然后放入到25～30℃保温箱中培养；(3)培养1～15天后，对平皿长出单菌落纯的(生长一致的)微生物移至斜面保藏，以备进行次生代谢产物生物活性的鉴定，鉴定方法采用常规技术；所述次生代谢产物生物活性的鉴定是在实验室条件下对是其否产生抗癌、抗肿瘤、抗菌等生物活性物质进行检测验证；所述用于分离海绵细胞中真菌的平板稀释液浓度为10-2～10-3；所述用于分离海绵细胞中细菌的平板稀释液浓度为10-5～10-7；所述用于分离海绵细胞中放线菌的平板稀释液浓度为10-1～10-2；其中稀释所用溶液为无菌水；按重量百分比计，所述分离海绵细胞中真菌的培养基成分为葡萄糖1％、可溶性淀粉0.5～2.0％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、蛋白胨0.5～1.0％、海绵0.005～0.05％、琼脂2％、余量为陈海水或人工海水，pH6.0～6.5；每1000ml所述培养基中，灭菌消毒前加入1％孟加拉红(RoseBengal)水溶液3.3ml；当融化培养基倒在平板上临用时每100ml培养基中加入0.5～2％链霉素溶液0.1～1.0ml，及环丙沙星100～500μl；按重量百分比计，分离海绵细胞中细菌的培养基成分为可溶性淀粉0.5～2.0％、牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％、海绵0.005～0.05％、琼脂2％、余量为陈海水或人工海水，pH7.0～7.2；按重量百分比计，分离海绵细胞中放线菌的培养基成分为可溶性淀粉0.5～2.0％、蔗糖0.1～1.0％、甘露醇0.5％、KNO30.1％、K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.5％、FeSO4·7H2O 0.01％、海绵0.005～0.05％、琼脂2％、余量为陈海水或人工海水，pH7.0～7.4；临用时，在已加热融化的300ml所述培养基中加入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星100～500μl。本发明具有如下有益效果1.应用本发明从海绵细胞中分离产生物活性物质微生物的方法，在分离培养基中均添加了海绵0.005～0.05％，分离效果很好，并且在分离真菌时添加孟加拉红和链霉素，放线菌时添加重铬酸钾、链霉素及环丙沙星，所以平均成功率在90％以上。2.本发明操作简单，能得到所需的菌株。下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1从海绵细胞中分离产生生物活性物质真菌的方法可按照以下步骤操作(1)从海洋中选取健康的活的海绵有机体后立即进行清洗，采用酒精对海绵外表进行消毒；用无菌技术，切去海绵体外层，取海绵内部细胞体切成1～5mm见方小块，用无菌石英砂研磨，在无菌研碎加入无菌生理盐水(NaCl 0.85％)，研磨5分钟，获得新鲜海绵细胞提取液；(2)对新鲜海绵细胞提取液，采用平板稀释法，分别以10-2、10-3浓度稀释液，在下列分离海绵真菌培养基的平皿上涂平板，涂完放25℃保温箱中培养；(3)培养1周后挑单菌落分纯，而后移殖至斜面上保存，进行次生代谢产物生物活性的鉴定；所述次生代谢产物生物活性的鉴定是在实验室条件下其是否产生抗癌、抗肿瘤、抗菌等生物活性物质进行检测验证；分离海绵真菌培养基按重量百分比其成分如下葡萄糖1％、可溶性淀粉1％、KH2PO40.1％、MgSO4·7H2O 0.1％、蛋白胨0.5％、海绵0.05％、琼脂2％、余量为陈海水，pH6.0；所述陈海水为静置一段时间的海水；每1000ml此培养基中，灭菌消毒前加入1％Rose Bengal水溶液3.3ml；当融化培养基倒在平板上，临用时每100ml培养基中加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星300μl。
本实施例分离海绵细胞中真菌的成功率为90％以上。
实施例2与实施例1不同之处在于对新鲜海绵细胞提取液，用平板稀释法，分别以10-5、10-6、10-7浓度稀释液，在下列分离海绵细菌培养基的平皿上涂平板，涂完放28℃保温箱中培养3天，挑单菌落分纯，而后移殖至斜面上保存，进行次生代谢产物生物活性的鉴定。
分离海绵细菌培养基按重量百分比其组成如下可溶性淀粉1％、牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％、海绵0.01％、琼脂2％、余量为陈海水，pH7.0。
本实施例分离海绵细胞中细菌的成功率为95％以上。
实施例3与实施例1不同之处在于从海洋中选取健康的活的海绵有机体后，采用生理盐水对海绵外表进行消毒；对新鲜海绵细胞提取液，用平板稀释法，分别以10-1、10-2浓度稀释液，在下列分离海绵放线菌培养基的平皿上涂平板，涂完放30℃保温箱中培养2周后，挑单菌落分纯，而后移殖至斜面上保存，进行次生代谢产物生物活性的鉴定。
分离海绵放线菌培养基按重量百分比其组成如下可溶性淀粉1％、蔗糖0.5％、甘露醇0.5％、KNO30.1％、K2HPO40.5％、MgSO4·7H2O 0.01％、FeSO4·7H2O 0.01％、海绵0.01％、琼脂2％、余量为陈海水，pH7.0～7.2；临用时，在已加热融化的300ml培养基中加入3％重铬酸钾溶液1ml，再加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星500μl。
本实施例分离海绵细胞中放线菌的成功率为70％以上。
本发明所述陈海水也可用人工海水替代。


本发明涉及一种从海绵细胞中分离能产生生物活性物质微生物的方法，即从海洋中最原始多细胞动物海绵的细胞中分离能产生较高含量的抗癌、抗肿瘤、抗菌等生物活性物质微生物的方法。具体操作(1)从海洋中选取健康的、活的海绵有机体，在无菌条件下清洗，取海绵内部细胞体切成小块，研磨，获得新鲜海绵细胞提取液；(2)对新鲜海绵细胞提取液，采用平板稀释法，在均添加有0.005～0.05％海绵的分离海洋真菌、细菌或放线菌培养基的平皿上，涂刮平板，然后放入到保温箱中培养；(3)培养1～15天后，对平皿长出单菌落纯的微生物移至斜面保藏，并对生物活性物质进行检测验证。本发明操作简单，结果理想，能得到所需的菌株。