专利名称：源自脑膜炎奈瑟氏球菌的basb059多肽的制作方法：本发明涉及多聚核苷酸(这里指的是″BASB059多聚核苷酸″)，由该多聚核苷酸编码的多肽(这里指的是“BASB059”或“BASB059多肽”)，重组材料以及重组材料的生产方法。另一方面，本发明涉及上述多肽和多聚核苷酸的使用方法，包括防止细菌感染的疫苗。更进一步地，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断方法。由血清组A的脑膜炎球菌支配的流行病，大部分在中非，有时发病率高达1000/100,000/年(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.临床微生物学综述(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。几乎脑膜炎疾病的所有病例都是由血清组A，B，C，W-135和Y脑膜炎球菌引起的，并且已经有四价的A，C，W-135，Y多糖疫苗(Amand，J.，Arminjon，F.，Mayard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10335-339，1982)。最近，通过和载体蛋白化学交联的方法，上述多糖疫苗得以改善(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等JAMA 2751499-1503，1996)。没有血清组B疫苗，因为有人发现B荚膜多糖不具有免疫原性，很0可能是由于它和宿主的组分具有结构相似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等传染病杂志(J.Infect.Dis.)126514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Makela，P.M.Lancet ii355-357，1983)。多年以前就开始并进行了发展基于脑膜炎球菌外膜的疫苗的努力(de Moraes，J.C.l，Perkins，B.，Camargo，M.C.等Lancet3401074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.等3381093-1096，1991)。它证明这样的疫苗在较大的儿童(＞4岁)和成人中表现出的效力为57％-85％。在这些疫苗中存在许多细菌的外膜成份，如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB，这些成份对于所观察到的保护效应的贡献还有待进一步阐明。通过使用动物的或人的抗体，其它细菌外膜成份，如TbpB和NspA，已经被认为可能与保护性免疫的诱导相关(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R，实验药物杂志(J.Exp.Med.)1851173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，p.等传染病免疫，(Inf.Immun.)63884-890，1995)。保护性免疫的机制可能涉及抗体介导的杀菌活性和调理性噬菌活性(opsonophagocytosis)。一种菌血症动物模型被用来结合所有的抗体介导的机制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.Poolman，J.T.Vaccine 7325-328，1989)。一般认为，后期补体成分介导的杀菌机制对于抗脑膜炎球菌疾病的免疫是至关重要的(Ross，S.C.，Rosenthal P.J.，Berberic，H.M.，Densen，P.传染病杂志(J.Infect.Dis.)1551266-1275，1987)。在过去的几十年中脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitiddis)感染的频率显著增加。这是由于出现了多抗生素抗性的菌株以及由于免疫系统减弱的人群的增加。分离出具有几种或所有常规抗生素抗性的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株不再是罕见的现象。这一现象产生了未满足的医疗需要，以及对新的抗微生物制剂、疫苗、药物筛选方法、以及对这种生物的诊断检测的需求。通过阅读随后的说明书和通过阅读本公开内容的其它部分，对于本领域的技术熟练人员而言，在本公开的发明的精神和范围内的多种变化和修饰将是显而易见的。本发明进一步提供了(a)一种分离的多肽，该多肽包括的氨基酸序列和SEQ IDNO2的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。
(b)由一种分离的多聚核苷酸编码的多肽，上述分离的多聚核苷酸包括的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO1在SEQ ID NO1的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。
(c)由一种分离的多聚核苷酸编码的多肽，上述分离的多聚核苷酸所编码的多肽和SEQ ID NO2的氨基酸序列的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。
在SEQ ID NO2中提供的BASB059多肽是源自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多肽。
本发明还提供了BASB059多肽的免疫原性片段，即，BASB059多肽的一个连续部分(contiguous portion)，该连续部分的免疫原性和含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同。这就是说，该片段(如果需要的话，与载体偶联时)能够引起识别BASB059多肽的免疫应答。这样的免疫原性片段包括，例如，缺少N-末端引导序列，和/或跨膜区域，和/或C-末端锚定区域的BASB059多肽。在一个优选的方面中，根据本发明的BASB059免疫原性片段含有基本上一个多肽的所有细胞外区域，上述多肽和SEQ ID NO2在SEQ IDNO2的全长上至少具有85％的同一性，更优选地至少90％的同一性，更优选地至少95％，最优选地至少97-99％的同一性。
一个片段是一种多肽，该多肽的氨基酸序列与本发明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分，但不是全部，完全相同。对于BASB059多肽而言，片段可以是“独立存在的(free-standing)”，或者是被包含在较大的多肽中，在较大的多肽中它们形成一个部分或区域，最优选地是在一个单一的较大多肽中作为单一的连续区域。
优选的片段包括，例如，具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其变体的一部分的、截短的多肽，例如包括氨基和/或羧基端氨基酸序列的一系列连续残基。在宿主细胞中产生的，或由宿主细胞产生的降解形式的多肽也是优选的。进一步优选的是具有结构或功能特征的片段，如含有α-螺旋和α-螺旋形成区域，β-平面和β-平面形成区域，转角和转角形成区域，卷曲或卷曲形成区域，亲水性区域，疏水性区域，α两亲性区域，β两亲性区域，柔性区域，表面形成区域，底物结合区域和高抗原性指数区域的片段。
进一步优选的片段包括一种分离的多肽，该多肽含有的氨基酸序列至少有15，20，30，40，50或100个源自SEQ ID NO2氨基酸序列的连续氨基酸残基，或者一种分离的多肽，该多肽含有的氨基酸序列上至少有15，20，30，40，50或100个的从SEQ ID NO2氨基酸序列上截短或缺失连续氨基酸残基。
通过肽段合成，本发明的多肽片段可以被用于生产相应的全长多肽；因此，这些片段可以被用作生产本发明的全长多肽的中间产物。
特别优选的是一些变体，在这些变体中几个5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任何组合形式被替换，缺失或添加。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白的形式，或较大蛋白如前体蛋白或融合蛋白的一部分。包含一个附加的氨基酸序列经常是有利的，上述序列含有分泌或引导序列，前序列，辅助纯化的序列例如多个组氨酸残基，或一个附加的用于增加重组生产中的稳定性的序列。此外，还考虑到添加外源多肽或脂类末端或多聚核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性潜力。
在一方面，本发明一般涉及经基因工程改造的可溶融合蛋白，上述可溶融合蛋白含有本发明的多肽或其片段，以及免疫球蛋白的各种亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)的重链或轻链的恒定区域的各个部分。优选的免疫球蛋白是人IgG，尤其是IgG1，的重链的恒定区，融合在铰链区进行。在一个特定的实施方案中，通过引入能被血凝因子Xa切割的切割序列，可以简单地将Fc部分除去。
此外，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，以及它们在药物筛选，诊断和治疗上的应用。本发明的一个更进一步的方面还涉及编码这样的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白可以进行化学交联，或作为重组融合蛋白表达；重组融合蛋白使得其在表达系统中的生产水平比非-融合蛋白提高了。融合配偶体(fusion partner)可以帮助提供T辅助表位(免疫球蛋白融合配偶体)，优选地为被人类识别的T辅助表位；或帮助蛋白的表达(表达增强子)，使融合蛋白的表达产量比天然重组蛋白更高。优选的融合配偶体将既是免疫球蛋白融合配偶体也是表达增强配偶体。
融合配偶体包括源自Haemophilus influenzae(流感嗜血杆菌)的蛋白D和源自流感病毒的非-结构蛋白，NS1(血凝素)。另一种融合配偶体是被称为LytA的蛋白。优选的是使用该分子的C末端部分。LytA源自Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)，它合成一种N-乙酰基-L-丙氨酸-酰胺酶，酰胺酶LytA，(由lytA基因编码{Gene，43(1986)265-272页})一种特异性降解肽聚糖主链上某些化学键的自溶素。LytA蛋白的C-末端区域负责对胆碱或一些胆碱类似物例如DEAE的亲和性。这个特性已被利用于发展大肠杆菌C-LytA表达质粒，该质粒可用来表达融合蛋白。在蛋白质的氨基末端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已有描述{生物技术(Biotechnology)(1992)795-798页}。可以使用在LytA分子的C末端从残基178开始的重复部分，例如残基188-305。
本发明也包括上述多肽的变体，即与参照多肽相比进行了氨基酸保守替代的多肽，在这样的多肽中一个残基被另一具有相似特征的残基所替代。通常这样的替代是在Ala，Val，Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间进行。
本发明的多肽可以用任何适当的方法制备。这样的多肽包括分离的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成产生的多肽，或通过这些方法的组合产生的多肽。制备这样的多肽的方法在本领域中已经众所周知。
本发明的多肽源自脑膜炎奈瑟氏球菌是最优选的，但是，它也可以优选地从相同分类学种属的其它生物得到。本发明的多肽也可能从，例如，从相同分类学科或目的生物得到。多聚核苷酸本发明的一个目的是提供编码BASB059多肽的多聚核苷酸，尤其是编码本文指定的BASB059多肽的多聚核苷酸。在本发明的一个特定的优选实施方案中，多聚核苷酸包含一个编码BASB059多肽的区域，该区域含有在SEQ ID NO1中列出的序列，该序列包括一个全长基因，或一个全长基因变体。
在SEQ ID NO1中提供的BASB059多聚核苷酸是源自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多聚核苷酸。
作为本发明的进一步的方面，提供了编码和/或表达BASB059多肽和多聚核苷酸，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽和多聚核苷酸，的分离的核酸分子，包括，例如，为未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因组DNA，B-和Z-DNA。本发明的进一步的实施方案包括生物学上，诊断上，预防上，临床上或治疗上有用的多聚核苷酸和多肽，和它们的变体，以及包含上述多聚核苷酸，多肽或变体的组合物。
本发明的另一个方面涉及分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括至少一个全长基因，它编码推导的具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的BASB059多肽，它还编码与此紧密相关的多聚核苷酸及其变体。
在本发明的另一个特定的优选实施方案中，有源自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB059多肽，它包含或由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其变体组成。
利用本文提供的信息，例如在SEQ ID NO1中列出的多聚核苷酸序列，可以通过常规的克隆和筛选方法得到本发明的编码BASB059多肽的多聚核苷酸，例如那些用脑膜炎奈瑟氏球菌细胞作为起始材料从细菌中克隆和测序染色体DNA片段，然后获得全长的克隆的方法。例如，为了获得本发明的多聚核苷酸序列，如在SEQ ID NO1中给出的多聚核苷酸序列，通常用源自部分序列的，放射性标记的寡核苷酸，优选为17聚体或更长，探测在大肠杆菌(E.coli)或其它一些合适的宿主中的脑膜炎奈瑟氏球菌染色体DNA克隆文库。然后利用严紧的杂交条件可以区别出含有与探针DNA相同的DNA的克隆。根据原始的多肽或多聚核苷酸设计测序引物，用测序引物通过杂交鉴定出单独的克隆，然后就可能在两个方向上延伸多聚核苷酸序列以确定全长基因序列。这样的测序可以方便地进行，例如，使用从质粒克隆制备得到的变性双链DNA。适当的技术在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，(MLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL)，2ndEd.(分子克隆实验手册，第二版)；冷泉港实验出版社(Cold SpringHarbor Laobratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(1989)中有所描述(特别参见1.90的Screening By Hybridization(杂交筛选)和13.70的Sequencing Denatured Doubled-StrandedDNA Template(变性双链DNA模板的测序))。也可以进行直接的基因组DNA测序以得到全长的基因序列。本发明的示例，SEQ ID NO1中列出的各个多聚核苷酸，是在源自脑膜炎奈瑟氏球菌的DNA文库中发现的。
并且，SEQ ID NO1中列出的各个DMA序列含有一个编码蛋白的开放阅读框，上述蛋白大致具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸残基数，可以通过本领域中的技术熟练人员众所周知的氨基酸残基分子量计算得到其推算出的分子量。
SEQ ID NO1中的多聚核苷酸在SEQ ID NO1的核苷酸数1的起始密码子和在核苷酸数337开始的终止密码子之间编码了SEQ IDNO2的多肽。
在一个进一步的方面中，本发明提供了一种分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有以下部分或由以下部分组成(a)一种多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列和SEQ IDNO1在SEQ ID NO1的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。
(b)一种多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列编码的多肽和SEQ ID NO2中的氨基酸序列在SEQ ID NO2的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或100％完全相同。
可以通过一种方法得到编码本发明的多肽的多聚核苷酸，包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌以外的种属的同源物或直向同源基因，该方法包括以下步骤用含有SEQ ID NO1的序列或其片段的，或由它们组成的标记的或可检测的探针，在严紧杂交条件下(例如，温度在45-65℃之间，SDS浓度在0.1％-1％之间)筛选适当的文库；并且分离出含有上述多聚核苷酸序列的全长的基因和/或基因组克隆。
本发明提供了一种多聚核苷酸序列，该序列在其全长上与SEQ IDNO1的编码序列(开放阅读框)完全相同。本发明还提供了一种成熟多肽或其片段的编码序列自身，或者在阅读框中与另一编码序列，如编码引导或分泌序列，前蛋白序列，或前体蛋白序列，或前前体蛋白序列的序列，在一起的一种成熟多肽或其片段的编码序列。本发明的多聚核苷酸还可能含有至少一个非编码序列，包括，例如但不限于，至少一个非编码的5’和3’序列，如转录但不翻译的序列，终止信号(如rho依赖性和非rho依赖性的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子和多聚腺苷酸化信号。多聚核苷酸序列还可以含有编码附加的氨基酸的附加编码序列。例如，可以编码便于融合多肽的纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中上述标记序列是6组氨酸肽，上述6组氨酸肽由pQE(PQE)载体提供，并且在Gentz等美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86821-824(1989)中有所描述，或者是HA肽标记(Wilson等，Cell 37767(1984))，两种序列都可以用来纯化与其融合的多肽序列。本发明的多聚核苷酸还包括，但不限于，含有结构基因的多聚核苷酸，以及调控基因表达的与基因天然相联系的序列。
编码SEQ ID NO2的BASB059多肽的核苷酸序列可以与SEQ IDNO1的核苷酸1到336包含的多肽编码序列相同。替代地，它也可以是一段由于遗传密码的冗余性(简并性)而同样编码SEQ ID NO2的多肽的序列。
此处所用的术语“编码多肽的多聚核苷酸”包括一些多聚核苷酸，上述多聚核苷酸包括编码本发明的多肽的序列，上述多肽特别指细菌多肽，更特别地指具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽。该术语还包括含有编码上述多肽的单一连续区域或不连续区域(例如，多聚核苷酸被整合噬菌体，整合插入序列，整合载体序列，整合转位子序列所中断，或者由于RNA编辑或基因组DNA重排所中断)以及附加区域的多聚核苷酸，上述附加区域也可能含有编码和/或非编码序列。
本发明进而涉及此处描述的多聚核苷酸的变体，它编码具有SEQID NO2的推导的氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多聚核苷酸的片段可以被用来，例如，合成本发明的全长多聚核苷酸。
进一步特别优选的实施方案是编码BASB059变体的多聚核苷酸，上述变体具有SEQ ID NO2的BASB059多肽的氨基酸序列，并且其中几个，一些，5到10个，1到5个，1到3个，2个，1个或无氨基酸残基以任何组合形式被替换、修饰、缺失、和/或添加。其中特别优选的是不改变BASB059多肽的特性和活性的沉默替换、添加和缺失。
本发明进一步优选的实施方案是在其全长上和编码BASB059多肽的多聚核苷酸具有至少85％的同一性的多聚核苷酸，以及与这样的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸，上述BASB059多肽具有SEQ ID NO2中列出的氨基酸序列。在这一点上，与同一多聚核苷酸在全长上具有至少90％同一性的多聚核苷酸是特别优选的，在这些特别优选的多聚核苷酸中，那些具有至少95％同一性的是尤其优选的。进而，在那些具有95％同一性的多聚核苷酸中，具有至少97％同一性的那些是高度优选的，其中那些至少98％和至少99％的是特别高度优选的，而具有至少99％的是更为优选的。
所编码的多肽基本上保留了与SEQ ID NO1的DNA所编码的成熟多肽一样的生物学功能或活性的多聚核苷酸为优选的实施方案。
根据本发明的某些优选的实施方案，提供的多聚核苷酸和BASB059多聚核苷酸序列，如SEQ ID NO1中的那些多聚核苷酸序列，杂交，尤其是在严紧的条件下杂交。
本发明进一步涉及与本文提供的多聚核苷酸序列杂交的多聚核苷酸。在这一点上，本发明尤其涉及在严紧条件下与本文描述的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。本文使用的术语“严紧条件”和“严紧杂交条件”的意思为只有在序列间的同一性至少为95％，优选地至少为97％时才会发生的杂交。严紧杂交条件的特定例子为在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml变性的，剪切的鲑精DNA的溶液中42℃温育过夜，然后在大约65℃在0.1×SSC中洗涤杂交支持物。杂交和洗涤的条件是众所周知的，并且在Sambrook，等，分子克隆实验手册(Molecular CloningALaboratory Manual)，第二版，冷泉港，N.Y.，(1989)中有示例，尤其是其第11章。也可以用本发明提供的多聚核苷酸序列进行溶液杂交。
本发明还提供了一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有，或由一段多聚核苷酸序列组成，上述多聚核苷酸序列是通过筛选含有SEQ IDNO1中列出的多聚核苷酸序列的完整基因的适当文库，并且分离上述多聚核苷酸序列而得到的，上述筛选是通过使用具有上述在SEQ IDNO1中列出的多聚核苷酸序列或其片段的序列的探针，在严紧的杂交条件下进行的。可用于获得这样的多聚核苷酸的片段包括，例如，在本文其它处充分描述的探针和引物。
作为本文别处所讨论的关于本发明的多聚核苷酸的分析，例如，本发明的多聚核苷酸，可以被用作RNA，cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码BASB059的全长cDNAs和基因组克隆，以及分离和BASB059基因有高同一性，特别是高序列同一性，的其它基因的cDNA和基因组克隆。这样的探针通常将含有至少15个核苷酸残基或碱基对。优选地，这样的探针将含有至少30个核苷酸残基或碱基对并且可以有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针将含有至少20并且少于30个核苷酸残基或碱基对。
通过用SEQ ID NO1提供的DNA序列合成寡核苷酸探针进行筛选，可以分离BASB059基因的编码区域。然后用标记的具有与本发明的基因序列互补的序列的寡核苷酸筛选cDNA，基因组DNA或mRNA文库，从而确定探针与文库的哪些成员杂交。
有几种获得全长DNA，或延伸短DNA的，并且为本领域的技术熟练人员所共知的方法，例如那些基于快速扩增cDNA末端(RapidAmplicaition of cDNA ends，RACE)的方法(参见，例如，Rrohman，等，PNAS USA 858998-9002，1998)。最近的该技术的改造，例如，以MarathonTM技术(Clontech Loboratories Inc.)作为例子，已经显著简化了较长的cDNA的搜索。在MarathonTM技术中，从选定的组织中提取得到的mRNA被制备成cDNA，并且在两端被链接上’匹配’序列。然后用基因特异的和匹配特异的寡核苷酸引物共同进行核酸扩增(PCR)以扩增DNA“缺失”的5’末端。利用″嵌套″引物反复进行PCR反应，上述″嵌套″引物即被设计用来在扩增产物中退火的引物(通常匹配特异的引物进一步将匹配序列的3’端退火，基因特异的引物将所选定的基因序列的5’端退火)。然后可以通过DNA测序分析上述反应的产物，全长DNA的构建可以通过直接把产物与已存在的DNA连接以产生全长序列，或者利用新的序列信息设计5’引物单独进行全长的PCR。
如本文在涉及多聚核苷酸的分析中所进一步讨论的，本发明的多聚核苷酸和多肽可以被用作，例如，发现疾病，尤其是人类疾病，的治疗和诊断方法的研究试剂和材料。
作为源自序列SEQ ID NO1-2的寡聚核苷酸的本发明的多聚核苷酸可以用于本文所描述的方法中，但优选地用于PCR，以确定本文所鉴定的多聚核苷酸是否在被感染组织的细菌中被部分或全部转录。已经认识到这样的序列也可用于诊断该病原体所达到的感染阶段和感染类型。
本发明也提供编码多肽的多聚核苷酸，该多肽是成熟蛋白加上附加的氨基或羧基-末端氨基酸，或成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式具有一条以上的肽链时)。这样的序列可以在蛋白从前体到成熟形式的过程中起作用，可以允许蛋白运输，可以延长或缩短蛋白的半衰期，或可以便于蛋白在分析或生产中的操作，等等。通常在体内，附加的氨基酸可以被细胞的酶加工而离开成熟蛋白。
对于本发明的每个多聚核苷酸，本发明提供了与之互补的多聚核苷酸。优选地，这些互补的多聚核苷酸是完全与每个和它们互补的多聚核苷酸完全互补的。
由上述多肽的成熟形式与一个或多个前序列融合而成的前体蛋白可以是该多肽的无活性形式。当前序列被除去时，这种无活性的前体通常被激活。一些或全部的前序列可以在激活之前被除去。通常，这样的前体被称为前体蛋白。
在描述本发明的某些多聚核苷酸时除了常规的A，G，C，T/U核苷表示法外，也可以用术语“N”。“N”表示在DNA或RNA序列的该指定位置可以为四个DNA或RNA核苷中的任何一个，但是当以下情况是优选时除外当某个核苷酸与相邻位置的核苷酸一起，在正确的阅读框中将导致在这样的阅读框中产生提前终止密码子效应时，N不是那个核苷酸。
总而言之，本发明的多聚核苷酸可以编码成熟蛋白，成熟蛋白加上引导序列(将被称为前蛋白)，成熟蛋白的前体，上述前体具有一个或多个并非前蛋白或前前体蛋白的引导序列的前体序列，前前体蛋白是前体蛋白的前体，它具有引导序列和一个或多个前体序列，上述前体序列和引导序列通常在加工步骤中被除去，产生上述多肽的活性成熟形式。
根据本发明的一个方面，提供了本发明的多聚核苷酸在治疗或预防上的应用，特别是在基因免疫上的应用。
本发明的多聚核苷酸在基因免疫上的应用将优选地使用适当的输送方法，例如直接将质粒DNA注射入肌肉(Wolff等，人类分子遗传学(Hum Mol Genet)(1992)1363，Manthorpe等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther)(1983)4419)，输送DNA和特定蛋白载体的复合物(Wu等，生物化学杂志(J Biol Chem.)(1989)26416985)，将DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)839551)，将DNA包入各种形式的脂质体中(Kaneda等，Science(1989)243375)，颗粒轰击(Tang等，Nature(1992)356152，Eisenbrau等，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol)(1993)12791)和用克隆的反转录病毒载体进行体内感染(Seeger等，PNAS USA(1984)815849)。载体，宿主细胞，表达系统本发明还涉及含有本发明的一种或几种多聚核苷酸的载体，用本发明的载体经遗传工程得到的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。利用源自本发明的DNA构建体的RNA也可以通过无细胞翻译系统生产这样的蛋白质。
通过本领域中的技术熟练人员众所周知的方法可以从基因工程改造的含有表达系统的宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此，在更进一步的一个方面中，本发明涉及含有本发明的一种或几种多聚核苷酸的表达系统，涉及用这样的表达系统进行基因工程改造的宿主细胞，并涉及通过重组技术生产本发明的多肽。
为了本发明的多肽的重组生产，可以对宿主细胞进行基因工程改造以使其整合表达系统或表达系统的组成部分，或本发明的多聚核苷酸。可以通过许多常规的实验室手册中描述的方法将多聚核苷酸导入到宿主细胞中，例如Davis等，分子生物学基本方法(BASIC METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆实验手册(MOLECULAR CLOININGA LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，例如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转位，显微注射，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，刮棒负载(scrape loading)，弹道法导入(ballisticIntroduction)和感染。
适当宿主的代表例子包括细菌细胞，如链球菌，葡萄球菌，肠球菌，大肠杆菌，链霉菌，蓝细菌，Bacillus subtiLIs(枯草杆菌)，Moraxella catarrhalis(狭鼻摩拉克氏菌)，Haemophilusinfluenzae(嗜血流感杆菌)和Neisseria meningitidis(脑膜炎奈瑟氏球菌)的细胞，真菌细胞如酵母，Kluveromyces(克鲁维酵母)，Saccharomyces(啤酒酵母)，basidiomycete(担子菌类)，Candidaalbicans(白色丝酵母)和Aspergillus(曲菌属)的细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑色素瘤细胞；植物细胞如裸子植物和被子植物的细胞。
许多种表达系统可以用于生产本发明的多肽。这样的载体其中包括源自染色体的，附加体的和病毒的载体，等等，例如，源自细菌质粒，噬菌体，转位子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件的载体和源自病毒，如杆状病毒，乳多空病毒如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，细小核糖核酸病毒，反转录病毒和α-病毒的载体以及来自它们的组合的载体，如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，如粘粒载体和噬菌体粒载体。表达系统构建体可以含有调节并导致表达的调控区域。通常，任何适于在宿主细胞中维持，扩增或表达多聚核苷酸和/或表达多肽的系统或载体都可以在这点上用于表达。可以通过多种众所周知的常规方法中的任何一种将适当的DNA序列插入到表达系统中，上述方法的例子如，例如，Sambrook等，分子克隆，实验手册(MOLECULAR CLONNING.A LABORATORY MANUAL)(上文)中所列出的方法。
为了将翻译的蛋白分泌到内质网腔，到周质间隙或到细胞外环境，在真核生物重组表达系统中可以将适当的分泌信号整合到表达的多肽中。这些信号可以是上述多肽的内源信号或外源信号。
可以用众所周知的方法从重组细胞培养物回收和纯化本发明的多肽，上述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和植物凝集素层析。最优选地，用金属离子亲和层析(Ion metalaffinity chromatograhpy，IMAC)进行纯化。当多肽在细胞内合成，分离和/或纯化过程中变性时，可以利用众所周知的蛋白质重折叠技术重新生成活性构象。
表达系统也可以是重组的活微生物，例如病毒或细菌。感兴趣的基因可以被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。上述活载体的接种和体内感染将导致抗原在体内的表达并诱导免疫应答。用于上述目的的病毒和细菌如痘病毒，(例如牛痘病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒)α-病毒(新培斯病毒，Semliki森林病毒，委内瑞拉马脑炎病毒)，腺病毒，腺相关病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，疤疹病毒(带状水痘病毒，等等)，利斯特菌，沙门氏菌，志贺氏菌，奈瑟氏菌，卡介苗。这些病毒和细菌可以是毒性的，或者是经过多种方法弱化以得到活疫苗。这样的活疫苗也构成了本发明的一部分。诊断，预测，血清型和突变分析本发明还涉及将本发明和BASB059的多肽多聚核苷酸用作诊断试剂的用途。对真核生物，特别是哺乳动物，尤其是人类，体内的BASB059多聚核苷酸和/或多肽的检测将提供诊断疾病，确定疾病的阶段或确定感染生物体对药物的反应的方法。可以通过多种众所周知的技术和本文提供的方法在核酸或氨基酸水平上检测真核生物，特别是对哺乳动物，尤其是人类，特别是那些感染了或易于被含有BASB059基因或蛋白的生物感染的人。
可以从被怀疑感染了和/或被感染的个体的身体物质获得用于预测，诊断或其它分析的多肽或多聚核苷酸。源自任何这些来源的多聚核苷酸，特别是DNA或RNA，可以被直接用来检测，或可以在分析之前通过PCR或任何其它扩增技术用酶进行扩增。RNA，特别是mRNA，cDNA和基因组DNA也可以以相同的方式被应用。利用扩增，可以通过分析个体体内存在的感染或驻留生物体的选定多聚核苷酸的基因型，对上述生物体的物种和菌株的特征进行鉴定。通过将扩增产物和选自相关生物体的参照序列的基因型进行比较而改变折增产物的大小，可以检测缺失和插入，上述相关生物体优选地为同一属的不同种或同一种的不同菌株。通过扩增DNA与标记的BASB059多聚核苷酸序列的杂交可以鉴定定点突变。可以通过DNA酶或RNA酶分别对DNA或RNA的水解，或通过检测融解温度或复性动力学的差异可以将完好匹配或明显匹配的序列和不完好匹配或更明显不匹配的双链体分开。也可以通过比较多聚核苷酸片段与参照序列在凝胶上的电泳迁移性质的改变而检测多聚核苷酸序列的差异。这可以在存在或不存在变性剂的条件下进行。也可以通过直接的DNA或RNA测序检测多聚核苷酸的差异。参见，例如，Myers等，Science，2301242(1985)。也可以通过核酸酶保护分析，如RNase，V1和S1保护分析，或通过化学裂解的方法揭示特定部位的序列变化。参见，例如，Cotton等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，854397-4401(1985)。
在另一个实施方案中，可以构建含有BASB059核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探针阵列，以便有效地筛选，例如，基因突变，血清型，分类学的分类或鉴定。阵列技术方法是众所周知的并且具有广泛的可应用性，并可以被用于解决分子遗传学中的许多问题，包括基因表达，遗传连锁和遗传变异性(参见，例如，Chee等，Science，274610(1996))。
因此，在另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒含有(a)本发明的多聚核苷酸，优选地为SEQ ID NO1中的核苷酸序列，或其片段；(b)与(a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(c)本发明的多肽，优选地为SEQ ID NO2中的多肽或其片段；或(d)针对本发明的多肽的抗体，优选地为针对SEQ ID NO2中的多肽的抗体。
要明白在所有的这样的试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包括重要的成分。这样一种试剂盒在其中诊断一种疾病或情疑一种疾病中是有用途的。
本发明还涉及本发明的多聚核苷酸作为诊断试剂的应用。对与疾病或病原性相关的本发明的多聚核苷酸，优选地为SEQ ID NO1，的突变形式的检测将提供一种诊断工具，这种诊断工具将增加，或定义，一种疾病的诊断，疾病进程的预测，疾病阶段的确定，或对一种疾病的易感性，上述疾病是由于该多聚核苷酸的表达不足，表达过量或表达改变造成的。可以通过各种技术，例如本文其它处所描述的技术，在多聚核苷酸水平上对在这样的多聚核苷酸上带有突变的生物，尤其是传染性的生物进行检测。
也可以用各种技术，例如，通过血清型分型，在多聚核苷酸或多肽水平上对源自一种生物体的细胞进行检测，上述生物体在本发明的多聚核苷酸和/或多肽上含有突变或多态性(等位基因变种)。例如，可以用RT-PCR检测RNA中的突变。尤其优选的是联合使用RT-PCR和自动化的检测系统，如，例如，GeneScan。RNA，cDNA或基因组DNA也可以被用于相同的目的，PCR。作为例子，与编码BASB059多肽的多聚核苷酸互补的PCR引物可以被用于鉴定和分析突变。
本发明进而提供了在5’和/或3’端除去1，2，3或4个核苷酸的引物。这些可以被用于扩增从源自个体的样品，如身体物质，分离得到的BASB059DNA和/或RNA。上述引物可以被用于扩增从被感染的个体分离得到的多聚核苷酸，以便该多聚核苷酸可以进行多种技术的分析以便阐明该多聚核苷酸的序列。通过这种方法可以检测多聚核苷酸上的突变并用于诊断和/或预测感染，或感染的阶段或进程，或对感染物质进行血清学分型和/或分类。
本发明进而提供了诊断疾病的方法，上述疾病优选地为细菌感染，更优选地为由脑膜炎奈瑟氏球菌导致的感染，上述方法包括确定源自个体的样品，如身体物质，中具有SEQ ID NO1序列的多聚核苷酸的表达水平升高了。可以利用本领域中众所周知的多聚核苷酸定量方法的任何一种测量BASB059多聚核苷酸表达的升高或降低，上述多聚核苷酸定量方法如，例如，扩增，PCR，RT-PCR，RNase保护，Northern印迹法，分光光度法和其它杂交方法。
此外，通过检测BASB059多肽相对于正常对照组织样品过量的表达，根据本发明的诊断分析可以被用于，例如，检测感染的存在。可以用来确定源自宿主的样品，如身体物质，中BASB059多肽的水平的分析技术对于本领域中具有一定技术的人员是众所周知的。这样的分析方法包括放射性免疫分析，竞争结合分析，Western印迹分析，抗体夹心法分析，抗体检测和ELISA分析。
本发明的多聚核苷酸可以被用作多聚核苷酸阵列的组成成分，上述阵列优选地为高密度的阵列或网格。这样的高密度阵列对于诊断和预测目的而言是特别有用的。例如，一组点，每个含有不同的基因，并进而含有本发明的一种或几种多聚核苷酸；利用源自或从身体样品得到的探针，这样的一组点可以被用来探测个体中特定多聚核苷酸序列或相关序列的存在例如利用杂交或核酸扩增。这样的存在可能意味着存在病原体，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌，并且可以用于诊断和/或预测疾病或疾病的进程。含有SEQ ID NO1中的多聚核苷酸序列的许多变体的网格是优选的。含有编码SEQ ID NO2中的多肽序列的多聚核苷酸序列的变体的网格也是优选的。抗体本发明的多肽和多聚核苷酸或它们的变体，或表达它们的细胞，可以被用作免疫原以生产分别对这样的多肽或多聚核苷酸具有免疫特异性的抗体。
在本发明的某些优选的实施方案中，还提供了针对BASB059多肽或多聚核苷酸的抗体。
可以利用常规方法，通过对动物，优选地为非人类动物，施用本发明的多肽和/或多聚核苷酸，或两者之一或两者的带表位的片段，或两者之一或两者的类似物，或表达或两者之一或两者的细胞，来得到针对本发明的多肽或多聚核苷酸的抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用本领域中已知的任何通过连续细胞系培养物产生抗体的技术。例子包括各种技术，如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature256495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫学(Immunology Today)472(1983)；Cole等，Pg.77-96 In单克隆抗体和癌症治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的技术。
生产单链抗体的技术(美国专利第4，946，778号)可以被采用来生产针对本发明的多肽或多聚核苷酸的单链抗体。同时，转基因小鼠，或其它生物体或其它动物，如其它哺乳动物，可以被用来表达对本发明的多肽或多聚核苷酸具有免疫特异性的人源化抗体。
替代地，也可以用噬菌体展示技术选择对本发明的多肽具有结合活性的抗体基因，该抗体基因或者源自原始文库(naive library)或源自PCR扩增的淋巴细胞V-基因库，上述淋巴细胞源自经筛选具有抗-BASB059抗性的人类(McCafferty，et al.，(1990)，Nature348，552-554；Marks，等，(1992)生物技术(Biotechnology)10，779-783)。这些抗体的亲和性也可以通过，例如，链改组得以提高(Clackson等，(1991)Nature 352628)。
以上描述的抗体也可以被用来分离或鉴定表达本发明的多肽或多聚核苷酸的克隆，用来通过，例如，亲和层析纯化上述多肽或多聚核苷酸。
因此，抗BASB059多肽或BASB059多聚核苷酸的抗体等等可以被用来治疗感染，特别是细菌感染。
多肽变体，包括抗原性的，表位的或免疫学上的等效变体构成了本发明的一个特定的方面。
优选地，抗体或其变体被修饰使其在个体中具有较少的免疫原性。例如，如果该个体是人，最优选地抗体可以被“人源化”，在人源化抗体中源自杂交瘤的抗体的一个或几个互补决定区被转移到人的单克隆抗体中，例如，如Jones等(1986)，Nature 321，522-525中，或Tempest等，(1991)生物技术(Biotechnology)9，266-273中所描述。拮抗剂与激动剂-分析和分子本发明的多肽和多聚核苷酸可以被用于评测小分子底物与配基和，例如，细胞，无细胞制备物，化学文库和天然产物混合物的结合。这些底物和配基可以是天然底物和配基或可以是结构或功能类似物。参见，例如，Coligan等，免疫学中的通用方法(CurrentProtocols In Immunology)1(2)第5章(1991)。
筛选方法可以是通过与待选化合物的相关的直接或间接标记简单地测量待选化合物与多肽或多聚核苷酸，或与带有该多肽或多聚核苷酸的膜或细胞，或与该多肽的融合蛋白的结合。替代地，该筛选方法可以与标记的竞争物竞争。进而，利用对于含有上述多肽或多聚核苷酸的细胞适当的检测系统，这些筛选方法可以测试待选化合物是否导致由于该多肽或多聚核苷酸的激活或抑制而产生的信号。通常在存在已知的激动剂的情况下检测激活的抑制剂，并观察在待选化合物存在的情况下激动剂的激活效应。具有组成型活性的多肽和/或组成型表达的多肽和多聚核苷酸可以被用于在无激动剂或抑制剂的情况下筛选反激动剂或抑制剂的方法中；上述筛选是通过，根据具体情况，测定待选化合物是否导致对上述多肽或多聚核苷酸的激活的抑制。进而，筛选方法可以简单地含有以下步骤将待选化合物与含有本发明的多肽或多聚核苷酸的溶液混合以形成混合物，测量混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性，并将混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性与标准进行比较。融合蛋白，如本文先前所描述的Fc部分和BASB059多肽的融合蛋白，也可以被用于鉴定本发明的多肽的拮抗剂，以及鉴定系统发生和/或功能上相关的多肽的高通量筛选检测(参见D.Bennett等，分子识别杂志(J Mol.Recognition)，852--58(1995)；和K.Johanson等，生物化学杂志(J Biol Chem)，270(16)9459-9471(1995))。
与本发明的多肽结合和/或相互作用的多聚核苷酸，多肽和抗体也可以被用于设计筛选方法，上述筛选方法用于检测加入的化合物对mRNA和/或多肽在细胞中的生成的影响。例如，通过本领域中众所周知的方法用单克隆或多克隆抗体建立ELISA方法，以测量分泌的或与细胞相关的多肽的水平。这可以用来在适当的处理过的细胞或组织中寻找可能抑制或增强多肽生成的物质(也分别称为拮抗剂或激动剂)。
本发明也提供了一种筛选化合物的方法，以鉴定那些增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB059多肽或多聚核苷酸的作用的化合物，特别是那些具有抑菌和/或杀菌作用的化合物。筛选的方法可能涉及高通量技术。例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，将一种合成的反应混合物，一种含有BASB059多肽的细胞区室，例如膜，细胞外膜或细胞壁，或任何上述制备物与该多肽的标记底物或配基在有或无待选分子存在的情况下温育，上述待选分子可能是BASB059的激动剂或拮抗剂。待选分子激活或拮抗BASB059多肽的能力是通过标记配基的结合的下降，或通过从这样的底物生成的产物的量的降低来反映的。没有理由地(gratuitously)结合，即，不诱导BASB059多肽的效应，的分子很可能是很好的拮抗剂。结合得很好并且，根据具体情况，提高从底物生成产物的速率，增强信号转导或增强化学通道活性的分子是激动剂。可以通过使用报告系统增强对，根据具体情况，从底物生成产物的速率，或信号转导水平或化学通道活性水平的检测。在这方面有用的报告系统包括，但不限于，本领域中已知的比色系统，被转化为产物的标记底物，对BASB059多聚核苷酸或多肽活性的变化响应的报告基因以及结合分析。
另一个BASB059激动剂检测方法的例子是竞争检测法，该方法将BASB059和可能的激动剂与BASB059-结合分子，重组的BASB059结合分子，天然底物或配基，或底物或配基的类似物混合在一起，在适当的条件下检测竞争性抑制。BASB059可以被标记，例如通过放射性或比色化合物，以便精确地确定结合到结合分子的，或转化成产物的BASB059分子数，以便评价可能的拮抗剂的效价。
可能的拮抗剂其中包括有机小分子，肽，多肽和抗体，等等；上述抗体与本发明的多聚核苷酸和/或多肽结合，从而抑制或消除多聚核苷酸或多肽的活性或表达。可能的拮抗剂也可以是有机小分子，肽，多肽，如紧密相关蛋白，或在结合分子上结合相同位点的抗体；例如一个结合分子，它不诱导BASB059所诱导的活性，从而通过排斥BASB059多肽和/或多聚核苷酸的结合，阻止了BASB059多肽和/或多聚核苷酸的作用或表达。
可能的拮抗剂包括与多肽的结合位点结合并占据了结合位点的小分子，它阻止了细胞结合分子的结合，从而阻止了正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于有机小分子，肽或类似肽的分子。其它可能的拮抗剂包括反义分子(这些分子的描述参见Okano，神经化学杂志(J.Neurochem.)56560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸(OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。优选的可能拮抗剂包括涉及BASB059变体的化合物。
在一个更进一步的方面，本发明涉及基因工程改造的可溶性融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的多肽或其片段，以及各种亚类的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE)的重链和轻链的恒定区的各个部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG，特别是IgG1的重链恒定区，其中融合在铰链区进行。在一个特定的实施方案中，通过引入可以被凝血因子Xa所切割的切割序列，可以简单地将Fc部分除去。进而，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，以及它们在药物筛选，诊断和治疗上的应用。本发明的一个更进一步的方面还涉及编码这样的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914中找到。
本文提供的各个多聚核苷酸序列可以被用于寻找和开发抗菌的化合物。它们所编码的蛋白表达后可以被用作筛选抗菌药物的靶。此外，编码所编码的蛋白的氨基末端区的多聚核苷酸序列，或相应mRNA的Shine-Delgarno序列或其它有利于翻译的序列都可以被用来构建反义序列以控制感兴趣的编码序列的表达。
本发明还提供了本发明的多肽，多聚核苷酸，激动剂或拮抗剂在干扰一种或几种病原体与真核宿主，优选地为哺乳动物宿主，间的初始物理相互作用上的应用，上述初始物理相互作用造成了感染的结果。具体而言，本发明的上述分子可以被用于防止细菌，特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，对真核生物，优选地为哺乳动物，埋藏装置上的或伤口的细胞外基质蛋白的粘附；阻断真核生物，优选地为哺乳动物，的细胞外基质蛋白和介导组织损伤的细菌BASB059蛋白之间的细菌粘附，和/或；阻断感染的疾病发生的正常进行，上述感染是由植入埋藏装置或其它外科技术以外的原因导致的。
根据本发明的另一方面，提供了BASB059激动剂和拮抗剂，优选地为抑菌或杀菌的激动剂或拮抗剂。
本发明的激动剂或拮抗剂可以被用于，例如，防止、抑制和/或治疗疾病。
在一个进一步的方面，本发明涉及本发明的多肽的拟表位(mimotopes)。拟表位是一段肽序列，它和天然肽足够类似(序列上或结构上)，从而能被识别该天然肽的抗体所识别；或者当它与适当的载体偶联时能引起识别天然肽的抗体。
可以通过添加、缺失或替换选定的氨基酸来设计用于特定目的的肽拟表位。因此，可以对多肽进行修饰以便于与蛋白载体偶联。例如，对于一些化学偶联方法而言包括一个末端半胱氨酸是合乎需要的。此外，对于与蛋白载体偶联的肽而言，含有一个远离肽的偶联末端的疏水末端，以便上述肽的自由未偶联末端保持与载体蛋白的表面相连，这可能是合乎需要的。这样该肽段呈现的构象最接近于当它处于整体天然蛋白环境时的构象。例如，可以改变肽段使其含有N-末端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化的尾部。替代地，可以添加或替代一个或多个氨基酸的D-立体化学异构体以得到有利的衍生物，例如，以增强上述肽的稳定性。
替代地，可以通过诸如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)这样的技术，利用自身能够结合本发明的多肽的抗体鉴定肽拟表位。该技术产生大量的模拟天然肽段结构的肽序列，并且因此能够结合抗-天然肽的抗体，但它们自身不一定和该天然肽具有明显的序列同源性。疫苗本发明的另一方面涉及在个体中，特别是哺乳动物中，优选地为人类中，诱导免疫应答的方法，该方法包括用BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体，对个体接种，上述接种足以产生抗体和/或T细胞免疫应答以保护上述个体免受感染，特别是细菌感染，尤其特别是脑膜炎奈瑟氏球菌感染。还提供了一些方法，其中这样的免疫应答减慢了细菌的复制。本发明的另一方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，该方法包括为了诱导免疫应答而往上述个体输送直接表达BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体的核酸载体、序列或核酶，以便在体内直接表达BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体，从而例如产生抗体和/或T细胞免疫应答，包括，例如，产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞，从而保护上述个体免受疾病，不论上述疾病是否已经在上述个体中发生。施用上述基因的一个例子是将其包被在颗粒或其它东西上，从而加速其进入所期望的细胞。这样的核酸载体可以包括DNA，RNA，核酶，修饰的核酸，DNA/RNA杂合体，DNA-蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫组合物，当该组合物被引入到能够被诱导免疫应答的个体，优选地为人类，时在这样的个体中诱导针对BASB059多聚核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答，其中上述组合物含有重组的BASB059多聚核苷酸和/或由其编码的多肽，和/或含有编码和表达上述BASB059多聚核苷酸，其编码的多肽，或其它本发明的多肽的抗原的DNA和/或RNA。上述免疫应答可以被用于治疗或预防用途，并且可以是抗体免疫和/或细胞免疫的形式，如CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。
BASB059多肽或其片段可以与辅助蛋白或化学部分融合，上述辅助蛋白或化学部分自身可以产生也可以不产生抗体，但它们能稳定上述第一蛋白并且产生具有抗原性和/或免疫原性的，优选地具有保护特性的，融合的或修饰的蛋白。这样融合的重组蛋白优选地进一步含有一个免疫原性的辅助蛋白，如源自嗜血流感杆菌(HaemophilusInfluenzae)的脂蛋白D，谷胱氨肽-S-转移酶(GST)或β-糖苷酶，或任何其它相对较大的，能够稳定该蛋白并有利于其生产和纯化的辅助蛋白。此外，在对接受该蛋白的生物体的免疫系统提供一种普遍的刺激的意义上，该辅助蛋白可以作为一种佐剂。该辅助蛋白可以附接到第一蛋白的氨基或羧基一末端上。
在根据本发明的疫苗组合物中，BASB059多肽和/或多聚核苷酸、或片段、或拟表位、或其变体可以存在于一个载体中，如以上描述的活的重组载体，例如，活的细菌载体。BASB059多肽的非活载体，例如，细菌外膜囊泡或“小泡(blebs)”也是适合的。OM小泡是源自革兰氏阴性菌两层膜的外膜，并且有报道表明存在于许多革兰氏阴性细菌中(Zhou，L等，1998.微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)163223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。报道表明能产生水泡的细菌病原体的不完全名单还包括Bordetella pertussis(百日咳博德特氏菌)，Borrelia burgdorferi，Brucellamelitensis(马尔他布鲁氏菌)，Esherichia coli(大肠埃希氏菌)，(Brucella ovis)绵羊布鲁氏菌，haemophilus Influenza(嗜血流感杆菌)，Legionella pneumophila(嗜肺军团菌)，Neisseriagonorrhoeae(奈瑟氏淋病菌)，(Neisseria meningitidis)脑膜炎奈瑟氏球菌，Pseudomonas aeruginosa(绿色假单胞菌)和Yersiniaenterocolitica(小肠结肠炎叶尔森氏菌)。
小泡的优点是提供了天然构象的外膜蛋白，因此对于疫苗特别有用。可以对细菌进行改造，从而改变外膜上的一个或多个分子的表达，从而改善其疫苗用途。因此可以引入或上调(例如，通过改变启动子)外膜上合乎需要的免疫原性蛋白例如BASB059多肽的表达。替代地或另加地，可以下调不相关的(例如非保护性的抗原或免疫显性的但却可变的蛋白)或有害的(例如毒性分子如LPS，或自体免疫应答的可能的诱导剂)外膜分子的表达。这些方法将在下文详细描述。
BASB059基因的非编码侧翼区域含有对该基因的表达很重要的调控元件。这种调控同时在转录水平上和翻译水平进行。可以通过DNA测序获得处于该基因的开放阅读框的上游或下游的这些区域的序列。这些序列信息允许人们确定可能的调节基序，如不同的启动子元件，终止序列，可诱导序列元件，阻抑物，负责期变异(phasevariable)的元件，Shine-Dalgarno序列，可能具有参与调节的二级结构的序列，以及其它类型的调节基序或序列。这些序列是本发明的进一步的方面。
这些序列信息允许人们对BASB059基因天然表达调控。可以通过改变启动子，Shine-Dalgarno序列，可能的阻抑物或操纵子元件，或任何其它相关的元件来完成对基因表达的上调。类似地，可以通过类似的改变达到对表达的下调。替代地，通过对相变异序列的改变可以将该基因的表达处于位相变异的控制之下，或者可以将其表达与相变异的控制解偶联。在另一种方法中，可以将该基因置于一个或多个允许对表达进行调控的可诱导元件的控制之下。这样的调控的例子包括，但不限于，温度改变，添加诱导底物如选定的碳水化合物或它们的衍生物，痕量元素，维生素，辅因子，金属离子等的诱导。
可以通过几种不同的方法引入上文所描述的改造。可以通过随机诱变，然后筛选所需要的表型，从而在体内对涉及基因表达的序列进行改造。另一种方法包括分离感兴趣的区域，然后通过随机诱变或定点置换，插入或缺失突变进行改造。然后通过同源重组，改造后的区域被重新引入到细菌基因组中，接着测定对基因表达的影响。在另一种方法中，可以利用感兴趣的区域的序列知识来置换或缺失部分或所有的天然调节序列。在这种情况下，分离目的调节区域并进行改造，使其含有另一基因的调控元件，含有来自不同基因的调控元件的组合，含有合成的调控区域或含有任何其它调控区域，或者使野生型调控序列的选定部分被缺失。然后通过同源重组，这些改造后的序列可以被重新引入到细菌的基因组。可用于基因表达的上调的优选启动子的不完全清单包括源自脑膜炎奈瑟氏球菌或奈瑟氏淋病菌的启动子porA，proB，lbpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；ompCD，copB，lbpB，ompE，UspA1；UspA2；源自M.catarrhalis的TbpB；源自嗜血流感杆菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一个实施例中，可以通过将基因的启动子换为较强的启动子(通过分离该基因的上游序列，体外改造该序列，并通过同源重组重新引入到基因组中)而调控基因的表达。可以在细菌和细菌释放(或产生)的外膜小泡中实现上调表达。
在其它实施例中，所描述的方法可以用于产生重组细菌菌株，在上述重组菌株中用于疫苗用途的特性得到了改善。上述菌株可以是但不限于，弱化的菌株，所选择的抗原的表达增强的菌株，干扰免疫应答的基因被敲除(或表达降低)的菌株，免疫显性蛋白的表达受调节的菌株，外膜小泡的释放受调节的菌株。
因此，本发明也提供了BASB059基因的改造后的上游区域，该改造后的上游区域含有异源调控元件，该异源调控元件改变位于外膜的BASB059蛋白的表达水平。根据本发明的这个方面的上游区域包括BASB059基因的上游序列。上述上游区域紧接着BASB059基因的上游开始，并且从起始密码子ATG算起，其延伸的位置通常不超过该基因上游大约1000bp。当基因位于多顺反子序列(操纵子)时，上游区域可以直接开始于感兴趣基因之前，或开始于操纵子中第一个基因之前。根据本发明的这个方面，优选地，改造的上游区域包含一个位于ATG上游500bp到700bp位之间的异源启动子。
因此，本发明在改造的细菌小泡中提供了BASB059多肽。本发明进一步提供了改造的宿主细胞，该宿主细胞产生无生命的基于膜的小泡载体。本发明进一步提供了含有BASB059基因的核酸载体，该BASB059基因具有改造的含有异源调控元件的上游区域。
本发明进一步提供了根据本发明的宿主细胞和细菌小泡的制备方法。
本发明也提供了组合物，尤其是疫苗组合物，和方法，上述组合物和方法含有本发明的多肽和/或多聚核苷酸，以及免疫刺激的DNA序列，例如在Sato，Y.等Science 273352(1996)中所描述的序列。
本发明也提供了将所描述的多聚核苷酸或其特定的片段应用于多聚核苷酸构建体的方法，上述多聚核苷酸构建体用于在感染脑膜炎奈瑟氏球菌的动物模型中进行基因免疫实验，上述多聚核苷酸或其特定的片段编码细菌细胞表面蛋白的非-可变区域。这样的实验在鉴定可能引起预防或治疗免疫应答的蛋白表位上特别有用。有人认为上述方法为随后的特定用途的单克隆抗体的制备作了准备，该单克隆抗体源自成功地抵抗或清除感染的动物的必要器官，该单克隆抗体用于开发哺乳动物细菌感染的预防制剂或治疗方法，上述细菌感染尤其指脑膜炎奈瑟氏球菌感染，上述哺乳动物尤其指人类。
本发明也包括一种疫苗制剂，它包含本发明的免疫原性的重组多肽和/或多聚核苷酸和合适的载体，例如药用上可接受的载体。因为多肽和多聚核苷酸在胃中可以被分解，因此优选地，它们通过非肠道途径施用，包括，例如，皮下的、肌肉内的、静脉内的或皮内的施用途径。适用于非肠道施用的制剂包括水溶性的和非水溶性的无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物和使该制剂与个体的体液，优选地为血液，等渗的溶剂；还包括水悬浮的和非水悬浮的悬浮液，它们可以含有悬浮制剂或稠化剂。该制剂可以在单一剂量或多剂量的容器中提供，例如在密闭的安瓿和小瓶中，并且在冻干的条件下储存，只需要在使用之前加入无菌的液体载体。
本发明的疫苗制剂还可以包括佐剂系统以增强该制剂的免疫原性。优选地，该佐剂系统优先引起TH1型的免疫应答。
免疫应答可以被大致区分为两中极端的类型，体液或细胞介导的免疫应答(经典特征分别为受体和细胞效应器保护机制)。这些应答在分类学上分别被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
极端的TH1型免疫应答的特征为产生抗原特异的、单元型限制的细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤细胞应答。在小鼠中TH1型应答的特征经常为IgG2a亚型的抗体的产生，而在人类中这些相应于IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征为产生许多同种型的免疫球蛋白，在小鼠中包括IgG1，IgA和IgM。
有人认为产生这两种免疫应答背后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的体液免疫应答。
TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上，在一个个体中维持的免疫应答被描述为主要TH1型或主要TH2型。但是，按照Mosmann和Coffman在鼠类CD4+veT细胞克隆的描述来考虑细胞因子家族经常是便利的(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞导致不同功能特性的淋巴因子分泌的不同模式。免疫学年鉴(TH1 and TH2 cellsdifferent patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties.AnnualReview of Immunology)，7，p145-173)。通常来说，TH1型的应答是与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子的产生相关的。其它与TH1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子，如IL-12，不是由T细胞产生的。相反，TH2型的应答是与IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相关的。
已知某些疫苗的佐剂特别适于刺激TH1或TH2型的细胞因子应答。疫苗接种后或感染后，通常免疫应答TH1∶TH2平衡的最好指示包括在用抗原重复刺激后，直接测量T淋巴细胞在体外产生的TH1或TH2细胞因子；和/或测量对抗原特异的抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。
因此TH1型的佐剂为用抗原体外重复刺激时，优先刺激分离的T细胞群产生高水平的TH1型细胞因子，并促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白的发生的佐剂。
能够优先刺激TH1型细胞应答的佐剂在国际专利申请WO 94/00153和WO95/17209中有所描述。
3脱-O-酰基单磷酰基脂A(3De-O-acylated monophosphoryllipid A，3D-MPL)是一种这样的佐剂。这是从GB2220211(Ribi)中得知的。化学上它是具有4，5或6酰基链的3脱-O-酰基单磷酰基脂A的混合物，由Montana的Ribi Immunochem公司制造。优选的3脱-O-酰基单磷酰基脂A形式在欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开。
优选地，3D-MPL的颗粒小得足以通过0.22微米的膜(欧洲专利0 689 454)。每剂量提供的3D-MPL在10μg-100μg之间，优选地在25-50μg之间，其中提供的抗原的通常在2-50μg每剂量。
另一种优选的佐剂包括QS21，它是一种源自Quilla.ja SaponariaMolina的树皮的，经HPLC纯化的无毒成分。这种佐剂可以任选地与一种载体一起，任选地与3脱-O-酰基单磷酰基脂A(3D-MPL)混合。
生产QS21的方法在美国专利第5,057,540中有所描述。
含有QS21的非反应原性制剂先前已有描述(WO 96/33739)。当与抗原配制在一起时，这样的含有QS21和胆固醇的制剂已经被表明是成功的TH1刺激佐剂。
可能是TH1细胞应答的刺激因子的其它佐剂包括免疫调节的寡聚核苷酸，例如WO96/02555中所公开的未甲基化的CpG序列。
不同的TH1刺激佐剂，如上文所描述的那些佐剂，的组合物也被认为是提供