一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法[0002] 当多糖以共价键连接至蛋白载体上时，能将半抗原的多糖转变成全抗原，使得多 糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿，成功 地预防了包括肺炎球菌，流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。[0003] 用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种，如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉 毒素变异体CRM197,以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等；但是，由于不 同蛋白的免疫特性，以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异，动物体免 疫后，对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物，所显现的多糖免疫 原性也不同。由此可见，采用不同技术生产的蛋白载体，合成出来的多糖蛋白结合物的免疫 原性有差异。[0004] 进入动物机体内后，抗原经抗原处理细胞（AntigenProcessCell，APC)处理后 产生表位肽（Epitope) [1]，在和主要组织相容性复合物（Major Histocompatibility Complex，MHC)分子结合后，进而呈现在APC细胞表面，能够被T淋巴细胞识别，这是免疫学 通过实验已经得出的结论。现在知道，一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素：[0005] 第一、适当表位肽的产生；[0006] 第二，和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现；[0007] 第三，识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的Τ细胞的呈现。[0008] 其中，任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。[0009] 用小鼠进行的试验表明，缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合 物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态 性，已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因（Alleles)就可结合至主要组织相容性复 合物，而不是全部表位肽片段。另外，有实验结果显示，由于抗原处理不适当，或者T细胞耐 受性空缺,也会导致免疫响应的缺失。
[0010] 有实验表明，破伤风毒素的表位肽QYIKANSKFIGITEL (称为P2)，可和大量不同的 主要组织相容性复合物ClassII结合，显示其能够被T细胞识别，具有万能免疫原性的特 性，被称之万能表位肽。
[〇〇11] 万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物ClassII分子 的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物ClassII分子随 机的结合可用于开发合成疫苗，因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的 应答。
[0012] 研究表明，P2表位肽由破伤风毒素的830 - 844氨基酸序列组成 (QYIKANSKFIGITEL)。在含有该表位肽的蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被 消化降解。但是，这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC 细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。
[0013] MHC分子是加工后抗原的杂性受体，其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免 疫响应外来抗原的过程中，来呈现其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必须在呈现大量的表 位肽（容许更好的抗原识别，但更多的消耗T细胞储备），和少许表位肽（大量的T细胞储 备，但是少许有效地呈现外来抗原）中达到平衡。也就是说，如果抗原中含有在APC细胞处 理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC结合后，就能够刺激一定量的 T细胞，来建立免疫记忆效应，而这一过程不会消耗过量的T细胞，以避免消耗大量的T细 胞，造成免疫耐受。含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性，这也就解释了为什么破伤 风类毒素具有很强的免疫原性的原因。
[0014] 现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHCClassII单体（haplotype)作 用有限，不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域（印Hopes)来刺激其T细胞。这种T细 胞刺激活性的基因限制阻碍了以合成方法来开发疫苗，而这种方法对于基因上不同的人群 的应用，应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体 MHCClassII分子相关联的T细胞刺激表位肽，提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。 在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽（也称为万能T细胞抗原簇）P2,能够被大多数动物的 MHCClassII分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞，或提供帮助B细胞生 产针对于弱免疫原的抗体，增强机体获得性免疫应答的效应。
[0015] 致病性细菌通常能够表达高分子量，包裹在细菌表面的是荚膜多糖，简称多糖。对 于成人来说，荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制备疫苗；但是，对于小儿，即2 岁以下的婴幼儿，荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示，当用作为抗原时，荚 膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应；但是，并不诱导 IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示，作为疫苗，多糖可以诱导成人生产保护性抗 体，但无法诱导婴幼儿的免疫应答；也就是说，在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后，无第二次 抗体增强响应，也无法诱导持续的T细胞记忆。
[0016] 现代免疫学实验证实，多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于，前者能 够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而形成的多糖蛋白 结合物，在免疫了哺乳动物后，可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分 的IgG抗体。因此，多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG，记忆B细胞的分 化，以及长期存在的T细胞记忆。
[0017] 流行性脑膜炎是细菌性脑脊液炎中唯一能够造成流行的疾病，可引起相当高的 病死率和致残率。流脑从病原体的发现至今已超过100年，呈世界范围发布，全世界每年 流脑病例可达30万到35万，是世界范围的一个严重公共健康问题。流脑由脑膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis,Men)引起。据流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的化学结构，已确定 13个血清群，其中A、B、C、W135、和Y群引起约95%的病例。
[0018] A、C、W135、和Y群的荚膜多糖是良好的免疫原，但多糖疫苗对高发人群一2岁以下 儿童几乎不起作用，这多是由于荚膜多糖是非T细胞依赖性抗原。解决此问题的有效方法 是制备结合疫苗，即将多糖和蛋白载体进行结合，使非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖 性抗原。这种方法可以改变荚膜多糖的抗原性质，诱导出免疫记忆。
[0019] 目前临床上使用的4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗是由赛诺菲生产，该 产品是将4种流行性脑膜炎球菌群，包括A、C、W135和Y分别以共价键连接至破伤风类毒素 蛋白载体上，然后将这4种单价结合物混合配制而成。4价流行性脑膜炎球菌多糖结合疫苗 的临床应用取得了成效，但是，有些群的免疫原性仍然较弱，需要开发出免疫原性更强的产 品来更新。

[0020] 本发明提供了一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法， 结合物中的4种流行性脑膜炎球菌多糖与蛋白载体之间是通过共价键连接，蛋白载体是通 过基因重组构建的大肠杆菌工程菌生产的含有万能表位肽QYIKANSKFIGITEL (简称P2)的 白喉毒素变异体CRM197的A链（简称P2CRM197A)，4价流行性脑膜炎球菌-P2CRM197A结 合物与不带万能表位肽P2的蛋白载体合成的4价流行性脑膜炎球菌多糖-CRM197A结合物 比较，该结合物的流脑多糖抗体滴度提高了 3 - 5倍。
[0021] 本发明采取的技术方案如下：
[0022] -种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，包括如下步 骤：
[0023] 步骤一：在白喉毒素变异体CRM197的A链（简称CRM197A)中加入万能表位肽 QYIKANSKFIGITEL (简称P2)，通过基因重组工程菌来生产含有P2的CRM197A蛋白载体（简 称 P2CRM197A);
[0024] 步骤二：将4种不同群的流行性脑膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通过共价 键分别与P2CRM197A蛋白载体连接形成4种单价流行性脑膜炎球菌多糖-P2CRM197A结合 物；
[0025] 步骤三：将步骤二获得的4种单价流行性脑膜炎球菌多糖-P2CRM197A结合物进 行混合得到免疫原性增强的4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物。
[0026] 进一步，在所述P2CRM197A中含有X个P2，l彡X彡3。
[0027] 进一步，在所述P2CRM197A蛋白载体中，P2连结在CRM197A蛋白的N -末端或C -末端，或者同时连接在N -末端和C -末端。
[0028] 进一步，所述P2与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。
[0029] 进一步，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
[〇〇3〇] 进一步，所述流行性脑膜炎球菌多糖是通过分别培养4个不同群的流行性脑膜炎 球菌获得的荚膜多糖。
[0031] 下面举例说明本发明的具体实施方法，但不局限于以下实例。
[0032] 本发明用基因重组的方法，在大肠杆菌工程菌表达系统中，对CRM197A蛋白载体 和带有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体进行表达并纯化；然后，将4群流行性脑膜炎球 菌荚膜多糖（简称Men)共价键地连接至P2CRM197A蛋白载体，制备出Men - P2CRM197A结 合物；将四种单价多糖蛋白结合物混合配制成疫苗后，免疫小白鼠，采血获得免疫血清；用 ELISA方法检测小白鼠血清中的多糖特异性抗体滴度，以评估多糖蛋白结合物的免疫原性。
[0033] 步骤一：蛋白载体和流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备
[〇〇34] 为说明本发明的有效性，制备了两种载体蛋白，即含有P2的蛋白载体P2CRM197A 和不含P2的蛋白载体CRM197A。其中，CRM197A蛋白载体是用于合成对照用4价流行性脑 膜炎球菌多糖-CRM197A结合物样品。
[0035] 一、CRM197A蛋白载体和P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0036] 1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0037] 白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达，在细菌胞浆中 存在形式为多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62, 000道尔顿。其氨基酸序列如下：
[0038] MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSS LSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAG ANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVD IGFAAYNFVES11NLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVED S11RTGFQGESGHDIKITAENTPLPI AGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISS DSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0039] 当分泌至细菌体外前，多肽N -末端的25个引导氨基酸序列被切除掉，变成了由 535个氨基酸组成、分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外，其氨基酸序列如下 ：
[0040] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEH GPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKT TAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNR PAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNG RKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFF EIKS
[0041] 分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链，其间由一个二硫键连接而形成 一个蛋白分子，这两个多肽链具有不同的功能。A链为白喉毒素蛋白分子的N-末端片段， 分子量为21kD，由193个氨基酸组成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通过在真核生物 细胞浆内，将二磷酸三腺苷核糖（ADP - Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶（NAD+)部分转移至延 伸因子2(ElongationFactor - 2, EF - 2)上，从而抑制细胞中的蛋白质合成，进而抑制细胞 生长，造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大约为37kD，由342 个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体，将白喉毒素吸附在敏感细胞 上，帮助A链进入细胞内。
[0042] 白喉毒素的A链具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：
[0043] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0044] 研究发现[3]，由于β噬菌体上的毒素基因 tox的突变，对于噬菌体的复制没 有影响；但是，合成出来的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突变体 (CrossReactingMaterial，CRM)，但是白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关 联。比如，白喉毒素突变体CRM197,无白喉毒素的毒性，从氨基酸序列分析来看是由于A链 中的第52位氨基酸，由甘氨酸（Gly)突变成谷氨酸（Glu)，其氨基酸序列如下：
[0045] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0046] 试验研究表明，与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较， 白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下一些优势，如其免疫原性和白喉毒素及白喉 内毒素相关联，分子量小，水溶性高，易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素 疫苗的临床使用，已经证明其安全性和有效性。
[0047] 2、含有P2万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0048] 将万能表位肽P2连接至CRM197A蛋白载体上，构建出一种新的用于合成多糖蛋白 质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽P2可连接至CRM197A蛋白载体的N -末端或C -末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N -末端或C -末端； 另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至CRM197A蛋白载体N -末端或者 C -末端；还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C -末端或者N -末端，两个自身连接的 万能表位肽连接至另一端。
[0049] 2 - 1、含有万能表位肽P2的P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0050] 2 - 1 - 1、P2 - N -末端CRM197A蛋白载体（称为P2 - CRM197A)氨基酸序列的设计
[0051] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的N -末端，形 成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0052] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD W
[0053] KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPL
[0054] MEQVGT
[0055] EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGN RVRR
[0056] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连 接，以此方法构建的蛋白称为P2 - CRM197A蛋白载体。
[0057] 2 - 1 - 2、CRM197AC -末端-P2蛋白载体（称为CRM197A - P2)氨基酸序列的设计
[0058] 通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形 成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0059] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVD NENPLSGKAGGWKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF ⑶ GASRWLSLPFAEGSS SVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0060] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连 接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A - P2蛋白载体。
[0061] 2 - 1 - 3、P2 - N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白载体（称为 P2 - CRM197A - P2) 氨基酸序列的设计
[0062] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0063] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0064] 在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端之间插入了 GSGSG片 段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2 - CRM197A - P2蛋白载体。
[0065] 2 - 1 - 4、P2P2 - N -末端 CRM197A 蛋白载体（称为 P2 - P2 - CRM197A)氨基酸序列 的设计
[0066] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋 白载体的N -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0067] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRR
[0068] 在两个自身连接的P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N -末端间插 入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2 - P2 - CRM197A蛋白载体。
[0069] 2 - 1 - 5、CRM197AC -末端-P2P2 蛋白载体（称为 CRM197A - P2 - P2)氨基酸序列 的设计
[0070] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋 白载体的C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0071] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKA NSKFIGITEL
[0072] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入 了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A - P2 - P2蛋白载体。
[0073] 2 -1 -6、P2P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2 蛋白载体（称为 P2 -P2 -CRM197A -P2) 氨基酸序列的设计
[0074] 通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋 白载体的N -末端；另外，将一个P2加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的 蛋白，其氨基酸序列如下：
[0075] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVD SIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKEL GLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMA QACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0076] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入 了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197AP2蛋白载体。
[0077] 2 -1 -7、P2 -N -末端 CRM197AC -末端-P2P2 蛋白载体（称为 P2 -CRM197A -P2 -P2) 氨基酸序列的设计
[0078] 通过将一个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL连接至CRM197A蛋白载体的N -末 端；另外，将两个P2进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一 种新的蛋白，其氨基酸序列如下：
[0079] QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDD WKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR FGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0080] 在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入 了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白载体。
[0081] 二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0082] 1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0083] 从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，确定CRM197蛋白的A 链片段，CRM197的氨基酸1 - 193为CRM197的A链片段。以此为依据，对该片段的氨基酸 的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用Ndel 酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点GGATCC。经过CRM197A的基因序列进行分析， 在序列内，无 Ndel及BamHI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下：
[0084] CATATG
[0085] GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0086] CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0087] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0088] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0089] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0090] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0091] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0092] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0093] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0094] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0095] GGATCC
[0096] 将空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Ndel酶和BamHI 酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒， 并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21 (DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞 内，筛选克隆。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于_20°C 以下冰箱中。
[0097] 2、含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0098] 2 - 1、P2 - CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0099] 采用自制的空白表达质粒，用Ndel酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点 GGATCC。经过P2CRM197A蛋白载体基因序列进行分析，在序列内，无 Ndel及BamHI酶切位 点。P2 - CRM197A基因合成全序列如下：
[0100] CATATG
[0101] CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC
[0102] GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0103] ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0104] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0105] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0106] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0107] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0108] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0109] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0110] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0111] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA
[0112] GGATCC
[0113] 将空白质粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和 BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达 质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化 至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建 立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0114] 2 - 2、P2 - CRM197A - P2蛋白载体表达质粒的构建
[0115] 采用自制的表达质粒，用Ndel酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点GGATCC。 经过P2 - CRM197A - P2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无 Ndel及BamHI酶切位点。 P2CRM197AP2基因合成全序列如下：
[0116] CATATG
[0117] CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC
[0118] GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT
[0119] ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA
[0120] GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT
[0121] GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG
[0122] GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA
[0123] ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG
[0124] GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT
[0125] GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA
[0126] GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA
[0127] TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAAGGCTCGGGCTCTGGCCAA
[0128] TACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTG
[0129] GGATCC
[0130] 将空白质粒和合成的P2 - CRM197A - P2基因的PCR产物中，分别加入Ndel酶和 BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达 质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化 至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建 立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0131] 2 - 3、CRM197A - P2、P2 - P2 - CRM197A、CRM197A - P2 - P2、P2 - P2 - CRM197A - P2、 以及P2 - CRM197A - P2 - P2蛋白载体表达质粒的构建
[0132] 方法和上节"2 - 1、P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建"相同。
[0133] 三、含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备
[0134] 实验结果表明，CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的特性 相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有P2万能表位肽的CRM197A蛋白载体 为例说明方法。
[0135] 1、表达含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体工程菌的制备
[0136] 用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行 表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作 种子库。
[0137] 2、含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵
[0138] 从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中，取出一支含有万能表位肽P2CRM197A 蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基 中，在37°C，摇速为180rpm的摇床中培养至0D_ = 1. 0左右；将菌液无菌接种至1升的培 养基中，在37°C，摇速为180rpm的摇床中培养至0D_ = 1. 0左右；接种种子液至50升发 酵罐中的20升培养基中，在37°C下，240rpm条件下进行发酵，当0D6(?至7 -8时，加入IPTG 诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。
[0139] 3、含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体的纯化
[0140] 由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体，实验表明，尽 管加入了万能表位肽，但对蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CRM197A蛋白载体的 工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化方 法。
[0141] 称重50g湿菌体于2升离心杯中，加入300mllxPBSpH7. 0的缓冲液混悬菌体，在磁 力搅拌器上搅拌混勻30min ;在4°C下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤 两次；加入300mllxPBSpH7. 0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4°C下，lOOOOrpm，离 心20min，收集沉淀，弃上清液；加入300mll XPBSpH7. 0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min ; 在4°C下，4000rpm，离心20min，弃上清液，收集包涵体；加入900ml变性缓冲液至洗漆后的 包涵体，在25°C下，lOOOOrpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6 -8KD 透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透 析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8 - 10小时；将透析袋转 入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室 温搅拌透析8 -10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透 析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8 - 10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过 夜；取lml透析液，室温12000rpm离心10min,收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至 预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一 步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析 袋中，在0. 15M的氯化钠中透析，完成后转移至4°C下储存待用。
[0142] 四、流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备
[0143] 1、种子库的建立
[0144] 由赠送获得的流行性脑膜炎球菌A、C、Y、和W135群菌株作为原始种子株建立主种 子库和工作种子。由于这4群脑膜炎球菌的培养特性相同，在这里同一叙述方法。
[0145] 取出原始种子的种子管，加入0. 5ml的流脑培养基将菌种混匀，取0. 25ml菌液接 种至l〇ml流脑培养液中。接种后的培养液管置于36°C ±1°C的培养摇床上，摇速120rpm， 培养12 - 20小时。待0D_至1. 0时，用接种环将菌液接种至流脑琼脂培养基平皿上，置于 36°C ±1°C的培养箱内培养12 - 20小时。用接种环将接种的流脑琼脂培养平皿上的1至 数个菌落接种于l〇ml的流脑培养液中，置于36°C ±1°C，在培养摇床上培养12小时，摇速 150 -200rpm。培养液中细菌0D_长到1. 0,取出5ml菌液接种到200ml的新鲜流脑培养液 中，置于36°C ±1°C的培养摇床上培养12小时左右，摇速150 -200rpm。0D6QQ至1.0时，将 细菌培养液以lml分装于200个小试管中，离心（4000rpm，lOmin)，去除上清培养液，然后 加入0. 5ml的新鲜的流脑培养液和0. 5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。 真空冻干，编号，作为主种子批保存于4°C冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方 法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜流脑培养液中，置于36°C ±1°C的培养摇床上 培养12小时，内培养12小时左右，摇速150 - 200rpm。待0D6QQ至1. 0时，将细菌培养液以 lml分装于200个小试管中，离心（4000rpm，lOmin)，去除上清培养液，然后加入0. 6ml的新 鲜流脑培养液和〇. 4ml的40%甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于-70°C 低温冰箱中。
[0146] 2、细菌发酵
[0147] 将流行性脑膜炎球菌工作种子接种到平皿培养基上，在36. 5°C培养箱过夜。取一 个流脑菌斑，接种到5毫升的新鲜流脑培养液中，在36. 5°C和300rpm细菌培养摇床培养。 当接种的培养液达到了指数生长中期，0D为0. 6 -1. 0,将菌液转接到250毫升培养瓶中，其 中有45毫升的新鲜流脑培养液，在36. 5°C和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液 达到了指数生长中期，OD为0. 6 -1. 0,将菌液转接到4升培养瓶中，其中有1升的新鲜流脑 培养液，在36. 5°C和300rpm细菌培养摇床培养。当菌液达到了指数生长中期（约10 - 12 小时），OD为0.6 - 1.0,将菌液转接到发酵罐中，其中有20升的新鲜流脑培养液。当细菌 达到指数生长中期时，加入新鲜流脑培养液和补充培养液，培养了 20小时停止发酵。
[0148] 3、多糖纯化
[0149] 将流脑菌液离心沉淀的菌体，悬浮在2升的蒸馏水中，用磁力搅拌器混匀。加入 200ml的12% Deoxycholatesodium溶液入细菌悬浮液中，搅拌混勻30分钟，然后转入到 10°C ±3°C冷柜中搅拌8-24小时，保证菌体完全裂解、多糖释放出来。用50%的醋酸调 节细菌裂解液的pH值到6.4-6.8,温度为20°C ±5°C，停止搅拌，静置12-24小时。以 10, OOOrpm离心1小时，收集上清液，丢弃沉淀物。用0. 05M的磷酸盐pH7. 0透析多糖上清 液。加入等体积的〇. 2% HB溶液，用磁力搅拌器混匀30分钟，然后，转入到4°C冷柜中静置 过夜。以10, OOOrpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液，加入100ml的0. 5M氯化钠溶液溶 解沉淀；加入680ml无水乙醇，混匀，然后，转入到4°C冷柜中静置过夜。以10, OOOrpm离心 30min，收集上清液，丢弃沉淀，加入5. 2升无水乙醇，混匀，然后，转入到4°C冷柜中静置过 夜。以10, OOOrpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液，加入500ml的蒸馈水溶解沉淀，透析。 冻干。
[0150] 步骤二：四种流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物的制备
[0151] 本发明采用ADH法来合成流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物，该方法分两 个步骤，即多糖的衍化和结合物合成。
[0152] 一、流行性脑膜炎球菌A群多糖-P2 -CRM197A结合物（称为MenA -P2 -CRM197A) 的合成
[0153] 1、流行性脑膜炎球菌A群多糖衍化
[0154] 将20mg的MenA多糖用4ml纯水溶解后，加入溴化氰进行活化。向反应液中加入 10ml的ADH溶液，最终浓度为0. 4M，在2?8°C混合反应过夜。将反应液在0. 2mol/L氯化 钠溶液中透析。将反应液上样G-50柱，收集外水体积峰。将结合物溶液至于透析袋中，用 纯水透析，冷冻真空干燥，得到固体的衍化多糖。多糖衍生物应保存在-20°C或以下。
[0155] 2、流行性脑膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A结合物的合成
[0156] 称取5mg衍化MenA多糖至反应瓶中，加入0. 5ml的0. 15MNaCl至反应瓶中，搅拌溶 解多糖，先在室温下，然后转至4°C下过夜，以保证多糖溶解完全，溶液中多糖浓度为20mg/ ml。用0. 45 μ m膜无菌过滤多糖溶液至反应瓶，用0. lMNaOH或者0. 1MHC1调节pH值至5. 5。 加入相当于5mg的P2CRM197A溶液至反应瓶中，搅拌混匀。加入2. 9mg的EDC至培养瓶中。 在室温下搅拌反应4小时。转移反应混合液至透析袋（MWC06 - 8000)，用0. 15MNaCl溶液， 4°C下透析，换液三次。上样SepharoseCL -4B纯化，收集外水体积峰。根据分析结果，合并 结合物峰值管。无菌过滤，储存在4°C下待用。
[0157] 3、其它单价流行性脑膜炎球菌多糖-P2 - CRM197A结合物的合成
[0158] 参照上节"流行性脑膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A结合物的合成"方法 来合成其它三种结合物，包括流行性脑膜炎球菌C群多糖-P2 -CRM197A结合物（称 为MenC-P2 -CRM197A)、流行性脑膜炎球菌W135群多糖-P2 -CRM197A结合物（称为 MenW135 - P2 - CRM197A)、以及流行性脑膜炎球菌Y群多糖-P2 - CRM197A结合物（称为 MenY - P2 - CRM197A)〇
[0159] 二、其它含有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体的4种流行性脑膜炎球菌多糖 CRM197A结合物的合成
[0160] 参照"流行性脑膜炎球菌A群多糖-P2 - CRM197A结合物的合成"方法，用其它六 种含有万能表位肽的蛋白载体，包括CRM197A - P2、P2 - CRM197A - P2、P2 - P2 - CRM197A、 CRM197A - P2 - P2、P2 - P2CRM197A - P2、P2 - CRM197A - P2 - P2、以及对照样品合成用 蛋白载体 CRM197A，合成了其它结合物，即 MenA - CRM197A - P2、MenC - CRM197A - P2、 MenW135 -CRM197A -P2、MenY -CRM197A -P2 ;MenA -P2 -CRM197A -P2、MenC -P2 -CRM197A -P2、 MenW135 - P2 - CRM197A - P2、MenY - P2 - CRM197A - P2 ;MenA - P2 - P2 -CRM197A、 MenC - P2 - P2 - CRM197A、MenW135 - P2 - P2 - CRM197A、MenY - P2 - P2 - CRM197A ; MenA - CRM197A - P2 - P2、MenC - CRM197A - P2 - P2、MenW135 - CRM197A - P2 - P2、 MenY - CRM197A - P2 - P2 ;MenA - P2 - P2 - CRM197A - P2、MenC - P2 - P2 - CRM197A - P2、 MenW135 - P2 - P2 - CRM197A - P2、MenY - P2 - P2 - CRM197A - P2 ;MenA - P2 - CRM197A - P2 - P2、 MenC -P2 -CRM197A -P2 -P2、MenW135 -P2 -CRM197A -P2 -P2、MenY -P2 -CRM197A -P2 -P2。
[0161] 步骤三、4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物配制及免疫原性的评估
[0162] 一、4价流行性脑膜炎球菌多糖-P2 - CRM197A结合物的配制
[0163] 用 Millipore 的 Labscale 超滤系统将制备的 MenA - P2 - CRM197A、 MenC - P2 - CRM197A、MenW135 - P2 - CRM197A、以及 MenY - P2 - CRM197A 结合物溶液浓缩至 多糖浓度大约为1000 μ g/ml，然后用0. 85 %的NaCl溶液稀释并混合至每个群多糖浓度为 100 μ g/ml的4价流行性脑膜炎球菌多糖-P2 -CRM197A结合物（称为4Men -P2 -CRM197A)， 用0. 22μπι膜除菌过滤，加入无菌磷酸铝佐剂，最终浓度为125mg/ml，置于2 -8°C冰箱中储 存待用。
[0164] 按照以上方法分别配制其它4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物：
[0165] 4Men - CRM197A - P2、4Men - P2 - CRM197A - P2、4Men - P2 - P2 - CRM197A、 4Men - CRM197A - P2 - P2、4Men - P2 - P2 - CRM197A - P2、以及 4Men - P2 - CRM197A - P2 - P2 结合物。
[0166] 二、免疫动物
[0167] 取5 - 6周的KM57系小鼠240只，每支小鼠免疫注射制备的7种Men - P2CRM197A 结合疫苗，注射容量为〇. lml/支小鼠/次。每种结合疫苗设定为三组，即免疫注射一针、二 针和三针。
[0168] 采集小鼠血液至离心管，在室温下静置2小时，在lOOOOrpm条件下离心10分钟， 用移液枪小心吸取离心上清血清，储存于4°C冰箱中，待检。
[0169] 三、ELISA法检测小鼠血清中流脑多糖抗体IgG滴度及结合物免疫原性的评估
[0170] 配制特定血清群流脑荚膜多糖储备液lmg/ml (1XPBS溶液中），存储于冰箱。用包 被缓冲液稀释至4 μ g/ml，加100 μ 1包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育 过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100 μ 1封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液 洗4次，可在4°C下保存一周。
[0171] 将小鼠免疫结合疫苗及对照样品获得的待测血清，以1:10稀释成工作样品血清， 稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200 μ 1，从第一排开始向下进行二倍系 列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100 μ 1碱性磷酸酶标记羊抗鼠 抗体（1:2000稀释），在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100 μ 1磷酸-4 -硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘。
[0172] 下表为小鼠结合物免疫血清中多糖IgG抗体滴度结果表：
[0173]