专利名称：脑膜炎球菌疫苗及其制备方法图1和图2。关于A群脑膜炎球菌多糖的制备方法的细节，参考中国生物制品规程2000年版。C群脑膜炎球菌多糖的制备细节与A群脑膜炎球菌多糖的制备方法相同。本发明所用B群脑膜炎外膜蛋白可以使用已知方法制备，例如卢锦汉，医学生物制品学，人民卫生出版社，1995年，380页中公开的方法。进一步而言，可以对B群脑膜炎外膜蛋白进行进一步分离，使用含1类、2类或者1类、3类外膜蛋白作为载体。所以，本发明的一个方面是提供了一种新颖的B群脑膜炎外膜蛋白制备方法。该方法采用罐液体培养，连续离心而获得B群菌体再采用LiCl抽提获得B群脑膜炎外膜蛋白，经乙醇沉淀，离心超滤，柱层析而获得B群外膜蛋白。此处公开的B群脑膜炎外膜蛋白的制备方法与卢锦汉公开的方法截然不同(参考，卢锦汉，医学生物制品学，人民卫生出版社，1995年，380页)。本发明所提供的B群脑膜炎外膜蛋白的制备方法的特点在于离心速度低，步骤相对简单，并且对于B群脑膜炎外膜蛋白进行了分离。B群脑膜炎球菌外膜蛋白包括5种，分别是1类、2类、3类、4类和5类外膜蛋白。其中1类外膜蛋白是B群脑膜炎球菌亚型分类的基础，是一种44,000-47,000 Dolton的热稳定蛋白。2类或3类外膜蛋白是不能同时存在于同一菌株，分子量均为37,000-42,000 Dolton的热稳定蛋白，常以三聚体形式存在，可诱导特异性抗体产生。4类和5类外膜蛋白对于诱导特异性抗体的产生作用不大。所以本发明的一个特点在于对B群脑膜炎外膜蛋白进行分离。图3是B群脑膜炎球菌外膜蛋白的柱层析图，可以看到主要有三个峰。在本发明中，可以使用三个峰中的洗脱溶液中群脑膜炎球菌外膜蛋白的作为载体。优选实施方案中，采用峰1和峰2的洗脱物作为载体，也即优选使用1类、2类或者1类、3类外膜蛋白作为载体。本发明采用溴化氰(CNBr)活化A、C群多糖，以己二酰肼(ADH)为双功能亲核间隔基，使之形成多糖己二酰肼衍生物，再通过碳二亚胺(EDAC)介导的缩合作用与B群外膜蛋白共价结合，分别获得A、C群多糖-B群外膜蛋白结合物，再经超滤浓缩，柱层析而获得高分子量偶联物，稀释分装而成结合疫苗。本发明提供的组合疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖，它们分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合。虽然B群脑膜炎球菌外膜蛋白在本发明中主要作为载体发挥作用，但是它的作用也许超出了普通载体的作用，因为它本身是来源于B群脑膜炎球的高分子物质，具有一定的免疫原性，可能会对逐年增加的B群脑膜炎球菌疾病产生预防作用。因此，B群脑膜炎球菌外膜蛋白在本发明的疫苗中的作用不应该等同于已有技术的公开。进而言之，可以理解的是，本发明的疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖、C群脑膜炎球菌荚膜多糖和B群脑膜炎球菌外膜蛋白，其中A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白结合。优选地，本发明提供的组合疫苗包括A群脑膜炎球菌荚膜多糖和C群脑膜炎球菌荚膜多糖，它们分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白中的1类和2类或者1类和3类外膜蛋白共价结合。应该理解的是，在本实施方案中，组合疫苗中作为载体的B群脑膜炎球菌外膜蛋白主要成份是含有1类和2类或1类和3类的外膜蛋白。
如上所述，在多糖和蛋白形成偶联物的过程中，可以由单个A群多糖或C群多糖经活化后可能有多个位点同时结合多个B群脑膜炎球菌外膜蛋白。同样也可以由活化后的单个B群脑膜炎球菌外膜蛋白的多个位点同时结合多个A或C群多糖。多糖和蛋白的结合并不限定于11，也就是一个多糖分子上可以偶联上1个或者多个蛋白；同样地，一个蛋白分子上可以偶联上1个或者多个多糖分子。在多糖和蛋白的偶联中，优选发生多糖和蛋白的一一对应的结合。但是如上所述，多糖和蛋白的各种结合只要并不影响本发明的结合疫苗所能达到的效果，那么所有这些偶联中的细节变化均应包括在本发明范围之内。
多糖与蛋白的偶联有多种已知的方法，在此所述的偶联方法仅仅是用于说明。所以，可以采用各种等同的方法实现本发明所述的偶联过程，因此任何用于分子偶联的方法和工艺或者过程都有可能用于实施本发明。
在本发明的疫苗中，A群、C群脑膜炎球菌结合疫苗的动物试验每剂免疫剂量为含有A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖各1.25-2.5g，优选地所述A和C群脑膜炎球菌荚膜多糖在所述结合疫苗的每剂人用免疫剂量中各有5-20g。当然，根据免疫对象的体质状况可以有所变化。至于用量的上限，本领域的技术人员可以根据疫苗使用的常规实践灵活掌握。
并且，在本发明的疫苗中可以进一步添加吸附剂，例如氢氧化铝和/或磷酸铝等铝佐剂。使用时，可以对本发明的结合疫苗进行稀释，合适的稀释液的不限定的实例有缓冲生理盐水稀释液。
本发明的疫苗可以采用常规接种方式，例如腹腔接种、肌肉或皮下接种等。腹腔接种较麻烦，安全性较差，故优选肌肉或皮下接种方式。免疫接种推荐使用三针。
本发明对现有商业化多糖疫苗在下列方面进行了改进1、更少的反应原性本发明的疫苗中没有掺入蔗糖或明胶等稳定剂，从而减少了现有疫苗的反应原性。
2、本方法选择适宜的超滤膜超滤抗原，并采用柱层析法纯化获得的高分子量偶联物，从而提高了抗原的免疫原性。
3、提高了免疫效力本发明由于将脑膜炎球菌多糖抗原转变为T细胞依赖性抗原，能诱导出免疫记忆反应，再次免疫接种能起到加强免疫的效应。
4、将疫苗接种人群扩展到两岁以下的儿童和婴幼儿本发明的疫苗对两岁以下的儿童和婴幼儿能提供良好的免疫保护力，诱导免疫记忆反应，并可维持长期的免疫保护作用。
5、对现有免疫程序中的疫苗无干扰性本发明的疫苗没有选破伤风类毒素、白喉类毒素和/或突变的无毒白喉毒素(CRM197)作为载体蛋白载体，就避免了对现有免疫程序中的疫苗效果(例如百白破疫苗)的干扰性。
6、选择B群脑膜炎球菌外膜蛋白作为载体蛋白，也是基于在世界范围内B群脑膜炎球菌发病率逐年升高，且截止目前尚无相应的有效疫苗。B群脑膜炎球菌外膜蛋白除具有载体蛋白功能外，还可产生足够的抗B群脑膜炎球菌抗体，对B群脑膜炎球菌的感染能起到一定的预防作用。
7、本发明的B群脑膜炎球菌外膜蛋白制备、纯化工艺方面有了显著的改进，制备所需设备，人力和物力消耗降低，过程简单，节约时间，并且可以进一步对B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行分离。
总之，至今还没有一种新的脑膜炎球菌A+C群结合疫苗能满足上述优点。而且，本发明所述疫苗的制备方法也有独到之处，克服了已有技术存在的有些问题。
图2、C群脑膜炎球菌荚膜多糖柱层析图，表明其分子量不均一。
图3、B群脑膜炎球菌外膜蛋白柱层析图，其中图中的3个峰，从左到右分别代表1类外膜蛋白、2/3类外膜蛋白和4/5类外膜蛋白。
图4、A群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合物柱层析图。图中的上层峰A群脑膜炎球菌荚膜多糖峰，结合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物为主；下层峰B群脑膜炎球菌外膜蛋白峰，与多糖结合后，分子量随之增大，以V0附近高分子量化合物为主。
图5、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与B群脑膜炎球菌外膜蛋白共价结合物柱层析图。图中的上层峰C群脑膜炎球菌荚膜多糖峰，结合后，分子量增大，以V0附近高分子量化合物为主；下层峰B群脑膜炎球菌外膜蛋白峰，与多糖结合后，分子量随之增大，以V0附近高分子量化合物为主。
实施例1B群脑膜炎球菌外膜蛋白的制备启开B群脑膜炎球菌菌株接种于半综合斜面，扩菌传至第五代液体罐培养，连续离心收集菌体，用0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5MCH3COONa混合物提取外膜蛋白。35-45℃振荡1-3小时。离心4000-8000转/分×1小时，收集上清，继而加乙醇浓度至60-80％沉淀外膜蛋白。用注射溶液复溶后，通过超滤收集400KD过滤液，再经30KD超滤膜浓缩。用SDS-PAGE检测所需1、2类或1、3类外膜蛋白含量。Sephacryl S 200-400层析，收集所需1、2类或1、3类外膜蛋白。检测蛋白含量(Lowry法)、主要成份及1、2类或1、3类外膜蛋白的纯度(SDS-PAGE法)和内毒素含量(鲎试剂法)、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)。
实施例2A群脑膜炎荚膜球菌多糖偶联A群脑膜炎荚膜球菌多糖稀释至4mg/ml加溴化氰活化多糖，23±3℃下作用1-1.5小时，调PH并维持pH9-11，继后加已二酰肼2.5～5mg/mgps，维持pH8-10作用10-30分钟，在2-8℃搅拌10-20小时，透析去除小分子物质，取样测溴化氰残余量，己二酰肼衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺15-25mg/ml混合物，5-15℃作用1-1.5小时，调整PH5-7。偶联原液透析去除小分子物质。300KD膜包超滤浓缩，经Sepharose CL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物(参见图4)，除菌过滤检测磷含量，蛋白含量，计算多糖，蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)。各项检验合格后，待稀释合并、分装。
实施例3C群脑膜炎球菌荚膜多糖偶联C群脑膜炎荚膜球菌多糖稀释至4mg/ml，加溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1-1.5小时，调PH并维持PH9-11，继后加已二酰肼(ADH)2.5～5mg/mg多糖，维持PH8-10，反应30分钟，在2-8℃搅拌10-20小时，透析去除小分子物质。取样测CNBr残余量，ADH衍化率。加等量B群脑膜炎球菌外膜蛋白与多糖混合，加碳二亚胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5-15℃反应1-1.5小时，调PH5-7。偶联原液透析去除小分子物质，300KD膜包超滤浓缩，经SepharoseCL-4B柱层析，收集高分子量的偶联化合物(参见图5)，除菌过滤，检测唾液酸含量，蛋白含量计算多糖，蛋白比值，分子量测定及KD0.3回收率，多糖、蛋白鉴别试验、内毒素含量、无菌试验(见中国生物制品规程2000年版)，各项检定合格后，待稀释，合并、分装。
实施例4不含有佐剂的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗根据A、C群多糖偶联原液测定结果，稀释分装，使每支结合疫苗0.5ml装量，含有A、C群多糖各10μg，并分别测定PH值，NaCl含量，A、C群多糖含量硫柳汞含量，高分子结合物含量，鉴别试验，急性毒性安全试验，鉴别试验，无菌试验，热原质试验，免疫原性试验，合格制品存放于2-8℃存。
实施例5氢氧化铝(佐剂)吸附A、C群脑膜炎球菌结合疫苗稀释、分装根据A、C群脑膜炎球菌偶联物半成品原液多糖测定的含量，以灭菌、无热原的氢氧化铝稀释液稀释疫苗原液。使每剂量含有A、C群多糖各8-14g，氢氧化铝0.6-1.4mg，NaCl 0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀释过程中缓慢加入氢氧化铝稀释液，并充分混匀，使之形成均匀分布的悬浊液。无菌、无热原分装结合疫苗，使每剂量≥0.5ml。
实施例6缓冲生理盐水稀释、分装A、C群脑膜炎球菌结合疫苗根据A、C群脑膜炎球菌偶联物半成品原液多糖测定的含量，以灭菌、无热原的缓冲生理盐水稀释液稀释疫苗原液。使每剂量含有A、C群多糖各8-14g，NaCl0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀释过程中缓慢加入缓冲生理盐水稀释液，并充分混匀，使之形成均匀分布的清亮悬液。无菌、无热原分装结合疫苗，使每剂量≥0.5ml。
实施例7A、C群脑膜炎球菌结合疫苗检测根据A、C群脑膜炎球菌多糖偶联原液测定结果，稀释分装，使每支结合疫苗≥0.5ml装量，含有A、C群多糖各8-14μg，并分别测定高分子结合物含量、PH值，NaCl含量、A、C群多糖含量、硫柳汞含量、鉴别试验、急性毒性安全试验、鉴别试验、无菌试验、热原质试验、免疫原性试验(见中国生物制品规程2000年版)，合格制品存放于2-8℃存。
实施例8A、C群脑膜炎球菌结合疫苗接种剂量比较分别选用SPF级，Balb/c小鼠每组20只，每组小鼠分别皮下接种各含A、C群多糖各5μg、2.5μg，1.25μg，0.625μg的结合疫苗于0、14天各免疫一剂，第21天采血分离血清，用ELISA测定每只小鼠血清的IgG抗体滴度，计算GMT统计学处理，分析接种剂量的影响因素，两次试验结果列于表1。
表1.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗接种剂量比较

两次动物试验结果证实，2.5μg免疫剂量效果较为理想，既节省了抗原量，又达到了较高的抗体滴度。
实施例9A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫途径比较试验分别选用SPF级Balb/C小鼠，每组20只，各接种A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗分别于0、14天各接种一针，第21天采血，分离血清，ELISA测定抗体浓度计算GMT，其免疫途径分别采用皮下，肌肉，腹腔注射。现将两次实验结果列于表2。
表2.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫途径比较

以上三种免疫途径两次实验比较说明，其IgG GMT结果相似，统计学处理无显著性差异P＜0.05。但腹腔接种较麻烦，安全性较差，故可选择肌肉或皮下接种。
实施例10A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫免疫针次比较试验分别选用SPF级Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗，免疫程序为0、14、28天各接种1针，末次免后2周采血，分离血清，测定每只小鼠血清的IgG抗体浓度，计算每组小鼠的GMT，实验结果统计如表3。表3. A、C群脑膜炎球菌结合疫菌免疫针次比较试验

以上结果表明，结合疫苗具有明显的免疫回忆反应，三针免疫后，抗体增长明显，因此，免疫接种推荐使用三针。
实施例11A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究在以上实验工作的基础上进行了A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究，选用SPF Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗于0、14、28天各免疫一针，第42天采血，分离血清，采用ELISA分别测定每只小鼠血清的抗体滴度，并计算GMT，实验结果统计如表4。
表4.A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性研究

实验结果表明A.C群脑膜炎球菌结合疫苗具有较好的免疫原性。
实施例12用氢氧化铝吸附剂和缓冲生理盐水两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较研究选用SPF Balb/c小鼠，每组20只，分别皮下接种两种稀释液配制的含A、C群多糖各2.5μg的结合疫苗于0、14、28天各免疫一针，于免后1、2周分别采血，分离血清，采用ELISA分别测定每只小鼠血清的抗体滴度，并计算GMT，实验结果统计如表5。表5.两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫原性比较

动物试验证明，两种稀释液配制的A、C群脑膜炎球菌结合疫苗均能产生明显的抗体应答和免疫回忆反应。但两者在刺激机体快速产生抗体应答、加强免疫后的回忆反应、抗体滴度及免疫持久性方面有明显差异。
实施例13A.C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性对A.C群脑膜炎球菌结合疫苗的安全性进行考核，分别采用小鼠、豚鼠异常毒性试验法，考核其安全性。
选用豚鼠、腹腔接种10个人用剂量A.C群脑膜炎球菌结合疫苗，分别于免前、免后10天称体重，并随时观察接种反应。
选用SPF级Balb/C小鼠，腹腔接种2个人用剂量A.C群脑膜炎球菌结合疫苗，分别于免前、免后10天称体重，并随时观察接种反应。
实验结果列于表6、表7。
表6.A.C群脑膜炎球菌结合疫苗豚鼠安全性试验


表7.A.C群脑膜炎球菌结合疫苗小鼠安全性试验

急性毒性试验表明A.C群脑膜炎球菌结合疫苗具有可靠的安全性。


本发明涉及一种脑膜炎球菌疫苗及其制备方法。将纯化的A群脑膜炎球菌多糖和C群脑膜炎球菌多糖分别与B群脑膜炎球菌外膜蛋白进行化学偶联而形成单价结合物，再将单价结合物混合配制而成。这种疫苗可以用于预防婴幼儿由A、C群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎及败血症疾病。