专利名称：一种生物抗菌剂及其制备方法与应用的制作方法抗生素是由微生物或高等动植物在生活代谢中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，是一类在很低浓度下可以杀死、抑制或干扰其他微生物的化学物质。同时，抗生素也是一类特殊的化学制剂，自从1929年发现第一种抗生素青霉素以来，至今已找到约一万种新抗生素。我国是抗生素使用大国，据2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测结果显示，我国医院抗菌药物年使用率高达74%。而在美英等发达国家，医院的抗生素使用率仅为22%-25%。进一步的研究表明，中国感染性疾病占全部疾病总发病数的49%，其中细菌感染性疾病仅占20%左右，然而，现今70%的患者在住院期间都使用过至少一 种抗生素，其中外科患者几乎人人都用抗生素，比例高达97%，也就是说绝大部分病例都存在滥用抗生素的问题。这种近乎畸形的抗生素使用率使得各种耐药菌种层出不穷，许多菌株对于青霉素的耐药性接近100%。这使中国成为世界上滥用抗生素问题最为普遍，也最为严重的国家之一，每年超过8万人直接或间接死于滥用抗生素。此外，传统的抗生素疗法虽然对于特定菌株有选择性，但对于体内的具体的作用位置并不具有靶向性，每经过一次抗生素疗程，都有可能改变体内所有器官的菌落体系，并由此导致各种难以预计的严重后果。针对这一问题，一个可行的解决途径是利用复合纳米材料进行体内特定区域的定位抗菌治疗。一些低毒性的微/纳米尺度的材料，如氧化锌，银等，可以作为现有抗生素疗法的辅助疗法，对抗多种细菌感染，从而降低、甚至避免一系列由抗生素疗法导致的副作用，如发烧、头晕、恶心和过敏性等。然而，尽管目前已有一定篇幅的运用各种纳米颗粒进行体内定位治疗的报道，但很少有报道深入研究过如何提高这些体内抗菌剂的使用效率。许多纳米抗菌剂虽然可以精确固定在指定区域，却不能得到有效的分散，因而难以和致病菌充分接触，在这种情况下，为了保证抗菌效率，就只能增加纳米抗菌剂的投入量。如此一来，不仅增加了患者的痛苦和开销，对其代谢系统也是一份额外的负担。因此，有必要开发一种即可以精确固定在指定区域、又能够在体内长时间保持分散状态的高效生物抗菌剂。
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种既可以精确固定在指定区域又能够在体内长时间保持分散状态的高效生物抗菌剂及其制备方法与应用。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种生物抗菌剂，由乳酸菌、Ag纳米颗粒和磁性Fe3O4纳米颗粒组成，其中，Ag纳米颗粒包覆在磁性Fe3O4纳米颗粒表面组成Ag/Fe304复合纳米颗粒,Ag/Fe304复合纳米颗粒通过氢键负载在乳酸菌表面。本发明所述生物抗菌剂由乳酸菌、Ag纳米颗粒和磁性Fe3O4纳米颗粒组成。其中，乳酸菌作为载体本身密度较低，Ag/Fe304复合纳米颗粒与乳酸菌结合之后使原本密度较高的磁性Ag/Fe304复合纳米颗粒平均密度降低，与含有致病菌的溶液的密度相当，使乳酸菌所负载的磁性Ag/Fe304复合纳米颗粒可以在无需额外分散处理(如震动、搅拌、超声等)的条件下长时间的漂浮在含有致病菌的溶液内，从而与在溶液中漂浮的致病菌充分接触，充分发挥其抑菌、抗菌能力，极大的提高生物抗菌剂对含有致病菌的溶液处理的实际操作中使用的便利性、经济性和普适性。本发明所述乳酸菌表面负载有Ag/Fe304复合纳米颗粒，其中的磁性Fe3O4纳米颗粒可以在磁性作用下自由移动，因此提高了乳酸菌吸附抑菌体系即本发明所述负载有Ag/Fe3O4纳米颗粒的乳酸菌液相移动能力，可以快速有效的集中在选定区域，有利于体内致病菌的紧急、高效处理。小尺寸的银颗粒负载在尺寸较大的四氧化三 铁磁性纳米颗粒表面，使银颗粒与外界的接触面积得以放大。相较于相似尺寸的纯银纳米颗粒，这种Ag/Fe304复合纳米颗粒的排布方式，在保证抗菌性能的同时，大大减少了银的用量，不仅降低了体系的制备成本，而且减少了由银导致的可能的副作用的出现概率。此外，磁性Fe3O4纳米颗粒表面的Ag纳米颗粒的点缀不仅有利于复合纳米颗粒在菌体表面的固定，更显著提升了该体系的抗菌活性，使之在含致病菌的溶液中赢得生存竞争，充分发挥其抗菌、抑菌能力。本发明还提供了所述生物抗菌剂的制备方法为利用反向胶束法在磁性Fe3O4纳米颗粒表面包覆一层银纳米颗粒，形成黑色的Ag/Fe304复合纳米颗粒，利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在Ag/Fe304复合纳米颗粒表面覆盖氨基化基团，然后与乳酸菌发酵溶液充分接触，使乳酸菌表面负载Ag/Fe304复合纳米颗粒。本发明所述制备方法以磁性Fe3O4纳米颗粒为基体制备复合纳米颗粒，所述磁性Fe3O4纳米颗粒的可以通过商业渠道获得或采用现有技术公开的共沉淀法、沉淀氧化法、微乳液法、水热法、机械研磨法、凝聚法、溶胶法等方法制备得到。在一个具体实施方案，本发明所述磁性Fe3O4纳米颗粒为采用共沉淀法，以Fe2+、Fe3+和氨水为主要原料制得。在一个具体实施方案中,所述共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒包括如下步骤a、在氮气保护下，将氨水加入到Fe2+与Fe3+的混合溶液中，使溶液pH值会10，在85 °C下快速搅拌；b、待反应溶液颜色变深后继续搅拌100分钟；C、在外磁场作用下磁力收集溶液中的黑色Fe3O4沉淀，重蒸水洗涤至中性，干燥即得。共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒时，Fe2+与Fe3+的摩尔比直接影响产物的晶体结构。反应的理论摩尔比为Fe2+ :Fe3+=l: 2，但由于二价铁离子容易氧化成三价铁离子，而且还有许多复杂的中间反应和副产物，所以二价铁离子应适当过量，因此，所述Fe2+与Fe3+的混合溶液中Fe2+与Fe3+的摩尔比优选为1:1. 75 2。本发明所述Fe2+和Fe3+可以来源于铁的氯化物、硝酸盐、醋酸盐或硫酸盐。在一个具体实施方案中，Fe2+和Fe3+分别来源FeCl2 4H20和FeCl3 6H20。本发明所述制备方法利用反向胶束法在磁性Fe3O4纳米颗粒表面包覆银纳米颗粒。在具体实施方案中，本发明所述利用反向胶束法在磁性Fe3O4纳米颗粒表面包覆一层银纳米颗粒包括如下步骤I、将Fe3O4纳米颗粒与含有Triton X-100、正己醇和环己烷的油包水微乳液相混合，再掺入硝酸银溶液，反应30分钟；II、加入硼氢化钠溶液，并在室温下搅拌3-8小时，然后加入过量丙酮使溶液中的产物沉淀；III、收集步骤2所得沉淀，乙醇和水洗涤，外置磁场收集黑色沉淀即得。其中，所述含有Triton X-100、正己醇和环己烷的油包水微乳液是指油包水微乳液中含有Triton X-100、正己醇和环己烧三种物质。所述Fe3O4纳米颗粒与Triton X-100、正己醇和环己烷的摩尔比优选为1:14:14:75，所述Fe3O4纳米颗粒与硝酸银的摩尔比优选为 1:12. 5。本发明所述油包水微乳液的使用可以控制最终产物的尺寸大小。在一个具 体实施方案中，所述在磁性Fe3O4纳米颗粒表面包覆一层银纳米颗粒的方法具体为通过机械搅拌的方式，将1001^、401111的四氧化三铁纳米颗粒与含有1.41^ Triton X-100、I. 4mL正己醇和7. 5mL环己烷的油包水微乳液相混合，20分钟后，加入200 y L的0. IM的硝酸银溶液，继续搅拌30分钟。然后加入250 ii L 0.20M的硼氢化钠，在室温下搅拌3-8小时，然后加入过量丙酮使溶液中的产物沉淀，所得沉淀经乙醇和水反复洗涤，通过外置磁场收集即得Ag/Fe3O4复合纳米颗粒。本发明所述制备方法利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在Ag/Fe304复合纳米颗粒表面覆盖氨基化基团。在具体实施方案中，本发明所述利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷在Ag/Fe304复合纳米颗粒表面覆盖氨基化基团的方法具体为将Ag/Fe304复合纳米颗粒与乙醇溶液混合，搅拌2-12h后用水和乙醇洗涤，外置磁场收集即得，其中，所述乙醇溶液含5v/v%3-氨基丙基三乙氧基硅烷和5v/v%水。其中，按g/mL计，所述Ag/Fe304复合纳米颗粒与乙醇溶液的重量体积比优选为I 10。即所述含5v/v%3-氨基丙基三乙氧基硅烷和5v/v%水的乙醇溶液的加入量为每IgAg/Fe3O4 加入 10mL。本发明所述制备方法将氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒与乳酸菌发酵溶液充分接触，氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒表面的氨基同乳酸菌表面的羧化物基团相结合形成氢键，通过Ag/Fe304复合纳米颗粒与乳酸菌之间形成氢键可以使乳酸菌表面负载Ag/Fe3O4复合纳米颗粒。另一方面，乳酸菌表面是一层带负电的半透膜，容易与带正电的Ag/Fe3O4复合纳米颗粒相结合。因此，当氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒和与乳酸菌发酵溶液充分接触，就可以使乳酸菌表面负载Ag/Fe304复合纳米颗粒，得到表面负载有Ag/Fe304复合纳米颗粒的乳酸菌。在一个具体实施方案中每25mL的乳酸菌发酵溶液中加入2mL浓度为0. 01 g/mL的氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒的水溶液。为避免氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒在发酵液中沉积，优选为在速度为200rpm的摇床中进行，且反应时间不少于半小时。本发明通过扫描电镜观察本发明所述制备方法制得的生物抗菌剂，可见乳酸菌的表面负载有许多直径约为150nm的颗粒，通过透射电镜观察乳酸菌的表面负载的颗粒平均直径约为150nm，且颗粒之间的尺寸均一性较好。此外，每个颗粒外部都有一圈颜色较浅的膜状物质，其密度明显低于颗粒中心的金属内核，高分辨电镜检测颗粒金属内核中包含有Fe和Ag两种元素的晶格条纹，结合之前描述的实验方案，可推断该内核为Ag/Fe304复合纳米颗粒。进一步进行相应的XRD分析，根据XRD图谱中Fe和Ag元素对应峰的位置和强度，可知内核中的银元素主要以零价的单质银形式存在，而Fe3O4则在内核中的含量占主导地位。由此可判定乳酸菌表面所负载的颗粒为Ag/Fe304复合纳米颗粒。本发明还提供了上述制备方法制备的生物抗菌剂。本发明所述生物抗菌剂是一种整合有抗菌活性和磁力靶向能力的多功能体系。Ag纳米颗粒的点缀可以提升该体系的抗菌活性；乳酸菌作为载体本身密度较低可以使结合磁性Ag/Fe304复合纳米颗粒平均密度降低，使乳酸菌所负载的磁性Ag/Fe304复合纳米颗粒可以在无需额外分散处理的条件下长时间的漂浮在含有致病菌的溶液内，从而与在溶液中漂浮的致病菌充分接触，可以精确固定在指定区域、又能够在体内长时间保持分散状态，充分发挥其抑菌、抗菌能力。实验表明，本发明所述生物抗菌剂可以长时间的悬浮在较高密度的含致病菌的模拟人体体内复杂且粘稠的混合溶液中，并和溶液中的致病菌充分接触，抗菌活性要明显强于对照组。因此，本发明提供了所述生物抗菌剂在抑制致病菌中的应用。优选的，所述致病菌 为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌或枯草杆菌。图I示本发明所述氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒的透射电镜图和X射线衍射图及本发明所述生物抗菌剂扫描电镜图，其中，(a)为本发明所述氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒的扫描电镜图，其内插图为内核部分的高分辨透射电镜晶格表征；(b)为(a)图所示的本发明所述氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒的X射线衍射图，横坐标为2 9，纵坐标为X射线的强度；(C)为(b)图所示的本发明所述生物抗菌剂的扫描电镜图；图2示Ag/Fe304复合纳米颗粒(I号烧杯)和本发明所述生物抗菌剂(2号烧杯)在含金黄色葡萄球菌的混合溶液中的分散能力对比图，其中，a d为不同时间的分散情况，e和f为在外界磁场的作用下，Ag/Fe304复合纳米颗粒和本发明所述生物抗菌剂的分散情况；图3示用Ag/Fe304复合纳米颗粒和本发明所述生物抗菌剂处理金黄色葡萄球菌的透射电镜图，其中(a)为用Ag/Fe304复合纳米颗粒处理4小时后的金黄色葡萄球菌(30mL)的透射电镜图，(b)用半量的本发明所述生物抗菌剂处理2小时后的金黄色葡萄球菌(30mL)的透射电镜图，红色箭头指向为已经破损的金黄色葡萄球菌，内插图为所选的放大图；图4示经过Ag/Fe304复合纳米颗粒或本发明所述生物抗菌剂处理后的大肠杆菌(E. coli),金黄色葡萄球菌(S. aureus),幽门螺杆菌(H. pylori)以及枯草杆菌(B. subtilis)的存活率统计图，其中，对照组为用Ag/Fe304复合纳米颗粒处理4小时后存活率统计图，试验组为用半量的本发明所述生物抗菌剂处理2小时后存活率统计图，每项实验至少重复三次，图表数据表示为平均值及其相对偏差。

2、将步骤I所得的磁性Fe3O4纳米颗粒与含有Triton X-100，正己醇以及环己烷的油包水(W/0)微乳液相混合，再加入硝酸银溶液反应30分钟，加入硼氢化钠溶液在室温下搅拌3-8个小时，随后加入过量丙酮使溶液中的产物沉淀，经离心分离后，用乙醇和重蒸水反复进行洗涤，最后在外磁场作用下磁力收集溶液中的黑色沉淀，重蒸水洗涤，干燥制得Ag/Fe304复合纳米颗粒；3、将步骤2所得的Ag/Fe304复合纳米颗粒与含5v/v%3_氨基丙基三乙氧基硅烷和5v/v%水的乙醇溶液混合6小时后用二次水和乙醇分别进行洗涤，在外磁场作用下磁力收集氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒；4、在乳酸菌发酵溶液中加入步骤3所得的氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒在200rpm的摇床中培养半小时以上即得。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例I :本发明所述生物抗菌剂的制备取43. IOmLl. 00mol/LFeCl2 4H20 溶液和 43. IOmL I. 75mol/LFeCl3 6H20 溶液混合，在氮气保护下，加入25mL的25%氨水，在85°C下快速搅拌，反应溶液颜色变深，有棕色颗粒生成，继续搅拌100分钟。用强磁铁来沉降颗粒分离上层清液，用蒸馏水反复洗涤沉淀物，至洗涤的溶液pH为7左右。收集沉淀物置于真空干燥箱中，在75°C真空干燥5h得磁性Fe3O4纳米颗粒。将ImL浓度为40mM的磁性Fe3O4纳米颗粒与含有14mL Triton X-100,14mL正己醇以及75mL环己烷的油包水(W/0)微乳液相混合，再加入5mL浓度为0. IM的硝酸银溶液反应30分钟。加入2mL浓度为0. 2M的硼氢化钠溶液，在室温下搅拌3 8个小时。随后加入过量丙酮使溶液中的产物沉淀，经离心分离后，用乙醇和重蒸水各洗涤两次，最后在外磁场作用下磁力收集溶液中的黑色沉淀，重蒸水洗涤2次，收集沉淀物置于真空干燥箱中，在75°C真空干燥5h制得Ag/Fe304复合纳米颗粒；取Ig制得的Ag/Fe304复合纳米颗粒加入到IOmL含5v/v%APTES和5v/v%水的乙醇溶液中，充分搅拌6小时，用乙醇和重蒸水各洗涤两次，然后在外磁场作用下磁力收集溶液中的黑色沉淀，重蒸水洗涤2次，收集沉淀物置于真空干燥箱中，在75°C真空干燥5h制得氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒；用注射器将制得的氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒分散加入到乳酸菌发酵溶液中，在200rpm的摇床中培养40min即得。对制得的氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒进行透射电镜检测和X射线衍射检测，对制得的生物抗菌剂进行扫描电镜图，结果见图I。由图I可见，氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒均直径约为150nm，且颗粒之间的尺寸均一性较好。此外，每个颗粒外部都有一圈颜色较浅的膜状物质，其密度明显低于颗粒中心的金属内核，结合之前叙述的制备流程，可推断外层为Ag-Fe3O4纳米颗粒表面覆盖的氨基化有机高分子层。对颗粒金属内核进行电镜检测，结果可见内核中包含有Fe和Ag两种元素的晶格条纹，分析内核为Ag/Fe304复合纳米颗粒。根据X射线衍射图谱中Fe和Ag元素对应峰的位置和强度，分析认为内核中的银元素主要以零价的单质银形式存在，而Fe3O4则在内核中的含量占主导地位。由本发明图Ic所示生物抗菌剂的扫描电镜图可见，氨基修饰的Ag/Fe304复合纳米颗粒均匀地负载在乳酸菌表面上，同时由于外层氨基的保护作用，内核中的银颗粒在短时间内对作为载体的乳酸菌表面没有太大的破坏作用。实施例2 :本发明所述生物抗菌剂的分散性和抗菌性实验 为了证明本发明所述生物抗菌剂在体内进行靶向性抗菌的潜在优越性。选用含有牛肉蛋白胨(5g/L),葡萄糖(5g/L),琼脂(20g/L)以及复合维生素(10mg/L)的混合水溶液(pH=7. 1，37°C )模拟人体体内复杂且粘稠的液态环境，考察在此条件下，本发明所述生物抗菌剂对于四种常见致病菌(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，幽门螺杆菌和枯草杆菌)的处理能力。在每30mL含菌溶液中，添加5. 4mg的实施例I制得的生物抗菌剂(其中，有效抗菌成分Ag/Fe304复合纳米颗粒的含量约为0. 6mg)，并考查其抗菌活性。同时，选择2倍有效抗菌成分含量(Ag/Fe304复合纳米颗粒的含量I. 2mg)的实施例I制得的Ag/Fe304复合纳米颗粒作为对照组。每组实验至少重复三次，统计结果见图2 4.由图2结果可见，由于Ag/Fe304复合纳米颗粒本身密度较高，即便Ag/Fe304复合纳米颗粒事先均匀分散在含菌液内，也将在短时间内沉积(图2c I号烧杯)，透射电镜观察其抗菌成分难以和溶液中的致病菌充分接触(图3a)，因此，尽管作用时间达到4个小时，但是其相应的抗菌活性并不明显，采用Ag/Fe304复合纳米颗粒处理的致病菌的存活率约为采用本发明所述生物抗菌剂处理致病菌的存活率的两倍(图4对照组)。而本发明所述生物抗菌剂则可以长时间的悬浮在较高密度的含菌混合溶液中(图2d 2号烧杯)，透射电镜观察其有效抗菌成分可以和溶液中的致病菌充分接触(图3b)，因此，尽管作用时间只有2小时，且抗菌成分仅是对照组的一半，但是其相应的抗菌活性要明显强于对照组(图4试验组)。而由图2f可见在外界磁场的控制下，本发明所述生物抗菌剂同样可以方便的进行收集与分离(图2d 2号烧杯)，因此，相较于Ag/Fe304复合纳米颗粒，本发明所述生物抗菌剂可以用于体内的靶向性抗菌。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。


本发明属于生物材料领域，公开了一种生物抗菌剂及其制备方法与应用。本发明所述生物抗菌剂由乳酸菌、Ag纳米颗粒和磁性Fe3O4纳米颗粒组成，其中，Ag纳米颗粒包覆在磁性Fe3O4纳米颗粒表面组成AgFe3O4复合纳米颗粒；Ag/Fe3O4复合纳米颗粒通过氢键负载在乳酸菌表面。Ag纳米颗粒包覆在磁性Fe3O4纳米颗粒表面可以提升抗菌活性，乳酸菌本身密度较低可以使乳酸菌所负载的磁性Ag/Fe3O4复合纳米颗粒可以在无需额外分散处理的条件下长时间的漂浮在含有致病菌的溶液内，从而与溶液中漂浮的致病菌充分接触，可以精确固定在指定区域、又能够在体内长时间保持分散状态，充分发挥其抑菌、抗菌能力。