一种鸡新城疫病疫苗及其制备方法

赵国华, 朱文斌

2003年12月31日

2002年6月12日

2002年6月12日

北京华兴辰光生物技术有限公司

A61K39/17GK1463747SQ02121260

病疫苗 新城疫

1.一种鸡新城疫病疫苗，包括鸡新城疫病毒抗原及冷冻干燥添加剂，其特征在于所述冷冻干燥添加剂基本上由分子量小于等于20WD的普鲁兰和水解胶原蛋白组成2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病疫苗，其特征在于所述冷冻干燥添加剂中还含有海藻糖、抗坏血酸钠、甘露醇、天门冬氨酸钾镁和磷酸氢二钠3.根据权利要求2所述的鸡新城疫病疫苗，其特征在于所述冷冻干燥添加剂各组分的重量份数比为普鲁兰 10-20水解胶原蛋白30-50海藻糖 10-20抗坏血酸钠 9-11甘露醇 30-50天门冬氨酸钾镁 2.4-2.8磷酸氢二钠 0.1-0.44.根据权利要求1所述的鸡新城疫病疫苗，其特征在于所述鸡新城疫病毒抗原与所述冷冻干燥添加剂的比例是鸡新城疫病毒抗原∶冷冻干燥添加剂＝0.5-1∶15.根据权利要求1或2或3或4所述的鸡新城疫病疫苗，其特征在于所述疫苗中还加有免疫佐剂异丙肌苷6.一种生产鸡新城疫病疫苗的方法，包括以下步骤(1)将鸡新城疫病毒抗原及冷冻干燥添加剂混均，分装于投药瓶中，其中，所述冷冻干燥添加剂基本上由分子量小于等于20WD的普鲁兰、水解胶原蛋白、海藻糖和抗坏血酸钠组成；(2)将投药瓶放入冷冻干燥器内，分别在4.8-5.2℃、0.2--0.2℃、-5.8--6.2℃各平衡1小时；(3)快速冻结，将制品温度降至-48--52℃维持3.5-2.5小时；(4)真空干燥；(5)加热干燥，在制品温度达到36.5-37.5℃条件下持续3.5-2.5小时；(6)向投药瓶中充入保护气体，加塞，封口7.根据权利要求6所述的生产鸡新城疫病疫苗的方法，其特征在于所述鸡新城疫病毒抗原是将新城疫病毒低毒力株接种于10日龄无意外抗原、抗体的鸡胚尿囊腔内，37℃孵化繁殖，收取鸡胚尿囊液，在-10℃条件下冷冻过夜后融化，去除沉淀物，收集上清液得到的8.根据权利要求6所述的生产鸡新城疫病疫苗的方法，其特征在于所述冷冻干燥添加剂中还有甘露醇、天门冬氨酸钾镁和磷酸氢二钠；所述冷冻干燥添加剂各组分的重量份数比为普鲁兰10-20水解胶原蛋白 30-50海藻糖10-20抗坏血酸钠9-11甘露醇30-50天门冬氨酸钾镁2.4-2.8磷酸氢二钠0.1-0.4所述鸡新城疫病毒抗原与所述冷冻干燥添加剂的比例是鸡新城疫病毒抗原∶冷冻干燥添加剂＝0.5-1∶19.根据权利要求6所述的生产鸡新城疫病疫苗的方法，其特征在于所述制品中还加有免疫佐剂异丙肌苷，所述免疫佐剂与所述制品的重量份数比为2.5-5∶97.5-9510.根据权利要求6所述的生产鸡新城疫病疫苗的方法，其特征在于所述保护气体为至少一种惰性气体或几种惰性气体的混合物，或惰性气体与空气的混合气体

本发明涉及一种疫苗及其制备方法，特别是涉及一种鸡新城疫低毒力活疫苗及其制备方法目前生产鸡新城疫病疫苗的方法是将新城疫病毒低毒力HB1株、F株、La Sota株、La Sota-clone30株或N79株等标准病毒液，接种于10日龄无意外抗原、抗体的鸡胚尿囊腔内，37℃孵化繁殖定时收取合格的鸡胚尿囊液，作为免疫原，与适量冷冻干燥添加剂混合均匀，定量分装于无菌投药瓶内，经预冻真空加热干燥制成疫苗用上述方法生产疫苗的过程中存在以下几个问题1、尿囊液中的尿酸盐对疫苗的生产过程是不利的与其它无机铵盐对蛋白质的变构作用一样，在冷冻—融化过程中析出的灰色沉淀物，对疫苗的免疫效价与红细胞凝集的强度产生影响，对冷冻干燥疫苗的盐害样作用显著2、疫苗采用真空全加塞轧盖保存，制品与外界环境之间存在着势平衡能，制品的平均残余水分逐渐升高，并较易染菌，因此保质期较短一种鸡新城疫病疫苗，包括鸡新城疫病毒抗原及冷冻干燥添加剂，所述冷冻干燥添加剂基本上由分子量小于等于20WD的普鲁兰和水解胶原蛋白组成为了更好地维持和保护抗原生物的活性，所述冷冻干燥添加剂中还含有海藻糖、抗坏血酸钠、甘露醇、天门冬氨酸钾镁和磷酸氢二钠所述冷冻干燥添加剂各组分的重量份数比为普鲁兰10-20水解胶原蛋白 30-50海藻糖10-20抗坏血酸钠9-11甘露醇30-50天门冬氨酸钾镁2.4-2.8磷酸氢二钠0.1-0.4 所述的鸡新城疫病毒抗原与所述冷冻干燥添加剂的比例是鸡新城疫病毒抗原∶冷冻干燥添加剂＝0.5-1∶1为了提高疫苗的免疫效果，所述疫苗中还加有免疫佐剂异丙肌苷本发明的第二个目的是提供一种生产保质期较长、并具有安全包装的鸡新城疫弱毒活疫苗的方法一种生产鸡新城疫病疫苗的方法，包括以下步骤(1)将鸡新城疫弱毒抗原及冷冻干燥添加剂混均，分装于投药瓶中，其中，所述冷冻干燥添加剂基本上由分子量小于等于20WD的普鲁兰和水解胶原蛋白组成；(2)将投药瓶放入冷冻干燥器内，分别在4.8-5.2℃、0.2--0.2℃、-5.8--6.2℃各平衡1小时；(3)快速冻结，将制品温度降至-48--52℃维持3.5-2.5小时；(4)真空干燥；(5)加热干燥，在制品温度达到36.5-37.5℃条件下持续3.5-2.5小时；(6)向投药瓶中充入保护气体，加塞，封口所述鸡新城疫病毒抗原是将新城疫病毒低毒力株接种于10日龄无意外抗原、抗体的鸡胚尿囊腔内，37℃孵化繁殖，收取鸡胚尿囊液，在-10℃条件下冷冻过夜后融化，去除沉淀物，收集上清液得到的所述冷冻干燥添加剂中还有海藻糖、抗坏血酸钠、甘露醇、天门冬氨酸钾镁和磷酸氢二钠；所述冷冻干燥添加剂各组分的重量份数比为普鲁兰 10-20水解胶原蛋白 30-50海藻糖 10-20抗坏血酸钠 9-11甘露醇 30-50天门冬氨酸钾镁 2.4-2.8磷酸氢二钠 0.1-0.4所述鸡新城疫病毒抗原与所述冷冻干燥添加剂的比例是鸡新城疫病毒抗原∶冷冻干燥添加剂＝0.5-1∶1所述制品中还加有免疫佐剂异丙肌苷免疫佐剂与制品的重量份数比为2.5-5∶97.5-95所述保护气体为至少一种惰性气体或几种惰性气体的混合物，或惰性气体与空气的混合气体本发明由于采用了上述技术方案，因此具有以下优点1、本发明的冷冻干燥添加剂与鸡新城疫病毒的减毒抗原具有极佳的生物相容性普鲁兰(Pullulan)是一种可食用的水溶性多糖；水解胶原蛋白是由蛋白质降解的多肽类物质；海藻糖是微生物类抗应激产物；抗坏血酸钠是抗细胞膜氧化的维生素；特别是当加入甘露醇、天门冬氨酸钾镁和磷酸氢二钠时，它们共同构成了适合于鸡新城疫弱毒抗原的仿生体系，有利于抗原的休眠与复苏，本发明的疫苗在4℃条件下至少可以保存14个月2、免疫佐剂与疫苗的协同作用对于疫苗的免疫效果是重要的异丙肌苷(Methisoprimol)由肌苷、乙酰胺基苯甲酸、二甲胺基异丙醇酯合成，是一种免疫调节剂，可激活巨噬细胞，刺激B淋巴细胞分化，增强机体对抗原的免疫反应，促进抗体的产生水平本发明的实验证明，用含有异丙肌苷的疫苗实施免疫接种，与不含异丙肌苷的疫苗实施免疫接种相比，免疫过程伴随的应激反应危害性显著降低，抗体的生成时间明显缩短，强度明显增强3、由于采用将收取的鸡胚尿囊液，在-10℃条件下冷冻过夜后融化，去除沉淀物，收集上清液的方法去除了免疫源中的尿酸盐，消除了冷冻干燥疫苗的盐害样作用，方法简单，效果显著，并且还进一步可以用等渗的磷酸盐—氯化钠缓冲液将沉淀物中残存的抗原洗涤出来，与收集的上清液合并后加以利用，以免造成浪费同时还可以用超滤等方法(在氮气保护下实施)浓缩毒液，以缩小成品的单位体积4、微生物在液体冻结过程中，即液体降温—结冰—形成玻璃化晶态的过程中会发生从宏观到微观的适应性变形，以保持其生物活性在疫苗生产的冻结过程中采用5℃、0℃、-6℃各平衡1小时，有利于抗原对温度的适应性变形，对维持疫苗的生物效价是必要的5、在疫苗的减压—升温—干燥过程中，适宜的升温程序对维持生物制品的生物活性、制剂的外观形态是重要的将升温干燥的终点控制在37℃并持续3小时，使制品中的残余水分以定量非共价键形式存在，以维持抗原的形态、活性的稳定，并能使位于投药瓶内疫苗周边的抗原失活，减少成品疫苗在保存过程中的效价急速回落，并延长保存时间下面结合具体实施例对本发明做进一步说明3、收获抗原弃去96小时前死亡的鸡胚，剩余的鸡胚置4℃冷藏过夜在无菌条件下吸取尿囊液，混匀过滤，密闭保存；4、分离将收获的抗原置-10℃冷冻保存12小时以上，在循环水浴中融化，收集上清液，用等渗的磷酸盐—氯化钠缓冲液将沉淀物中残存的抗原洗涤出来，与收集的上清液合并后，用超滤器浓缩；5、配制添加剂(1)取普鲁兰10克，水解胶原蛋白40克，甘露醇40克，溶于500毫升蒸馏水中，过滤，119℃、0.1Mpa消毒30分钟；(2)取海藻糖10克，抗坏血酸钠10克，天门冬氨酸钾镁2.6克，异丙肌苷25克，溶于400毫升蒸馏水中，除菌过滤；(3)将第(1)、第(2)所得到的溶液混合，用10％无菌磷酸氢二钠调节溶液的pH值至7.1±0.1，补加蒸馏水至1000毫升，混匀；6、配制疫苗液将效价调整为10-8的抗原与添加剂溶液以等容积比例混匀，注入玻璃投药瓶中，半加塞；7、冻结将分装好的疫苗液放入冷冻干燥工作箱内，预置降温程序，分别在5℃、0℃、-6℃各平衡1小时，启动快速冻结程序，将物料温度降至-50℃，维持3小时；8、真空干燥启动真空工作程序，待冷冻干燥器内相对压力降至5Pa后，预设升温程序，以每次升温1.5℃维持30分钟，持续减压升温至37℃并维持3小时；9、充入惰性气体向玻璃投药瓶中注入氮气至相对压力达0.05Mpa，注入氡气至相对压力0.08Mpa，注入无菌空气至相对压力0.1Mpa全加塞，压封铝盖成品疫苗按《标准》所列方法检定，合格实施例2、本发明疫苗在2-8℃保存条件下的保质期在2-8℃条件下分别测定了3个批次用本发明方法制备的疫苗在不同时期的半数感染率(EID50)，结果如表1所示表1疫苗在2-8℃保存条件下的EID50 从表中的结果可以看出，本发明的疫苗在2-8℃条件下至少可以保存14个月实施例3、疫苗在高温、高湿度条件下的保质期观察在37℃、相对湿度75％的条件下不同保藏时期疫苗的EID50，结果如表2所示表2疫苗在37℃相对湿度75％保存条件下的EID50 从表中的结果可以看出，本发明疫苗的热稳定性符合美国食品与药物管理局关于鸡新城疫弱毒活疫苗的稳定性考核标准(FDA)的有关规定实施例4、应用本发明疫苗后鸡体内抗体的产生及异丙肌苷对抗体效价的影响以7日龄京白鸡为实验动物，随机分为实验组及对照组，每组10只鸡，实验组口服以异丙肌苷为佐剂的本发明疫苗，对照组口服无异丙肌苷的本发明疫苗，测定免疫后不同时期实验动物的ND-HI抗体效价，结果如表3所示表3；异丙肌苷对实验动物ND-HI抗体效价的影响 从实验结果可以看出，口服了本发明疫苗的雏鸡不论是实验组还是对照组，均获得了免疫保护，证明本发明疫苗是有效的同时实验组与对照组ND-HI抗体效价差异极显著(P≤0.05)，说明以异丙肌苷为佐剂对抗体的产生具有显著的正面影响