专利名称：新城疫病毒ndv py毒株及其应用的制作方法新城疫病毒(Newcastledisease virus,NDV)属副粘病毒科(Paramyxoviridae)新城疫样病毒(Avulavirus)属，其自然宿主为禽类、火鸡，其引起的疾病新城疫(Newcastle disease)能在多种禽类中传播,通常表现为呼吸道、消化道炎症,或伴有脑部病变。NDV偶有感染人的情况出现，感染后可引起轻微流感样症状或结膜炎，最严重者也只是引起喉炎，通常都能自愈。研究发现，NDV在人肿瘤细胞中的复制效率远比在大多数正常 细胞中高。根据对禽类的致病力不同NDV分为强、中、弱三种毒株。新城疫病毒F蛋白的裂解与毒力密切相关，强毒株的F蛋白前体F。均能裂解为F1和F2两部分，具有融合性和较强的感染力。弱毒株的Ftl蛋白不能裂解为F1及F2,因此融合性和感染力较弱。序列分析认为，新城疫病毒F蛋白剪切位点的序列与病毒致病力直接相关(参见 Collins MS, Bashiruddin JB, Alexander DJ. Deduced amino acidsequences at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease virusesshowing variation in antigenicity and pathogenicity[J].Arch Virol,1993,128(3-4) :363_370 ;以及 Millar NS, Chambers P, Emmerson PT. Nucleotide sequence ofthe fusion and haemagglutinin—neuraminidase glycoprotein genes of Newcastledisease virus, strain Ulster molecuar basis for variations in pathogenicitybetween strains [J]. J Gen Virol, 1988,69 (Pt3) :613_620)。该F 蛋白剪切位点位于112 117位氨基酸处，强毒株和中毒株裂解位点氨基酸组成为112R/K-R-Q-K/R-R-F117,即由Q隔开的两对碱性氨基酸，所以强毒株的裂解位点易被广泛分布于多种宿主细胞的碱性成对氨基酸蛋白酶和PC6所识别和裂解。而弱毒株则为112g/e-k/r-q-g/e-r-l117，只能被胰蛋白酶样蛋白酶和鸡胚尿囊液中的特殊因子水解，这类蛋白酶通常只由呼吸道和消化道分泌，因此弱毒株在大多数细胞中不发生裂解，以非活性前体H)蛋白的形式传递到子代，感染活性降低或丧失。世界动物健康组织(World organisation for animal health)目前已接受NDV分离株F蛋白裂解位点序列报告作为毒力标准(参见Berinstein A, SellersHS, King DJ, et al. Use of a heteroduplex mobility assay to detect differences inthe fusion protein cleavage site coding sequence among Newcastle disease virusisolates[J], J Clin Microbiol,2001,39(9) :3171_3178)。根据杀伤肿瘤细胞的方式不同NDV又可分为裂解株和非裂解株，其中裂解株感染可导致肿瘤细胞在较短时间内裂解；非裂解株感染往往导致肿瘤细胞凋亡。不同株的NDV其抗肿瘤效果不同，即使同一株NDV对不同肿瘤细胞的杀伤效果也存在差异。因此，需要通过一系列手段对野生NDV毒株进行筛选或修饰以培育出抗肿瘤效果好、抑瘤谱广、安全性高的NDV毒株。已有的一些抗肿瘤NDV毒株多为强毒力的裂解株。这类毒株杀伤肿瘤细胞的效率较高，但对禽类致病力很强，应用过程中如稍有不慎导致病毒外泄就可能对环境如养殖业等造成生物危害。此外，这类NDV裂解株杀死肿瘤细胞后短时间内即释放大量子代病毒，在体内应用时容易刺激机体产生抗病毒中和抗体，抗病毒中和抗体的存在将阻断NDV的抗肿瘤效应。因此临床应用时往往需对病毒进行一些修饰，或制备瘤苗，应用成本较高。
为解决上述问题，本发明提供一种新城疫病毒株。本发明提供的新城疫病毒NDV PY株，其微生物保藏号CGMCCNo. 4804 ;保藏时间2011年5月2日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；该毒株抗肿瘤效果好，能特异性地杀伤肿瘤细胞且对正常细胞影响小，其为弱毒力毒株，对外界生物环境不存在安全威胁，可用于制备良好的抗肿瘤生物制剂用于治 疗包括肝癌、小细胞肺癌、喉癌、结肠癌等多种恶性肿瘤。本发明提供的新城疫病毒NDV PY株以分离自江西鄱阳湖野鸭的若干株NDV野生毒株为基础，进行筛选、纯化、培养，通过蚀斑法筛选增殖能力强的毒株并检测其抗肿瘤能力及安全性，选育出一株新的NDV毒株，经过血凝试验、血凝抑制试验鉴定，证明并被命名为新城疫NDV PY毒株，其抗肿瘤效果好、对正常细胞影响小。本发明NDV PY毒株病毒颗粒的收集、保存方法将病毒接种于9日龄SPF鸡胚，35°C培养48小时，培养期间每隔24小时观察鸡胚活性一次，若发现鸡胚死亡即放入冰箱，可疑死亡的鸡胚留待第36小时观察，确定死亡后放入冰箱；培养结束后，将接种的鸡胚放入4°C冰箱冷冻过夜；然后收取尿囊液做血凝试验，测定其HA效价，若< I : 1024，则取病毒尿囊液再次鸡胚接种扩增病毒，直至HA效价达到彡I 1024 ;收集尿囊液，低速离心(3000rpm,30min,4°C )，取上清液超离心(50000g，60min,4°C ), PBS重悬沉淀并加至35 %鹿糖溶液顶部超离心洗漆两遍(97000g, 60min,4°C )，用含O. I % EDTA的PBS重悬病毒沉淀，直接分装或冷冻干燥，置_80°C冰箱保存。本发明NDV毒株的特性该病毒株在SPF鸡胚中生长良好，病毒接种于9日龄鸡胚尿囊腔37 °C培养60小时后，取尿囊液检测血凝效价，其HA效价可达I : 2048;将含病毒尿囊液直接接种鸡胚，每日照蛋2次，连续观察7天，鸡胚死亡率不超过6% ；I日龄鸡脑内致病指数(ICPI)为O. O ;6周龄鸡静脉内致病指数(IVPI)为O. O -M胚感染I个最小致死剂量病毒的平均死亡时间(MDT) > 120小时；病毒在Vero-E6单层细胞上作用90小时左右后出现直径约为I. Omm左右的空斑。注一般地，ICPI> I. 60 为速发型，ICPI = I. 20 I. 60 为中发型，ICPI < I. 20为缓发型；IVPI >2.0为速发型，IVPI < 2. O为中发型或缓发型；MDT < 60h为速发型，MDT=60 90h为中发型，MDT > 90h为缓发型。三个指标不一定一致，一种指数往往难以确定病毒毒力的强弱，此时应结合3种指数综合判定。该株病毒进行了全基因组测定，其基因组序列如SEQ ID No. I所示。NDV PY毒株全基因组序列由15186个碱基组成(参见SEQ IDNo. I)，与其他GenBank上公布的24株毒株的基因组序列进行比较，核苷酸同源性在72. 8% 95. 8%之间，氨基酸同源性在51. 2% 90. 3%之间，属于基因I型弱毒力病毒株，与基因I型国际标准弱毒株Ulster株在系统发生进化树同一分支上，具有亲缘关系。通过对NDVPY株F基因裂解位点的序列分析，NDV PY株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112G-K-Q-G-R-L117,与文献发表的NDV弱毒株在F基因裂解位点的氨基酸特征序列112g/e-k/r-q-g/e-r-l117相符合(参见“副粘病毒包膜糖蛋白分子生物学研究进展”，任桂杰，王志玉，《病毒学报》，2005, 21 (I) 72-75)，从而确定该毒株为弱毒力毒株，对外界生物环境不存在安全威胁，可用于制备良好的抗肿瘤生物制剂。本发明还提供一种药物组合物，其包含上述新城疫病毒NDVPY毒株和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法生产，可根据需要添加各种药学上可接受的载体如药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解齐U、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药物组合物可以口服、鼻吸入或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。进一步地，所述药物组合物中包含的新城疫病毒NDV PY病毒浓度为IXlO6 lX108PFU/ml。上述的新城疫病毒NDV PY毒株在制备抗肿瘤药物中的应用。 进一步地，在上述制备抗肿瘤药物的应用中，所述肿瘤为肝癌、小细胞肺癌、喉癌、结肠癌。本发明优点本发明采用在肿瘤细胞中连续传代的方法选育出抗肿瘤能力强的NDV PY毒株，检测该毒株对正常细胞的毒副作用，通过裸鼠移植瘤来检测其体内抑瘤效果，并对该毒株进行基因组全序列测定，结果表明该毒株可在多种肿瘤细胞系(HepG-2、SMMC-7721、BEL-7404、NCI-H446、LoVo、Lsl74t和H印-2)中增殖传代并诱导肿瘤细胞凋亡，培养基中病毒HA效价可达I : 512;在正常细胞(HL-7702、HFL-I、喉及结肠原代细胞)中该毒株不能增殖，对正常细胞杀伤作用较小；用病毒注射移植瘤裸鼠，病毒可特异性地在肿瘤组织中增殖，显著抑制移植瘤生长，实验鼠生理状况良好，无毒副作用表现，除肿瘤组织外实验鼠体内其他器官未检测到病毒存在。
本发明涉及一种新城疫病毒NDV PY毒株及其应用。本发明提供的新城疫病毒NDV PY毒株，其保藏号为CGMCC No.4804。本发明采用在肿瘤细胞中连续传代的方法选育出抗肿瘤能力强的NDV PY毒株，检测该毒株对正常细胞的毒副作用，通过裸鼠移植瘤来检测其体内抑瘤效果，并对该毒株进行基因组全序列测定，结果表明，该毒株抗肿瘤效果好，能特异性地杀伤肿瘤细胞且对正常细胞影响小，其为弱毒力毒株，对外界生物环境不存在安全威胁。