一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法[0002]流行性感冒(流感)是人类最常见的传染病之一，频繁的区域性暴发与不确定的流感大流行严重危害着人类健康并造成巨大的经济损失。由于流感病毒易发生抗原突变和基因重组,易产生耐药株等特性，因此流感疫苗接种成为控制季节性流感流行和流感大流行所必需的措施之一。[0003]传统的流感疫苗生产大多是在9至12日龄的受精鸡蛋中进行。2007年欧盟批准了诺华公司在哺乳细胞中生产的流感疫苗上市，在哺乳动物细胞中生产流感疫苗比在鸡蛋中生产疫苗具有更大的扩展性，同时可以消除在鸡蛋中生产流感疫苗所引发过敏反应等副作用。然而现阶段，受到生产技术的限制，利用细胞来生产流感疫苗的产率较低，极大限制了流感疫苗的开发和利用，特别影响到流感大流行期应急疫苗的快速生产与接种。[0004]流感病毒(Influenza viruses)是分八节段的单负链RNA病毒，编码12个病毒蛋白，流感病毒是在细胞核中实现病毒基因组的转录(vRNA —mRNA)与复制(vRNA — cRNA — vRNA)，行使转录与复制的最小功能单位是病毒的核衣壳或核糖核蛋白体(ribonucleoprotein，RNP)，它是由病毒 RNA 聚合酶复合体(PBl、PB2、PA)、病毒 RNA (vRNA)及多个拷贝的核蛋白(NP)组成的。从流感病毒通过其表面糖蛋白HA与宿主细胞受体结合，经细胞的内吞融合作用脱去病毒的外膜，将病毒vRNPs组释放到细胞胞浆中后开始，vRNPs即在宿主因子(如核转运蛋白)的协助下向核内运输，在核内又在与一系列宿主因子(P0LI1、转录因子、剪切因子等)的相互作用和博弈下，对病毒RNA进行转录与复制及新生链RNA的剪切加工，然后新生的`vRNPs在其它病毒蛋白(NS2、M)和宿主因子(核输出蛋白等)的协助下向核外运输，在胞浆中，病毒mRNA又在宿主因子作用下被优先翻译成蛋白质，其中新合成的某些病毒蛋白，如聚合酶复合体的三个亚单位PBl、PB2、PA及NP各自需要不同宿主因子的协助转运至细胞核中并装配出RNA聚合酶复合体，继续进行病毒基因组的转录与复制。由此可见，流感病毒的转录和复制过程是在与宿主蛋白密切地相互作用下进行的，利用这一特性，开发出新的技术手段来提高流感病毒疫苗毒株在细胞培养生产中的产量。
[0005]本发明的目的是利用FMRP蛋白在流感病毒转录复制时具有促进RNP装配的特性，提供一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法。[0006]为了实现本发明目的，本发明的一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法，其是通过在用于生产流感疫苗毒株的细胞中过表达FMRP蛋白或含有KH2结构域的功能性截短体蛋白，从而提高流感病毒疫苗毒株在细胞生产中的产量。其中，所述FMRP蛋白的氨基酸序列如Seq IDN0.1所示,编码该蛋白的核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。KH2结构域位于FMRP蛋白第280-422位氨基酸上，其氨基酸序列如Seq ID N0.3所示。[0007]前述的方法中，所述用于生产流感疫苗毒株的细胞为Vero或MDCK细胞等。
[0008]前述的方法中，其是将携带有编码FMRP蛋白的基因或编码含有KH2结构域的功能性截短体蛋白的基因的真核表达载体转入用于生产流感疫苗毒株的细胞中，随宿主细胞的生长复制过表达蛋白(可以是瞬时表达，或通过建立稳定表达的细胞系)，然后用流感病毒疫苗毒株感染细胞，培养细胞并收获细胞上清液，从而提高其在细胞生产中的产量。
[0009]前述的方法中，所述真核表达载体的出发载体为pCMV6_entry、pcDNA3.1或通过慢病毒载体构建稳定细胞系，如PQCXIP。
[0010]前述的方法中，所述真核表达载体为pCMV6-entry-FMRP-myc/flag,购自北京傲锐东源生物科技有限公司(cat.No RC222699)。
[0011 ] 通过RNAi筛选技术，发现FMRP蛋白是一种由FMRl基因编码的RNA结合蛋白，定位于细胞浆和细胞核中，可以在流感病毒转录复制的过程中，促进RNP的装配。同时还发现FMRP蛋白的KH2结构域对于流感病毒RNP的装配起到尤为关键的作用。实验表明，通过在用于生产流感疫苗毒株的细胞(如Vero、MDCK细胞)中以瞬时或稳定表达的方式过表达FMRP蛋白可将流感病毒复制效率提高2倍以上，将收获的病毒制备成疫苗，以满足市场对流感疫苗的需求。



[0012]图1为本发明实施例中涉及的pCMV6-entry-FMRP_myc/flag质粒图谱。
[0013]图2为本发明实施例中Western Blot检测FMRP蛋白表达的结果。
[0014]图3为本发明实施例中流感病毒疫苗毒株在Vero细胞培养中的产量。

[0015]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0016]实施例
[0017]I质粒来源
[0018]本实施例中使用的FMRP蛋白过表达质粒pCMV6-entry-FMRP_myc/flag (cat.NoRC222699,质粒图谱见图1)购自北京傲锐东源生物科技有限公司(www.0rigene.com.cn),该质粒将人源的FMRlcDNA克隆到真核表达载体pCMV6-entry中，酶切位点为sgf I和MluI。该质粒在表达过程中会在FMRP蛋白的竣基端引入myc和flag标签,便于后续实验检测。
[0019]2细胞培养
[0020]本实施例中使用Veix)细胞作为生产流感病毒疫苗毒株的细胞。待细胞在T75培养瓶中长成致密单层，基本上饱和后，吸除培养瓶内旧培养液，用5毫升PBS洗一遍细胞，以去除残余的血清，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶4毫升，覆满瓶底，于37°C、5%C02培养箱中放置3分钟，当发现细胞质回缩，细胞变圆，细胞间隙增大后，向瓶内加入含有10%胎牛血清的DMEM (完全培养基)，轻轻反复吹打，使细胞从瓶壁脱离形成细胞悬液。将细胞悬液移至15毫升离心管中，离心1000rpm，5分钟。弃上清，向离心管中加入5毫升完全培养基，将细胞团打散成单细胞，调整细胞浓度，将细胞铺至六孔板中，每孔6 X IO5个细胞，待转染质粒。剩余细胞转移至新T75培养瓶中继续37°C、5%C02培养箱中培养。
[0021]3细胞转染
[0022]铺细胞16-24小时后，转染质粒pCMV6-entry-FMRP-myc/flag和对照空质粒 pCMV6_entry。取 5 微升 lipo2000 (Invitrogen)混入 95 微升 opt1-MEM (LifeTechnologies),轻轻混匀室温放置5分钟。取3微克质粒，混入97微升opt1-MEM，轻轻混匀，室温放置5分钟。将上述质粒混合液加入到lipo2000混合液中，室温放置20分钟。将六孔板中的培养基更换为新鲜的DMEM培养基，将转染混合液轻轻加入六孔板中，轻轻摇晃，于37°C、5%C02培养箱中培养30小时后，感染流感病毒。
[0023]用Western Blot检测FMRP蛋白的表达情况。细胞转染30小时后，用细胞刮将一个孔的细胞刮下，PBS洗两遍后，用80微升RIPA裂解液裂解细胞，冰上30分钟，然后12000转/分钟，离心15分钟。取20微升细胞裂解液上清加入5微升5XSDS上样缓冲液，95°C煮10分钟后，冷却至室温，简单离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，以80伏的电压，2小时将胶中蛋白样品电转移到硝酸纤维膜上。5%脱脂奶粉封闭I小时，一抗鼠源flag抗体(sigma) 1:4000稀释孵育2小时,二抗孵育I小时后显影。Western Blot检测结果如图2所示。
[0024]4病毒感染
[0025]以MOI 0.001感染转染后的Vero细胞。取流感病毒毒株A/WSN/1933，根据原始病毒毒株的滴度(3.6 X IO6个/毫升)，向Iml病毒维持液(含有0.5%胎牛血清，I微克/毫升TPCK-胰蛋白酶的DMEM)中加入每孔细胞所需的病毒量(0.33微升)。吸除Vero细胞中的培养基，用PBS洗两遍。向每孔中 加入Iml含有所需病毒的病毒维持液，室温吸附I小时。吸除含原始病毒的病毒维持液，用PBS洗两遍,加入2毫升不含病毒的病毒维持液。分别在感染病毒后的24小时、36小时、48小时、60小时和72小时取细胞培养上清200微升用于蚀斑试验(plaque assay)方法检测病毒滴度,并同时补入200微升新鲜病毒维持液。
[0026]5蚀斑试验
[0027]测定以上5个时间点细胞培养上清中的病毒滴度。提前一天准备MDCK细胞，12孔板铺板(大约每孔2 X IO5个)，细胞密度大约在70%-80%。用病毒维持液按1_10_6的浓度梯度稀释病毒。每个稀释度制备250微升病毒液体。稀释过程中使用vortex旋涡混匀器保证病毒混匀。吸走MDCK细胞的培养基，用PBS洗两遍。按实验需要，每孔加入250微升病毒稀释液，轻轻晃匀，室温孵育I小时，每隔15分钟轻轻摇晃。2%低熔点琼脂糖(LMT)用微波炉融化后放入37°C水浴中保温。用预热的病毒维持液按1:1的体积比稀释2%LMT，使其终浓度为1%。病毒孵育后，用PBS洗两遍，洗去未吸附的病毒颗粒。每孔加入1.5毫升稀释后的1%琼脂。室温放置30分钟，待琼脂完全凝固后，倒置放入孵箱培养。72小时后观察结果。用4%甲醛固定，放入冰内里有助于琼脂凝固，然后除去琼脂，用结晶紫染色10分钟，自来水冲洗，观察结果。计算各个时间点的细胞上清的病毒滴度。计算公式为:
[0028]
PFU (个/毫升)=X稀释倍数


0.25? 升
[0029]如图3所示，流感病毒在过表达FMRP蛋白的Vero细胞上清中的滴度较对照细胞(转入空质粒pCMV6-entry)中的病毒滴度显著提高。通过本发明的方法可以将流感病毒疫苗毒株在细胞培养中的产量提高2倍。将收获的病毒制备成疫苗，以满足市场对流感疫苗的大量需求。
[0030]另外，本发明还验证了将编码含有KH2结构域的功能性截短体蛋白的基因转入Vero或MDCK细胞中，也能够达到提高流感病毒疫苗毒株产量的效果。
[0031]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精 神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。