专利名称:一种新城疫dna疫苗及其构建和应用的制作方法1990年Dr.John Woffer和Dr.Feigner偶然发现,质粒DNA在肌肉细胞中能进行转化和表达,并推测用DNA注入机体可能产生免疫反应。1992年美国的Robinson实验室、Johoston实验室、David实验室同时开发研究出了DNA疫苗的雏形,并在1992年9月召开的疫苗学新进展大会上同时进行了报告。1992年Tang在Nature上报导,将含有人生长激素基因的质粒DNA导入小鼠,在小鼠血清中检测到特异抗人生长激素抗体,DNA疫苗的新技术自此问世,并且立刻引起世界各国的高度重视,被人们视为疫苗研究领域的一场革命。1994年美国国家卫生研究院(NIH)以国家生物战略发展计划的专项经费资助开展DNA疫苗治疗HIV的研究工作。1994年美国FDA批准了在人体进行DNA疫苗治疗爱滋病的临床试验。1995年5月,报导了世界第一例DNA疫苗的临床试验,世界卫生组织(WHO)拨款把DNA疫苗纳入WHO全球免疫研制开发计划之中。DNA疫苗新技术的核心是将编码抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中构建核酸疫苗,然后将其导入动物体内,重组的核酸疫苗可以利用动物体内的酶系合成外源基因编码的蛋白,从而诱发动物对该外源蛋白产生免疫应答,达到免疫目的。许多动物模型和人体实验都证明了DNA疫苗能激发有效的体液免疫应答和细胞免疫应答既可激活体液免疫,又能激活细胞免疫,这表明DNA免疫技术,不仅能通过产生抗体预防病毒感染,更重要的是DNA疫苗可诱导极有效的专一性T杀伤细胞的能力,清除已经被感染的机体细胞,达到治疗疾病的目的,而且没有副作用反应。与当前常用的减毒活苗疫苗或灭活菌疫苗相比,DNA疫苗具有明显的优势,1)所需的免疫量较小,20-100微克;2)DNA疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫,比其它免疫手段免疫效力更强;3)不仅具有预防疾病的作用而且还有治疗疾病功效;4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法难以比拟的潜在优势。其应用前景十分诱人。鸡新城疫,也称新城疫病毒(Newcastle disease virus,以下简称NDV)是国内外养禽业发展的重要制约因素。速发型新城疫病毒(NDV)是鸡群中流行的新城疫病毒毒株。当前,NDV是危害世界养鸡业、养鸽业的重要传染病之一。鸡感染新城疫病毒后,目前尚无特殊治疗药物。雏鸡疫苗接种是预防的主要措施,目前一般采用的是新城疫病毒减毒活苗或灭活苗作预防疫苗。这种减毒疫苗虽有一定效果,但工艺繁琐,效果差,每当新城疫病毒流行,鸡的死亡率仍是非常之高。此外,这种减毒活苗或灭活苗仅能激活体液免疫,所以只在预防上有一定作用,但无法控制和治疗该病毒引起的鸡瘟。不能满足国内外养禽业急需具有高效、安全可靠、有预防作用的鸡新城疫疫苗的需求。
本发明的目的在于克服现有传统接种NDV病毒减毒活苗或灭活菌作为预防疫苗,产生的抗体滴度低、免疫效果差、易产生免疫逃避、仅有较弱的预防作用而无治疗新城疫的功能等缺陷,从而提供一种能预防和治疗新城疫pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。本发明的另一目的是提供该新城疫DNA疫苗的构建。本发明的再一目的是提供该新城疫DNA疫苗的用途。本发明的目的是由如下的技术方案实现的本发明提供的新城疫DNA疫苗,该疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表达载体pVAX1组成,其特征在于所述的NDV-LasotaHN基因是NDV病毒的致病决定基因,其为NDV病毒的Lasota E4基因中第6400至8144的核苷酸,具有图1中所示的核苷酸序列本发明提供的所述新城疫DNA疫苗的构建,包括如下步骤1)NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化将NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面,待鸡胚死亡后,收集尿囊液,按常规方法提取NDV Lasota病毒总RNA;2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物,上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′;下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′;3)通过温度降落过逆转录-聚合酶链式扩增方法,克隆得到NDV Lasota HN的全长cDNA基因序列;
4)将步骤3)扩增的LasotaHN,利用Wizard?PCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaHN cDNA片段;5)将LasotaHN全长cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中,构建成一种新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗。
所述步骤3)的温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法包括逆转录反应在48℃反应45分钟,接着在94℃灭活5分钟,并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法扩增反应在第一个变性步骤时加入聚合酶,变性温度为94℃,持续1分钟,退火温度从68℃开始,持续1分钟,然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃,持续1分钟,延伸温度为65℃,持续1.5分钟;最后在以退火温度57℃/分钟继续扩增15个循环;最后在71℃延伸10分钟。
本发明进一步提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于预防鸡新城疫疾药物中的应用。
本发明还提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于治疗鸡新城疫疾病药物中的应用。
本发明提供的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗优益之处在于1)所需的免疫量较小,20~50微克即可;2)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫,比其它免疫手段免疫效力更强;3)不仅具有预防鸡新城疫疾病的作用而且还有治疗该疾病功效;4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。
图1为NDV-LasotaHN基因的核苷酸序列。
本发明实施例中使用的三黄鸡由北京昌平养鸡厂孵育,来杭鸡为北京动物实验中心孵育。
实施例1.本发明的新城疫DNA疫苗——pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的构建本发明的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的构建步骤如下1)NDV病毒(Virus)总RNA的提取及纯化
采用Promega公司RNAgents?Total RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒总RNA,其具体操作是将由北京中国兽医药品监察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面,在灯光下观察发现鸡胚死亡后,收集尿囊液20ml,将收集的尿囊液以700rpm的速度离心15分钟;将上清液加入20ml 16wt%PEG-0.525MNaCl,冰浴1小时;以10000rpm的速度离心5分钟,于4℃沉淀病毒颗粒;用800μl变性液将病毒沉淀溶解,移至1.5ml EP管;加80μl乙酸钠混匀,加入800μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比1∶1∶1)混匀,振动8~12秒,水浴15分钟;以10000rpm的速度于4℃离心15分钟,取出上清液;以10000rpm的速度于4℃离心10分钟;分出沉淀,干燥后加10μl无核酸酶水,-80℃保存;2)设计特异性引物根据Lasota病毒HN蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物,上游引物5′-CGACAACAGTCCTCAATCATGG-3′;下游引物5′-TTGACTCAACTAGCCAGACCTGG-3′;3)通过TDRT-PCR(温度降落逆转录-聚合酶链式反应)克隆扩增LasotaHN基因全长cDNA50μL的反应体系由10μL的AMV/Tf1 5×反应缓冲液、2mM的dNTPs混合物、3mM的MgSO4、1μM的上游引物及下游引物、0.1U/μL的AMV逆转录酶、0.1U/μL的Tf1DNA聚合酶,2μg的总RNA和无核酸酶水组成;逆转录反应在48℃反应45分钟,接着在94℃灭活5分钟,并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法(TDRT-PCR)扩增反应在降落TD-PCR扩增阶段,变性温度为94℃,持续1分钟,退火温度从68℃开始,持续1分钟,然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃,持续1分钟,延伸温度为65℃,持续1.5分钟;最后在以退火温度57℃分钟继续扩增15个循环;最后在71℃延伸10分钟;4)通过TDRT-PCR扩增的LasotaHN基因cDNA,方法同3),利用Wizard?PCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaHN基因cDNA片段;5)将LasotaHN全长cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中,构建成抗NDV的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗根据pVAX1载体试剂盒的使用说明选用真核质粒表达载体pVAX1含有真核启动子CMV,能够在真核细胞中高效表达外源蛋白质,将LasotaHN全长cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中用连接反应液转化感受态细胞Top10F’,取80ul转化的菌液涂布LB(含氨苄青霉素)平板,于37℃培养过夜;挑取菌落摇菌过夜,用碱裂法提取质粒DNA,即本实施例的pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,进行酶切鉴定并对阳性重组质粒进行测序。
实施例2.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因体外瞬时表达和表达含量的鉴定LasotaHN基因的体外mRNA表达建立HeLa细胞体外瞬时表达系统,将实施例1中构建的真核表达质粒pVAX1-LasotaHN经脂质体转染到培养在24孔板的HeLa细胞中,于36小时收集细胞,提取36小时收集的转染HeLa细胞的总RNA,采用RT-PCR方法分析LasotaHN基因的体外表达。通过RT-PCR方法扩增出LasotaHN cDNA条带,结果表明pVAX1-LasotaHN真核表达质粒在Hela细胞体外瞬时表达系统中在mRNA水平上能高效表达,mRNA水平的表达量比对照组(空质粒)高出157%。
外源LasotaHN的体外蛋白表达采用免疫荧光的方法检测转染HeLa细胞LasotaHN蛋白的表达。取转染36小时的HeLa细胞于4wt%磷酸缓冲液-多聚甲醛(PH7.4)中室温固定1小时,用磷酸缓冲液(为方便起见,以下简称PBS)漂洗3次后,1∶50(为方便起见,本专利所有实施例中的1∶x都是指用PBS物质稀释x倍的)正常血清室温封闭分钟,弃封闭血清,加入50μL 1∶250稀释的鸡抗NDV蛋白抗血清(0.5mg/mL)37℃孵育3小时,经PBS漂洗后,样品于1∶100稀释羊抗鸡IgG-FITC 4℃孵育1小时,PBS漂洗后用20μg/mL碘化丙啶(PI)在4℃染色2分钟,PBS漂洗,于激光共聚焦显微镜(Confocal)488nm和564nm激发波长下观察分析。免疫荧光结果证实pVAX1-LasotaHN能在Hela细胞体外瞬时表达系统中产生具有生物活性的LasotaHN蛋白,蛋白水平的表达量比对照组(空质粒)高164%。
实施例3.在体内pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源LasotaHN基因表达和表达含量的鉴定外源LasotaHN基因的体内表达检测将北京昌平养鸡厂孵育的三黄鸡随机分为2组,每组18只,一组为实验组,对三黄鸡的肌肉注射实施例1中构建的20μgpVAX1-LasotaHN质粒DNA;另一组为对照组,对三黄鸡的肌肉注射20μg pVAX1空质粒DNA。于注射质粒DNA后第3周取免疫三黄鸡的肌肉、肝脏和脾脏组织,提取pVAX1-LasotaHN免疫三黄鸡收集的肌肉组织、肝脏和脾脏组织总RNA,采用RT-PCR方法检测外源LasotaHN基因在三黄鸡体内的表达情况。由检测结果可知,pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫后肌肉、肝脏和脾脏组织细胞中LasotaHN在mRNA水平上表达,mRNA水平的平均表达量比对照组(空质粒)高出289%。
实施例4.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗体内免疫反应的检测ELISA检测三黄鸡体液免疫应答实验分组、pVAX1-LasotaHN DNA疫苗注射方式及部位都与实施例3相同。用1∶50倍稀释的正常血清(未射任何质粒)和1∶50倍稀释的肌肉注射20μg pVAX1空质粒DNA的血清分别作为对照,收集pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫三黄鸡三周后的血清按1∶100和1∶500的比例稀释,以1μg/mL的Lasota E4标准蛋白50μL/孔作包被抗原,采用标准ELISA方法检测体液免疫应答。由检测结果可知,pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫后机体能产生高滴度抗体(抗体滴度>1∶3700)。
实施例5.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的安全性评估对于免疫动物的安全性检测检测不同剂量(20μg~300μg)pVAX1-LasotaHNDNA疫苗免疫30只三黄鸡,160天后无一只死亡;进行不同剂量pVAX1-LasotaHNDNA疫苗注射动物后的毒理性和常规生理指标的观察测定,利用组织化学方法确定注射疫苗后动物组织病理变化将相应组织器官进行冰冻切片,在显微镜下观察,没有发现动物组织有病理变化。
实施例6.评估pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽后是否对其他动物产生影响。
20只孵出三天的三黄鸡和20只孵出三天的来杭鸡混养,随机取10只注射20μgpVAX1-LasotaHN DNA疫苗并作好标记,6周后,采用RT-PCR方法检测其它30只未射任何质粒三黄鸡体或来杭鸡体内是否有pVAX1-LasotaHN DNA疫苗外源Lasota HN基因的表达,30只鸡的检测结果显示未检到外源LasotaHN基因在mRNA水平的表达,这表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫家禽后对其他未免疫的动物无感染作用。
实施例7.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在鸡群中实际预防和治疗鸡新城疫的疗效实验-I在北京动物实验中心孵育36只白来杭鸡雏鸡,一周后将雌雄兼有的雏鸡随机分成四组,第1-3组每组8只,第4组12只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4为100μl稀释100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1组不接种任何质粒,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第2组接种100μl生理盐水,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第3组接种20μg pVAX1空质粒,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第4组接种20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,3周后注射新城疫病毒NDV LasotaE4;从注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天开始观察,结果为第1组、第2组、第3组3天后24只小鸡分别出现程度不同的鸡瘟症状,其中8只死亡;4天后16只小鸡鸡瘟症状加重,其中9只死亡;5天后7只小鸡仅有1只存活;6天后1只小鸡亦死亡;第4组3天后12只小鸡无任何鸡瘟症状,健康活泼;4天后12只小鸡无任何鸡瘟症状,健康活泼;5天后12只小鸡无任何鸡瘟症状,健康活泼;6天后4只小鸡出现轻微鸡瘟症状,其余8只健康活泼;7天后又有3只小鸡出现轻微鸡瘟症状,其余5只健康活泼;10天后其中1只小鸡死亡,其余11只健康活泼;120天后11只小鸡均无任何鸡瘟症状,健康活泼;由此实验结果可知,pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗鸡新城疫病毒感染的作用,与三组对照组相比抗鸡新城疫病毒感染的效果显著(p<0.01)。
实施例8.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在鸡群中实际预防和治疗鸡新城疫的疗效实验-II在北京昌平养鸡厂孵育60只三黄鸡雏鸡,一周后将雌雄兼有60只雏鸡随机分成四组,第1~3组每组10只,第4组30只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4为100μl稀释100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1组不接种任何质粒,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第2组接种100μl生理盐水,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第3组接种20μg pVAX1空质粒,3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4;第4组接种20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,3周后注射新城疫病毒NDV LasotaE4;从注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天开始观察,结果为第1组、第2组、第3组3天后30只小鸡均未出现鸡瘟症状,健康活泼;4天后30只小鸡均仍未出现鸡瘟症状,健康活泼;5天后30只小鸡均开始出现鸡瘟症状,且症状轻重不一;6天后30只小鸡鸡瘟症状加重,其中25只小鸡死亡;7天后其余5只小鸡鸡瘟症状加重;10天后5只小鸡相继死亡;第4组3~5天后30只小鸡无任何鸡瘟症状,健康活泼;6~7天后30只小鸡中有8只小鸡出现轻微鸡瘟症状,其它小鸡均健康活泼;8~9天后30只小鸡有14只小鸡出现轻微鸡瘟症状,其它小鸡均健康活泼;10天后30只小鸡有3只死亡其它27只均无任何鸡瘟症状;20天后将存活的27只小鸡再次注射100μl稀释100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液;24天后27只鸡中有3只小鸡出现轻微鸡瘟症状,其它鸡均健康活泼;28天后3只小鸡出现的鸡瘟症状消失,27只鸡均健康活泼;30天后这27只鸡第三次注射100μl稀释50倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液;34天后27只鸡健康活泼,均未出现鸡瘟症状;38天后,除1只死亡外,其它26只鸡均健康活泼。
鸡群实验再次证明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有高效的抗鸡新城疫病毒感染的作用,与三组对照组相效果十分显著(p<0.01),一旦接受pVAX1-LasotaHN DNA疫苗免疫,连续三次用强新城疫病毒NDV Lasota E4病毒株攻击,鸡群均不会被病毒感染,证明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗抗病毒效果稳定、可靠。
实施例9.pVAX1-LasotaHN DNA疫苗在鸡群中实际治疗鸡新城疫的疗效实验在北京昌平养鸡厂孵育30只三黄鸡雏鸡,分为三组,每组10只。
第一组10只雏鸡5天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶200),4~5天后小鸡出现轻微鸡瘟症状,此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗;接种疫苗后第三至四天小鸡新城疫病症状减弱;第六天后,3只小鸡患病死亡,另7只小鸡症状未见有明显变化;第十天后,6只小鸡恢复健康,其余1只死亡。
治疗实验表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗具有一定的治疗鸡瘟的作用,对孵化后一周内的雏鸡,强病毒攻击感染鸡瘟后注射pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,疗效达60%。
第二组10只雏鸡15天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100),4~5天后小鸡出现鸡瘟症状,此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,接种疫苗后3~4天小鸡新城疫病症状明显减弱;第七天,除3只小鸡死亡外,其它7只小鸡鸡瘟症状减弱;第十天后,7只小鸡完全恢复健康;康复的7只小鸡一周后,再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100),90天后7只鸡健康活泼,均未出现鸡瘟症状。
第二组治疗实验表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗对孵化后15天遭强病毒攻击感染鸡瘟的小鸡疗效达70%,且治疗鸡瘟的同时,还具有良好的预防效果。
第三组10只雏鸡30天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100),4~5天后鸡出现鸡瘟症状,此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaHN DNA疫苗,接种疫苗后3~4天小鸡新城疫病症状明显减弱;第八天,除1只小鸡死亡外,其它9只鸡鸡瘟症状减弱;第十天后,9只小鸡完全恢复健康;康复的9只小鸡一周后,再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100),90天后9只鸡健康活泼,均未出现鸡瘟症状。
第三组治疗实验表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗对孵化后30天遭强病毒攻击感染鸡瘟的小鸡疗效达90%。
这三组实验表明pVAX1-LasotaHN DNA疫苗的疗效与鸡龄大小有一定相关性。
FPI03021-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>中国科学院动物研究所<120>一种新城疫的DNA疫苗及其用途<130>FPI03021<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1744<212>DNA<213>Newcastle disease virus<400>1agtcctcaat catggaccgc gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat gaaagagagg 60caaaaaatac atggcgcttg atattccgga ttgcaatctt attcttaaca gtagtgacct120tggctatatc tgtagcctcc cttttatata gcatgggggc tagcacacct agcgatcttg180taggcatacc gactaggatt tccagggcag aagaaaagat tacatctaca cttggttcca240atcaagatgt agtagatagg atatataagc aagtggccct tgagtctccg ttggcattgt300taaatactga gaccacaatt atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag attaatggag360ctgcaaacaa cagtgggtgg ggggcaccta tccatgaccc agattatata ggggggatag420gcaaagaact cattgtagat gatgctagtg atgtcacatc attctatccc tctgcatttc480aagaacatct gaattttatc ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cgaataccct540catttgacat gagtgctacc cattactgct acacccataa tgtaatattg tctggatgca600gagatcactc acattcatat cagtatttag cacttggtgt gctccggaca tctgcaacag660ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa aatcggaagt720cttgcagtgt gagtgcaact cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa gtcacggaga780cagaggaaga agattataac tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg aggttagggt840tcgacggcca gtaccacgaa aaggacctag atgtcacaac attattcggg gactgggtgg900ccaactaccc aggagtaggg ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg ttctcagtct960acggagggtt aaaacccaat tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa tatgtgatat 1020acaagcgata caatgacaca tgcccagatg agcaagacta ccagattcga atggccaagt 1080cttcgtataa gcctggacgg tttggtggga aacgcataca gcaggctatc ttatctatca 1140aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt accgcccaac acagtcacac 1200tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc tcatttcttg tatcaacgag 1260ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac agtcagcaac aaaacagcca 1320ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg 1380cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa 1440tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgtacaag 1500caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc attactcgag 1560tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga 1620ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca 1680gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg 1740gcta174
本发明涉及的新城疫DNA疫苗由NDV-LasotaHN基因和真核表达载体pVAX1组成,该DNA疫苗的构建是通过如下步骤NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化、设计特异性引物、通过TDRT-PCR扩增,克隆得到NDV LasotaHN的全长cDNA基因序列、将纯化后的LasotaHN全长cDNA片段重组到pVAX1真核表达质粒中。与当前常用的疫苗相比,本核酸疫苗达到相同免疫效果所需的量小,并且能同时、高效激发体液免疫和细胞免疫,比其它免疫手段免疫效力更强,而且安全、长效、稳定、操作便捷。本新城疫DNA疫苗可以用于预防和治疗鸡新城疫疾的药物。
一种新城疫dna疫苗及其构建和应用制作方法
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