专利名称：一种新城疫的dna疫苗及其用途的制作方法鸡新城疫，也称新城疫病毒(Newcastle disease virus，以下简称NDV)为致病原，目前在世界范围内广泛存在，它是危害世界养鸡业的重要传染病之一，是集约化养鸡场和广大农村养禽业发展的重要制约因素。资料统计证实，速发型NDV是许多发展中国家农村鸡群中流行的NDV病毒株。本病特点为来势迅猛，发病率几乎是100％，死亡率达80％以上，一般每隔四、五年会发生一次全球性大流行。NDV的流行常导致巨大的经济损失，为此全世界都在为控制和消灭NDV而努力。鸡被NDV病毒感染后，目前尚无特殊治疗药物，现在大多采用传统接种NDV病毒减毒活苗或灭活菌作为预防疫苗，雏鸡疫苗接种是预防的主要措施。但是NDV病毒容易变异，从而产生免疫逃避，这是无法控制该病，造成NDV流行的主要原因之一。根据抗原成分不同，可将疫苗分为减毒活苗疫苗、灭活菌疫苗以及重组疫苗。与当前常用的减毒活苗或灭活菌疫苗相比，重组疫苗，即DNA疫苗具有明显的优势1)所需的免疫量较小，20～100微克即可；2)DNA疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；3)不仅具有预防疾病的作用而且还有治疗疾病功效；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。因此DNA疫苗具有其它免疫方法难以比拟的潜在优势。其应用前景十分诱人。在针对新城疫病毒(NDV)开发的多种NDV病毒DNA疫苗的工作中，德国的Meszsaros利用NDV-6/10病毒变异株构建的疫苗通过喷雾接种在鸡体中产生了强烈的能抵抗NDV感染的细胞免疫，但检测不到体液免疫的存在，而且采用直接喷雾接种DNA疫苗虽可产生粘膜免疫，但免疫效果远不如肌肉微量注射效果佳。构建一种既能产生高滴度的抗体又能激活细胞免疫的DNA疫苗，筛选具有抗原活性蛋白基因是至关重要的。NDV病毒的F蛋白是NDV致病的分子决定蛋白，其F蛋白裂解位点氨基酸序列决定了NDV病毒致病能力。由一种类胰酶介导的特异性裂解导致融合蛋白F0分裂产生有活性的F1和F2多肽，F1多肽与宿主细胞发生融合作用，从而感染机体细胞。因此通过激发针对F蛋白的有效免疫应答，就有可能达到防治鸡新城疫疾病的目的。比利时的Letellier利用NDV-F蛋白基因制备的病毒重组疫苗能激发高滴度的体液免疫并能抵抗NDV的感染，但抗体并不能较好地发挥中和NDV病毒的作用。
本发明的目的在于克服现有技术NDV病毒DNA疫苗不能同时激发体液免疫、免疫效果差、及产生的抗体中和NDV病毒的能力弱的缺陷，从而提供一种能预防和治疗新城疫的pVAX1-LasotaF DNA疫苗，该疫苗选择的是Lasota E4的F蛋白的全基因序列，既包含高度保守的同源序列，又含有抗原决定簇基因序列，此外，其真核表达载体pVAX1和pcDNA3.1均是近年不断完善的载体质粒，因而可以同时激发细胞免疫和体液免疫，而且免疫效果好。本发明的另一目的是提供该新城疫的DNA疫苗的构建。本发明的再一目的是提供该新城疫的DNA疫苗的用途。
本发明的目的是由如下的技术方案实现的本发明提供一种新城疫的DNA疫苗，该疫苗由NDV-LasotaF基因和真核表达载体pVAX1组成，其特征在于所述的NDV-LasotaF基因是NDV病毒的致病决定基因，其为NDV病毒的Lasota E4基因中第4541至6223的核苷酸，具有图1中所示的核酸序列。
本发明提供一种所述新城疫DNA疫苗的构建，包括如下步骤1)NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化将NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，待鸡胚死亡后，收集尿囊液，按常规方法提取NDV Lasota病毒总RNA；2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，上游引物5′-AAGATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3′；下游引物5′-CCTTCGTTCCTCATCTGTGTTCAC-3′；3)通过温度降落过逆转录-聚合酶链式扩增方法，克隆得到NDV LasotaF的全长cDNA基因序列；4)步骤3)扩增的LasotaF，利用Wizard?PCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaF cDNA片段；5)将LasotaF全长cDNA片段重组到PCR?3.1真核表达质粒中，构建成一种新城疫DNA疫苗——抗NDV的pVAX1-LasotaF DNA疫苗。
所述步骤3)的温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法包括逆转录反应在48℃反应45分钟，接着在95℃灭活5分钟，并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法扩增反应在第一个变性步骤时加入聚合酶，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从68℃开始，持续1分钟，然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃，持续1分钟，延伸温度为68℃，持续1.5分钟；最后在以退火温度58℃/分钟继续扩增15个循环；最后在72℃延伸10分钟。
所述步骤5)中的真核表达载体还可以是pcDNA3.1。
本发明进一步提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于预防鸡新城疫疾药物中的用途。
本发明还提供了所述新城疫DNA疫苗在制备用于治疗鸡新城疫疾病药物中的用途。
本发明提供的新城疫DNA疫苗优益之处在于1)有高效预防和治疗鸡新城疫疾病效的效果；2)所需的免疫量较小，20～50微克即可；3)核酸疫苗能同时高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强；4)基因免疫安全、长效(免疫能力有长时间的记忆)、稳定、操作便捷。


图1为NDV-LasotaF基因的核苷酸序列。

本发明实施例中使用的三黄鸡由北京昌平养鸡厂孵育，来杭鸡为北京动物实验中心孵育。
实施例1.本发明的新城疫DNA疫苗—pVAX1-LasotaF DNA疫苗的构建本发明的pVAX1-LasotaF DNA疫苗的构建步骤如下1)NDV病毒(Virus)总RNA的提取及纯化采用Promega公司RNAgents?Total RNA Isolation System kit提取NDV Lasota病毒总RNA，其具体操作是将由北京中国兽医药品监察所提供的NDV Lasota E4病毒株注射到孵化14天的鸡胚里面，在灯光下观察发现鸡胚死亡后，收集尿囊液20ml，将收集的尿囊液以700rpm的速度离心15分钟；将上清液加入20ml 16wt％PEG-0.525M NaCl，冰浴1小时；以10000rpm的速度离心5分钟，于4℃沉淀病毒颗粒；用800μl变性液将病毒沉淀溶解，移至1.5ml EP管；加80μl乙酸钠混匀，加入800μl苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比1∶1∶1)混匀，振动8～12秒，水浴15分钟；以10000rpm的速度于4℃离心15分钟，取出上清液；以10000rpm的速度于4℃离心10分钟；分出沉淀，干燥后加10μl无核酸酶水，-80℃保存；2)设计特异性引物根据Lasota病毒F蛋白基因序列分析设计出一对特异性引物，上游引物5′-AAGATGGGCTCCAGACCTTCTACC-3′；下游引物5′-CCTTCGTTCCTCATCTGTGTTCAC-3′；3)通过TDRT-PCR(温度降落逆转录-聚合酶链式反应)克隆扩增LasotaF基因全长cDNA50μL的反应体系由10μL的AMV/Tf15×反应缓冲液、2mM的dNTPs混合物、3mM的MgSO4、1μM的上游引物及下游引物、0.1U/μL的AMV逆转录酶、0.1U/μL的Tf1 DNA聚合酶，2μg的总RNA和无核酸酶水组成；逆转录反应在48℃反应45分钟，接着在95℃灭活5分钟，并启动温度降落逆转录-聚合酶链式扩增方法(TDRT-PCR)扩增反应在降落TD-PCR扩增阶段，变性温度为94℃，持续1分钟，退火温度从68℃开始，持续1分钟，然后以每四个循环下降1℃的速度降至56℃，持续1分钟，延伸温度为68℃，持续1.5分钟；最后在以退火温度58℃分钟继续扩增15个循环；最后在72℃延伸10分钟；4)通过TDRT-PCR扩增的LasotaF基因cDNA，方法同3)，利用Wizard?PCR Preps.DNA纯化体系试剂盒回收纯化LasotaF基因cDNA片段；5)将LasotaF全长cDNA片段重组到PCR?3.1真核表达质粒中，构建成抗NDV的pVAX1-LasotaF DNA疫苗根据pVAX1载体试剂盒的使用说明选用真核质粒表达载体pVAX1含有真核启动子CMV，能够在真核细胞中高效表达外源蛋白质，将LasotaF全长cDNA片段重组到PCR?3.1真核表达质粒中用连接反应液转化感受态细胞Top10F’，取80ul转化的菌液涂布LB(含氨苄青霉素)平板，于37℃培养过夜；挑取菌落摇菌过夜，用碱裂法提取质粒DNA，即本实施例的pVAX1-LasotaF DNA疫苗，进行酶切鉴定并对阳性重组质粒进行测序。
实施例2.pVAX1-LasotaF DNA疫苗外源LasotaF基因体外瞬时表达和表达含量的鉴定LasotaF基因的体外mRNA表达建立HeLa细胞体外瞬时表达系统，将实施例1中构建的真核表达质粒pVAX1-LasotaF经脂质体转染到培养在24孔板的HeLa细胞中，于36小时收集细胞，提取36小时收集的转染HeLa细胞的总RNA，采用RT-PCR方法分析LasotaF基因的体外表达。通过RT-PCR方法扩增出LasotaF cDNA条带，结果表明pVAX1-LasotaF真核表达质粒在Hela细胞体外瞬时表达系统中在mRNA水平上能高效表达，mRNA水平的表达量比对照组(空质粒)高出138％。
外源LasotaF的体外蛋白表达采用免疫荧光的方法检测转染HeLa细胞LasotaF蛋白的表达。取转染36小时的HeLa细胞于4wt％磷酸缓冲液-多聚甲醛(PH7.4)中室温固定1小时，用磷酸缓冲液(为方便起见，以下简称PBS)漂洗3次后，1∶50(为方便起见，本专利所有实施例中的1∶x都是指用PBS物质稀释x倍的)的鸡抗NDV蛋白抗血清(0.5mg/mL)37℃孵育3小时，经PBS漂洗后，样品于1∶100稀释羊抗鸡IgG-FITC4℃孵育1小时，PBS漂洗后用20μg/mL碘化丙啶(PI)在4℃染色2分钟，PBS漂洗，于激光共聚焦显微镜(Confocal)488nm和564nm激发波长下观察分析。免疫荧光结果证实pVAX1-LasotaF能在Hela细胞体外瞬时表达系统中产生具有生物活性的LasotaF蛋白，蛋白水平的表达量比对照组(空质粒)高196％。
实施例3.在体内pVAX1-LasotaF DNA疫苗外源LasotaF基因表达和表达含量的鉴定外源LasotaF基因的体内表达检测将北京昌平养鸡厂孵育的三黄鸡随机分为2组，每组18只，一组为实验组，对三黄鸡的肌肉注射实施例1中构建的20μg pVAX1-LasotaF质粒DNA；另一组为对照组，对三黄鸡的肌肉注射20μg pVAX1空质粒DNA。于注射质粒DNA后第3周取免疫三黄鸡的肌肉、肝脏和脾脏组织，提取pVAX1-LasotaF免疫三黄鸡收集的肌肉组织、肝脏和脾脏组织总RNA，采用RT-PCR方法检测外源LasotaF基因在三黄鸡体内的表达情况。由检测结果可知，pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫后肌肉、肝脏和脾脏组织细胞中LasotaF在mRNA水平上表达，mRNA水平的平均表达量比对照组(空质粒)高出369％。
实施例4.pVAX1-LasotaF DNA疫苗体内免疫反应的检测ELISA检测三黄鸡体液免疫应答实验分组、pVAX1-LasotaF DNA疫苗注射方式及部位都与实施例3相同。用1∶50倍稀释的正常血清(未射任何质粒)和1∶50倍稀释的肌肉注射20μg pVAX1空质粒DNA的血清分别作为对照，收集pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫三黄鸡三周后的血清按1∶100和1∶500的比例稀释，以1μg/mL的Lasota E4标准蛋白50μL/孔作包被抗原，采用标准ELISA方法检测体液免疫应答。由检测结果可知，pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫后机体能产生高滴度抗体(抗体滴度＞1∶2600)。
实施例5.pVAX1-LasotaF DNA疫苗的安全性评估对于免疫动物的安全性检测检测不同剂量(20μg～300μg)pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫40只三黄鸡，180天后无一只死亡；进行不同剂量pVAX1-LasotaF DNA疫苗注射动物后的毒理性和常规生理指标的观察测定，利用组织化学方法确定注射疫苗后动物组织病理变化将相应组织器官进行冰冻切片，在显微镜下观察，没有发现动物组织有病理变化。
实施例6.评估pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫家禽后是否对其他动物产生影响。
15只孵出三天的三黄鸡和15只孵出三天的来杭鸡混养，随机取6只注射20μgpVAX1-LasotaF DNA疫苗并作好标记，6周后，采用RT-PCR方法检测其它24只未射任何质粒三黄鸡体或来杭鸡体内是否有pVAX1-LasotaF DNA疫苗外源LasotaF基因的表达，24只鸡的检测结果显示未检到外源LasotaF基因在mRNA水平的表达，这表明pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫家禽后对其他未免疫的动物无感染作用。
实施例7.pVAX1-LasotaF DNA疫苗在鸡群中实际预防和治疗鸡新城疫的疗效实验-I在北京动物实验中心孵育40只白来杭鸡雏鸡，一周后将雌雄兼有的雏鸡随机分成四组，每组10只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4为100μl稀释100倍的含有LasotaE4病毒的尿囊液。
第1组不接种任何质粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2组接种100μl生理盐水，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3组接种20μg pVAX1空质粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4组接种20μg pVAX1-LasotaF DNA疫苗，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；从注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天开始观察，结果为第1组、第2组、第3组3天后30只小鸡分别出现程度不同的鸡瘟症状，其中4只死亡；4天后26只小鸡鸡瘟症状加重，其中12只死亡；5天后14只小鸡仅有2只存活；6天后2只小鸡亦死亡；
第4组3天后10只小鸡无任何鸡瘟症状，健康活泼；4天后10只小鸡无任何鸡瘟症状，健康活泼；5天后10只小鸡无任何鸡瘟症状，健康活泼；6天后1只小鸡出现轻微鸡瘟症状，其余9只健康活泼；7天后2只小鸡出现轻微鸡瘟症状，其余8只健康活泼；120天后10只小鸡均无任何鸡瘟症状，健康活泼；由此实验结果可知，pVAX1-LasotaF DNA疫苗具有高效的抗鸡新城疫病毒感染的作用，与三组对照组相比抗鸡新城疫病毒感染的效果显著(p＜0.01)。
实施例8.pVAX1-LasotaF DNA疫苗在鸡群中实际预防和治疗鸡新城疫的疗效实验-II在北京昌平养鸡厂孵育90只三黄鸡雏鸡，一周后将雌雄兼有90只雏鸡随机分成四组，第1～3组每组20只，第4组30只。所注射的新城疫病毒NDV Lasota E4为100μl稀释100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液。
第1组不接种任何质粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第2组接种100μl生理盐水，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第3组接种20μg pVAX1空质粒，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；第4组接种20μg pVAX1-LasotaF DNA疫苗，3周后注射新城疫病毒NDV Lasota E4；从注射新城疫病毒NDV Lasota E4后第三天开始观察，结果为第1组、第2组、第3组3天后60只小鸡均未出现鸡瘟症状，健康活泼；4天后60只小鸡均仍未出现鸡瘟症状，健康活泼；5天后60只小鸡均开始出现鸡瘟症状，且症状轻重不一；6天后60只小鸡鸡瘟症状加重，其中25只小鸡死亡；7天后其余35只小鸡鸡瘟症状加重，又有32只小鸡死亡；10天后最后的3只小鸡相继死亡；第4组3～5天后30只小鸡无任何鸡瘟症状，健康活泼；6～7天后30只小鸡中有4只小鸡出现轻微鸡瘟症状，其它小鸡均健康活泼；8～9天后30只小鸡有7只小鸡出现轻微鸡瘟症状，其它小鸡均健康活泼；10天后30只小鸡有1只死亡其它29只均无任何鸡瘟症状；20天后将存活的29只小鸡再次注射100μl稀释200倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；24天后29只鸡中有5只小鸡出现轻微鸡瘟症状，其它鸡均健康活泼；28天后5只小鸡出现的鸡瘟症状消失，29只鸡均健康活泼；30天后这29只鸡第三次注射100μl稀释100倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；34天后29只鸡健康活泼，均未出现鸡瘟症状；38天后，29只鸡均健康活泼；40天后这29只鸡第四次注射100μl稀释50倍的含有Lasota E4病毒的尿囊液；44天后29只鸡健康活泼，均未出现鸡瘟症状；120天后，29只鸡均健康活泼。
鸡群实验再次证明pAX1-LasotaF DNA疫苗具有高效的抗鸡新城疫病毒感染的作用，与三组对照组相效果十分显著(p＜0.01)，一旦接受pVAX1-LasotaF DNA疫苗免疫，连续四次用强新城疫病毒NDV Lasota E4病毒株攻击，鸡群均不会被病毒感染，证明pVAX1-LasotaF DNA疫苗抗病毒效果稳定、可靠。
实施例9.pVAX1-LasotaF DNA疫苗在鸡群中实际治疗鸡新城疫的疗效实验在北京昌平养鸡厂孵育30只三黄鸡雏鸡，分为三组，每组10只。
第一组10只雏鸡5天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶200)，4～5天后小鸡出现轻微鸡瘟症状，此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaF DNA疫苗；接种疫苗后第二至三天小鸡新城疫病症状减弱；第六天后，2只小鸡患病死亡，另8只小鸡症状未见有明显变化；第十天后，5只小鸡恢复健康，其余5只死亡。
治疗实验表明pVAX1-LasotaF DNA疫苗具有一定的治疗鸡瘟的作用，对孵化后一周内的雏鸡，强病毒攻击感染鸡瘟后注射pVAX1-LasotaF DNA疫苗，疗效达50％。
第二组10只雏鸡15天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天后小鸡出现鸡瘟症状，此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaF DNA疫苗，接种疫苗后3～4天小鸡新城疫病症状明显减弱；第七天，除2只小鸡死亡外，其它8只小鸡鸡瘟症状减弱；第十天后，7只小鸡完全恢复健康，其余3只死亡；康复的7只小鸡一周后，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天后7只鸡健康活泼，均未出现鸡瘟症状。
第二组治疗实验表明pVAX1-LasotaF DNA疫苗对孵化后15天遭强病毒攻击感染鸡瘟的小鸡疗效达70％，且治疗鸡瘟的同时，还具有良好的预防效果。
第三组10只雏鸡30天后注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，4～5天后鸡出现鸡瘟症状，此时给每只小鸡注射20μg pVAX1-LasotaF DNA疫苗，接种疫苗后3～4天小鸡新城疫病症状明显减弱；第八天，除2只小鸡死亡外，其它8只鸡鸡瘟症状减弱；第十天后，8只小鸡完全恢复健康；康复的8只小鸡一周后，再次注射新城疫病毒NDV Lasota E4100μl(1∶100)，90天后8只鸡健康活泼，均未出现鸡瘟症状。
第三组治疗实验表明pVAX1-LasotaF DNA疫苗对孵化后30天遭强病毒攻击感染鸡瘟的小鸡疗效达80％。
这三组实验表明pVAX1-LasotaF DNA疫苗的疗效与鸡龄大小有一定相关性。


本发明涉及的新城疫的DNA疫苗由NDV－Lasota F基因和真核表达载体pVAX1组成，该DNA疫苗的构建是通过如下步骤NDV Lasota病毒总RNA的提取及纯化、设计特异性引物、通过TDRT－PCR扩增，克隆得到NDVLasotaF的全长cDNA基因序列、将纯化后的LasotaF全长cDNA片段重组到PCR ? 3.1真核表达质粒中。与当前常用的疫苗相比，本核酸疫苗达到相同免疫效果所需的量小，并且能同时、高效激发体液免疫和细胞免疫，比其它免疫手段免疫效力更强，而且安全、长效、稳定、操作便捷。本新城疫DNA疫苗可以用于预防和治疗鸡新城疫疾的药物。