专利名称：一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用的制作方法—对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用技术领域本专利涉及基因工程领域，具体地说涉及一种可以对人IL2RG基因高效打靶的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)的合成及打靶方法。IL2RG，又称白细胞介素_2受体亚基Y，是一种细胞因子受体的亚基，是至少6种白细胞介素受体复合物(IL-2，IL-4，IL-7，IL-9，IL-15和IL-21)的组成部分。IL2RG基因一般定位在哺乳动物的X染色体上。IL2RG基因突变会引起X-连锁严重的组合免疫缺陷病(X-SCID)。200多种不同IL2RG基因突变已确定存在于人X-连锁严重组合免疫缺陷病(X-SCID)患者基因组中，这些突变大多涉及一个或几个DNA碱基的变化。IL2RG基因突变后，导致相关的白细胞介素受体失去功能，重要的信号分子无法传递，淋巴细胞不能正常发育，缺乏功能成熟的淋巴细胞，人的免疫能力将彻底丧失。IL-7和IL-15突变后，T细胞和NK细胞群也将无法正常发育成熟。患者如果没有进行骨髓移植或病原体隔离将在出生数月内死亡。对患者的细胞进行定向的基因组靶向修饰，然后导入患者体内可以治疗该疾病。但人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行靶向修饰，传统的基因打靶依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换的基因打靶技术，效率非常低，通常只有10_6-10_8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛应用。而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到应用。近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般序列特异的核酸酶由一个DNA识别结构域和一个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别结构域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂(double-strand break, DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA的同源重组。锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases, ZFN)是现在研究最清楚也是应用最广泛的序列特异性核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fokl的两个亚基定位到一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB。ZFN的出现使得基因组靶向修饰向前迈进了一大步。然而ZFN技术还存在靶向不确定性，效率低，脱靶率高等问题，研究者自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。2009 年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector, TALE)表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向技术带来了新希望。TALE与Fokl融合后即形成转录激活子样效应因子核酸(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)。TALEN 的打革E原理与 ZFN 相同，只是识别特异的DNA的蛋白质不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称为重复可变的d1-residUes(RVDs)位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇论文发表在同一期的《自然生物技术》(NaturalBiotechnology)杂志上。
Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶Fokl的催化结构域上，当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因时，证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了一种基于分层连接的策略来构建12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR研究人员获得了带有特异性连接序列的单体，并将其克隆到包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。
今年七月MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了 TALEN在人胚胎干细胞和人IPSC中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对t匕，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购买的ZFNs相似，进一步验证了 TALENs是非常好的基因组编辑工具。
但是，目前尚无对人IL2RG基因进行打靶的报道，因此本领域迫切需要开展对人IL2RG基因进行高效打靶的研究。发明内容
本专利的目的之一是提供一种可以对人IL2RG基因高效打靶的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)的基因序列、融合蛋白及其重组质粒载体和宿主细胞等。
本发明的第一方面提供一对短肽，所述一对短肽序列为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2。
本发明第二方面，提供一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述一对短肽。
上述一对多核苷酸分别为SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45。
本发明的第三方面，提供一对蛋白质，所述一对蛋白质能特异性地识别二段核苷酸序列，所述二段核苷酸序列分别选自下述二个核苷酸序列:
(I)SEQ ID N0:10或SEQ ID NO: 10序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列；
(2) SEQ ID N0:13或SEQ ID NO: 13序列的一个或二个核苷酸经过取代所衍生的核苷酸序列。
上述一对蛋白质为上述的一对短肽二端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端。
上述转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端为人工改造的序列或天然的序列。
上述一对蛋白质序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
本发明第四方面，提供一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述一对蛋白质。
上述一对多核苷酸序列为SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41。
本发明第五方面，提供一对融合蛋白，所述一对融合蛋白为上述一对蛋白质分别与DNA切割蛋白融合而成。
上述DNA切割蛋白为DNA内切酶。
上述一对融合蛋白为上述一对蛋白质分别与DNA切割蛋白的二个亚基融合而成。
上述DNA切割蛋白为天然的或经过人工改造的FoklDNA内切酶。
上述一对融合蛋白序列为SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。
本发明的第六方面，提供一对多核苷酸，所述一对多核苷酸分别编码上述的一对融合蛋白。
上述一对多核苷酸序列分别SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47。
本发明的第七方面，提供一种含有上述一对多核苷酸中的任意一条多核苷酸的载体。
本发明第八方面，提供一种上述载体转化的宿主细胞。
上述宿主细胞为人离体细胞。在具体实施例中，上述宿主细胞为293T细胞。
本发明的第九方面，提供一种含有上述一对多核苷酸中的任意一对多核苷酸的载体。
本发明的第十方面，提供一种用上述含有一对多核苷酸的载体转化的宿主细胞。
上述宿主细胞为人离体细胞。在具体实施例中，上述宿主细胞为293T细胞。
本发明的第十一方面，提供上述一对融合蛋白在制备治疗人IL2RG基因突变所致的疾病的药物中的应用。优选的，所述一对融合蛋白序列为SEQ ID N0:48和SEQ ID NO:49。
本发明的第十二方面，提供上述编码融合蛋白的一对多核苷酸在制备治疗人IL2RG基因突变所致的疾病的药物中的应用。优选的，所述一对多核苷酸序列为SEQ ID NO:46 和 SEQ ID NO -Al0
本发明的第十三方面，提供一种人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步骤:
I)将表达上述一对融合蛋白的任意一对多核苷酸或该对多核苷酸的质粒转入人离体细胞；
2)人离体细胞在37°C下，培养3-7天，经PCR测序鉴定，靶位点发生突变的细胞即打靶细胞。
本发明的第十四方面，提供一种人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步骤:
1)将表达上述一对融合蛋白的任意一对多核苷酸或含有该对多核苷酸的质粒转入人离体细胞；
2)人离体细胞培养3-7天，其中至少一天在30°C下培养，其余时间为37°C培养，经PCR测序鉴定，靶位点发生突变的细胞即打靶细胞。
本发明的第十五方面，提供一种人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步骤:
I)将表达上述一对融合蛋白的任意一对多核苷酸或含有该对多核苷酸的质粒与抗puro的多核苷酸或其质粒共同转入人离体细胞；
2)37°C下，puro培养基筛选出表达抗puro蛋白的人离体细胞；
3) 37°C下，人离体细胞培养3-7天，经PCR测序鉴定，靶位点发生突变的细胞即打靶细胞。
本发明的第十六方面，提供一种人IL2RG基因打靶方法，所述基因打靶方法包括以下步骤:
I)将表达上述一对融合蛋白的任意一对多核苷酸或含有该对多核苷酸的质粒与抗puro的多核苷酸或其质粒共同转入人离体细胞；
2)37°C下，puro培养基筛选出表达抗puro蛋白的人离体细胞；
3)人离体细胞培养3-7天，其中至少一天在30°C下培养，其余时间为37°C培养，经PCR测序鉴定，靶位点发生突变的细胞即打靶细胞。
优选的，上述四个基因打靶方法中，所述一对融合蛋白序列为SEQ ID N0:48和SEQID NO:49o
优选的，上述四个基因打靶方法中，所述一对多核苷酸序列为SEQ ID Ν0:46和SEQID NO:47ο
上述基因打靶方法中的筛选鉴定为，利用puro筛选出成功转入目标多核苷酸或目标质粒的转染细胞，非转染细胞不能存活。PCR测序鉴定，IL2RG基因发生突变的细胞即为打靶细胞。
为实现上述目的，本研究经大量实验，获得一对转录激活子样效应因子核酸酶:IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，由两个可以分别识别人IL2RG基因exon2上相邻的二段核苷酸的DNA识别结构域分别与一个经人工改造的核酸内切酶Fokl的两个异源亚基融合得到的融合蛋白。
根据本专利，所述的一对转录激活子样效应因子核酸酶为IL2RG-TALEN-L和IL2RG-TALEN-R，其核苷酸分别具有SEQ ID NO:46和SEQ ID N0:47所示的序列。
根据本专利，所述的一对转录激活子样效应因子核酸酶为IL2RG-TALEN-L和 IL2RG-TALEN-R,分别识别人 IL2RG 基因 exon2 上的 5’ tcagtgttttgtgtt 3，和5’ gctgttccaagtgcaat 3’ 序列。


图1:人工设计的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)识别的DNA序列及位点
图2:18个识别模块连接策略示意图
A =PCR为每个识别模块添加酶切识别序列及连接结头过程示意图
B.PCR为每个识别模块添加酶切识别序列及连接结头之后示意图
C.PCR扩增6重复模块与中间载体示意图
D.最终构建的TALEN示意图
图3:中间载体 pCMV-NLS-TALE backbo ne-Fokl (R) -1ntermediate 的不意图
图4:最终载体 pEFla-NLS-TALE backbone-Fokl (R) -pA 的示意图
图 5:载体 pEFl-NLS-TALE backbone-Fokl (L) -1RES-PURO-pA 的示意图
图 6:最终的 TALEN 质粒 pEFla-NLS-TALE backbone N terminal-1L2RG_TALEN-Ll-TALE backbone C terminal-Fokl (L)-1RES-PURO-pA 的不意图
图7:T7Endonuclease I酶切变性杂交处理的打靶位点DNA PCR片段的电泳图
图8:IL2RG基因在打靶位点的基因型变化，-表示碱基缺失，小写字母cgag表示喊基插入
实施例1TALENs樽块序列的设计
1.NCBI下载人IL2RG的基因组序列(编号NC_000023.10)，选择exon2为打靶目标。
2.设计引物并PCR扩增基因组上打靶位点片段，并测序。
PCR引物及测序引物设计如表I


本发明提供了一对短肽、蛋白质和多核苷酸、其宿主细胞及其应用，提出了一种可以对人细胞内源的IL2RG基因高效打靶的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)基因的人工合成方法，以及用含有该基因的重组质粒进行定向打靶的方法。所述的转录激活子样效应因子核酸酶含有一对转录激活子样效应因子(TALEs)蛋白及分别与其融合的DNA内切酶的催化亚基，可以分别识别人IL2RG基因exon 2上的两个相邻位点。在对TALEs的氨基酸序列进行设计的基础上，合成了编码该TALEN的核苷酸序列及构建了包含该核苷酸序列的载体，通过用TALENs质粒转染细胞，可以大大地提高细胞打靶的效率。