专利名称：Casb618多核苷酸和多肽及其用途的制作方法图15(登录GB HTG4AC009700)具有同源性。SEQ ID NO1的核苷酸序列是cDNA序列，而且包含编码320个氨基酸的多肽即SEQ ID NO2多肽的多肽编码序列(核苷酸259-1219)。编码SEQ IDNO2的多肽的核苷酸序列可以与SEQ ID NO1中的多肽编码序列相同，或者可以是与SEQ ID NO1中的多肽编码序列不同的序列，由于遗传密码丰余性(简并性)，所述不同序列也编码SEQ ID NO2的多肽。SEQ ID NO2的多肽与任何已知功能的其他蛋白无关，例外的是与Caenorhabditis elegans假设的42.1kd蛋白c06el.3(登录P34298)。预期本发明的优选多肽和多核苷酸与其同源多肽和多核苷酸具有特别相似的生物学功能/特性。此外，根据情况，本发明优选的多肽、免疫片段和多核苷酸具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的至少一种活性。本发明还涉及在确定SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的相应全长序列之前首次鉴定的部分或其它不完整的多核苷酸序列和多肽序列。因此，再一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸(a)包含在SEQ ID NO3的全长上与SEQ ID NO3存在至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、进一步更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性的核苷酸序列；(b)具有在SEQ ID NO3的全长上与SEQ ID NO1存在至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、进一步更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％同一性的核苷酸序列；(c)SEQ ID NO3的多核苷酸。SEQ ID NO3的核苷酸序列来自EST(表达序列标志)序列。本领域技术人员知道在EST序列中不可避免地会有一些核苷酸序列阅读错误(见Adams，M.D.等人，Nature 377(增刊)3，1995)。因此，SEQ IDNO3的核苷酸序列在序列精确性上受到同样的固有限制。可以使用标准克隆和筛选技术，从由人类结肠癌细胞、肺癌细胞、子宫癌细胞和胎儿组织细胞的mRNA得到的cDNA文库中获得本发明的多核苷酸(例如Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring harbor，N.Y.(1989))。也可以从天然来源如基因组DNA文库获得本发明的多核苷酸，或使用众所周知和商业性可用技术合成本发明的多核苷酸。当本发明的多核苷酸用于重组产生本发明多肽时，所述多核苷酸可以包括成熟多肽本身的编码序列；或与其它编码序列在同一可读框内的成熟多肽编码序列，所述其它编码序列如编码前导序列或分泌序列、前蛋白(pre-protein)序列、原蛋白(pro-protein)序列或前原蛋白(prepro-protein)序列或其它融合肽部分的编码序列。例如可以编码有利于纯化融合多肽的标记序列。在本发明这一方面的某些优选实施方案中，所述标记序列是在pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供并在Gentz等人，Proc Natl Acad Sci USA(1989)86821-824中描述的六组氨酸肽，或者所述标记序列是HA标记。所述多核苷酸还可以包含非编码5’序列和3’序列，如转录但不翻译的序列、剪切信号和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。本发明的其它实施方案包括编码包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽变异体的多核苷酸，在所述氨基酸序列中几个(如5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个)氨基酸残基以任何组合发生取代、缺失或添加。
与SEQ ID NO1中的核苷酸序列相同或足够相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针或用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及用于分离与SEQ ID NO1具有高度序列相似性的其它基因(包括编码人类来源的共生同源物(paralogs)以及非人类物种的共生同源物和直向同源物(ortholog)的基因)的cDNA和基因组克隆。通常这些核苷酸序列与参比物的核苷酸序列70％相同、优选80％相同、更优选90％相同、最优选95％相同。所述探针或引物一般包含至少15个核苷酸，最好包含至少30个核苷酸，而且可以具有至少50个核苷酸。特别优选的探针将具有30到50个核苷酸。特别优选的引物将具有20到25个核苷酸。尤其是由同源动物来源的序列得到的多肽或多核苷酸可以用作免疫原，以获得与人类基因的交叉反应性免疫反应。
可以使用包括下列步骤的方法获得编码本发明多肽(包括人类以外其它物种的同源物)的多核苷酸使用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的标记探针，在严格杂交条件下筛选合适的文库；以及分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。这样的杂交技术对于本领域技术人员是众所周知的。优选的严格杂交条件包括用包含以下成分的溶液于42℃温育过夜50％甲酰胺，5xSSC (150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％葡聚糖硫酸酯以及20微克/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA；然后在约65℃下在0.1xSSC中洗涤滤膜。因此，本发明还包括使用具有SEQ ID NO1的序列或其片段的标记探针，在严格杂交条件下筛选合适文库可获得的多核苷酸。
有经验的技术人员知道，在许多情况下，分离的cDNA序列是不完整的，因为编码多肽的区在cDNA的5’缺失。
对于本领域技术人员来说，有几种获得全长cDNA或延伸短cDNA的方法是可利用并且众所周知的，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)的方法(见例如Frohman等人，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最新改进的该技术例如MarathonTM技术(Clontech LaboratoryInc.)已经明显简化了对更长cDNA的搜索。在MarathonTM技术中，从由选定组织提取的mRNA制备cDNA，并将“接头”序列连接到每个末端。然后使用组合的基因特异性寡核苷酸引物和接头特异性寡核苷酸引物，进行核酸扩增(PCR)以扩增所述cDNA“缺失的”5’端。然后使用“嵌套”引物重复所述PCR反应，“嵌套”引物即是设计在所扩增的产物内退火的引物(通常是在所述接头序列的远3’端退火的接头特异性引物和在已知基因序列的远5’端退火的基因特异性引物)。然后可通过DNA测序分析该反应的产物，随后通过直接连接所述产物到存在的cDNA获得完整序列，或使用新的序列信息设计5’引物来进行独立的全长PCR，构造全长cDNA。
可以通过本领域内众所周知的方法，用包含表达系统的遗传工程宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此，再一方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的表达系统，涉及使用这样的表达系统遗传工程操作的宿主细胞，以及涉及通过重组技术产生本发明多肽。也可以使用无细胞翻译系统利用由本发明的DNA构造物得到的RNA，产生这样的蛋白。
为进行重组生产，可以遗传工程操作宿主细胞以加入用于本发明多核苷酸的表达系统或其部分。可以用在许多标准实验室手册中介绍的方法将多核苷酸引入宿主细胞，所述实验室手册如Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等人，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。优选的这样的方法包括，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、scrape loading、弹道引入或感染。
本发明的蛋白最好与反式硫氧还蛋白(thioredoxin in trans)(TIT)共表达。相对于顺式硫氧还蛋白，优选与反式硫氧还蛋白共表达，使得抗原不含硫氧还蛋白，从而不必加入蛋白酶。硫氧还蛋白共表达使本发明的蛋白容易溶解。硫氧还蛋白共表达对于蛋白纯化产量、所纯化蛋白的溶解度和质量也有显著影响。
合适宿主的典型实例包括细菌细胞，如链球菌(Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)细胞；真菌细胞，如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)细胞；昆虫细胞，如果蝇属S2(Drosophila S2)和SpodopteraSf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞。
可以使用各种表达系统，例如染色体系统、附加体系统以及病毒衍生系统，如衍生自细菌质粒的载体、衍生自噬菌体的载体、衍生自转座子的载体、衍生自酵母附加体的载体、衍生自插入元件的载体、衍生自酵母染色体元件的载体、衍生自病毒(如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒)的载体、以及它们组合衍生的载体，如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的载体(诸如粘粒和噬菌粒)。所述表达系统可以包含调节以及引起表达的控制区。一般来说，可以使用在宿主中能够维持、繁殖或表达多核苷酸以产生多肽的任何系统或载体。可以通过多种众所周知的常规技术中的任何一种技术将合适核苷酸序列插入表达系统中，所述技术如Sambrook等人，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(见上文)中所述技术。可以将合适的分泌信号加入所需的多肽以使转录蛋白能够分泌入内质网的腔、周质间隙或胞外环境。这些信号对于所述多肽可以是内源信号，或者它们可以是异源信号。
所述表达系统也可以是活的重组微生物，例如病毒或细菌。可以将目的基因插入活的重组病毒或细菌的基因组。用该活的载体接种和体内感染将使所述抗原在体内表达并诱导免疫反应。用于该目的的病毒和细菌可以是例如痘病毒(如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀痘病毒)、甲病毒属(新培斯病毒、塞姆利基森林病毒、委瑞内拉马脑炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘-带状疱疹病毒等)、李斯特菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、BCG。这些病毒和细菌可以是有毒力的，或者以各种方式减毒以获得活疫苗。这样的活疫苗也构成本发明的一部分。
可以用众所周知的方法由重组细胞培养物回收和纯化本发明多肽，所述方法包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交换层析或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。最优选使用离子金属亲和层析(IMAC)进行纯化。当所述多肽在胞内合成、分离和或纯化过程中变性时，可以使用众所周知的重折叠蛋白技术重建活性构象。
本发明的另一重要方面涉及在哺乳动物中诱导、强化或调节免疫反应的方法，包括用本发明的片段或完整多肽或多核苷酸接种所述哺乳动物，所述片段或完整多肽或多核苷酸足以产生抗体和/或T细胞免疫反应，以预防或治疗性治疗癌症和自身免疫性疾病以及相关病症。而本发明的再一方面涉及在哺乳动物中诱导、强化或调节免疫反应的方法，包括通过载体或细胞传递本发明的多肽以诱导这样的免疫反应，产生预防或治疗所述哺乳动物疾病的免疫反应，其中所述载体或细胞在体内控制所述多核苷酸的表达并编码所述多肽。
本发明的又一方面涉及免疫/疫苗制剂(组合物)，当将所述免疫/疫苗制剂(组合物)引入哺乳动物宿主时，在该哺乳动物体内诱导、强化或调节针对本发明多肽的免疫反应，其中所述组合物包含本发明多肽或多核苷酸或其以上定义的免疫片段。所述疫苗制剂还可以包含合适的载体。由于多肽可在胃内分解，所以最好胃肠外给予(例如皮下注射、肌内注射、静脉内注射或皮内注射)。适于胃肠外给予的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液以及水性和非水性无菌悬浮液，所述无菌注射溶液可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得所述制剂与接受者血液等渗的溶质，所述无菌悬浮液可以包括悬浮剂或增稠剂。所述制剂可以装在单位剂量容器或多剂量容器(例如密封安瓿和小瓶)中，并且可以保存在冻干环境下，只需要在使用前加入无菌液体载体。
本发明的再一方面涉及使用哺乳动物免疫系统细胞，体外诱导针对本发明的片段或完整多肽或多核苷酸的免疫反应或针对包含本发明多肽或多核苷酸的分子的免疫反应，并将这些活化的免疫细胞再输注入所述哺乳动物以治疗疾病。如下完成所述免疫系统细胞的活化在存在或不存在各种免疫调节剂分子的情况下，将所述细胞与本发明的完整多肽或多核苷酸或者包含本发明的多肽或多核苷酸的分子体外温育。本发明的又一方面涉及通过给予抗原提呈细胞而免疫哺乳动物，所述抗原提呈细胞通过体外加载(loading)本发明的部分或完整多肽或包含本发明多肽的分子而修饰并以免疫原性方式体内给予。或者，可以在体外用包含本发明的片段或完整多核苷酸的载体或者用包含包括本发明多核苷酸的分子的载体转染抗原提呈细胞以表达相应多肽，然后以免疫原性方式体内给予。
本发明的疫苗制剂也可以包括增强所述制剂的免疫原性的佐剂系统。所述佐剂系统最好增强TH1型反应。
免疫反应可主要分为两大类体液免疫反应或细胞介导的免疫反应(传统上其特征分别在于保护性抗体机制和效应细胞机制)。这两类免疫反应称为TH1型反应(细胞免疫反应)以及TH2型免疫反应(体液免疫反应)。
非常典型的TH1型免疫反应的特征在于产生抗原特异性单倍型限制性细胞毒性T淋巴细胞以及天然杀伤细胞反应。在小鼠中，通常TH1型反应其特征在于产生IgG2a亚型抗体，而在人类中这些抗体相当于IgG1型抗体。TH2型免疫反应的特征在于产生各种各样的免疫球蛋白同种型，在小鼠包括IgG1、IgA和IgM。
可以认为产生这两种类型免疫反应的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向于促进诱导对给定抗原的细胞介导的免疫反应，而高水平的TH2型细胞因子倾向于促进诱导对抗原的体液免疫反应。
TH1型免疫反应和TH2型免疫反应的区别并不是绝对的。实际上，有个别人支持将免疫反应描述为主要是TH1型或主要是TH2型的免疫反应。然而，按照Mosmann和Coffman描述鼠CD4+ve T细胞克隆时采用的细胞因子家族分类来考虑细胞因子家族常常是便利的(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞不同模式的淋巴因子分泌产生不同的功能特性Annual Review of Immunology，7，第145-173页)。传统上，TH1型反应与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。其它常常与诱导TH1型免疫反应直接相关的细胞因子如IL-12并不是T细胞产生的。相反，TH2型反应与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13分泌有关。
已知某些疫苗佐剂特别适于刺激TH1型或TH2型细胞因子反应。传统上，在免疫接种或感染后免疫反应的TH1∶TH2平衡的最佳指标包括用抗原再刺激后在体外直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异性抗体反应的IgG1∶IgG2a比例。
因此，TH1型佐剂是在体外用抗原再刺激时优先刺激分离的T细胞群体产生高水平TH1型细胞因子而且促进产生CD8+细胞毒性T淋巴细胞以及与TH1型同种型有关的抗原特异性免疫球蛋白反应的佐剂。
国际专利申请号WO 94/00153和WO 95/17209介绍了能够优先刺激TH1细胞反应的佐剂。
3脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)就是一种这样的佐剂。这从GB 2220211(Ribi)得知。在化学上它是具有4、5或6个酰化链的3脱氧酰化单磷酰脂质A的混合物，由Ribi Immunochem，Montana生产。3脱氧酰化单磷酰脂质A的优选形式公开于欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
3D-MPL的颗粒最好小得足以使其可以无菌滤过0.22微米的膜(欧洲专利号0 689 454)。3D-MPL剂量范围为每剂10μg-100μg、最好25-50μg，其中所述抗原的剂量范围通常为每剂2-50μg。
另一种优选的佐剂包含QS21，即一种从Quillaja Saponaria Molina的树皮得到的Hplc纯化无毒部分。可选地将QS21与3脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)混合，可选地还与另一种载体混合。
美国专利号5,057,540公开了制备QS21的方法。
以前已经描述了包含QS21的非反应原性佐剂制剂(WO96/33739)。已经证实包含QS21和胆固醇的这类制剂当与抗原一起配制时是成功的TH1刺激佐剂。
TH1细胞反应优先刺激物的其它佐剂包括免疫调节性寡核苷酸，例如在WO 96/02555中公开的非甲基化CpG序列。
还考虑组合诸如上述的不同TH1刺激佐剂，以提供属于TH1细胞反应优选刺激物的佐剂。例如QS21可以与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比例通常约为1∶10到10∶1；最好是1∶5到5∶1，而实际上常常是1∶1。最佳协同作用的优选范围是2.5∶1到1∶1的3D-MPL∶QS21。
依照本发明的疫苗组合物中最好还存在一种载体。所述载体可以是水包油乳剂，或者是一种铝盐，如磷酸铝或氢氧化铝。
优选的水包油乳剂包含一种可代谢的油如角鲨烯、α-生育酚和Tween 80。在一个特别优选的方面，用这样的乳剂将本发明疫苗组合物的抗原与QS21和3D-MPL混合。此外所述水包油乳剂可以含有Span 85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
通常给予人时，疫苗中的QS21和3D-MPL含量范围为每剂1μg-200μg，如10-100μg，最好是10μg-50μg。而水包油乳剂通常含有2-10％的角鲨烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween 80。角鲨烯∶α-生育酚的比例最好是等于或小于1，因为这样的比例提供更稳定的乳浊液。Span 85含量也可以为1％。在某些情况下，本发明的疫苗另外含有一种稳定剂可能是有利的。
无毒的水包油乳剂最好在水溶液载体中含有一种无毒的油，如角沙烷或角鲨烯，以及一种乳化剂如Tween 80。所述水溶液载体可以是例如磷酸缓冲盐溶液。
WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，该制剂为包含QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳剂。
本发明还提供多价疫苗组合物，所述多价疫苗组合物包含本发明的疫苗制剂以及其它抗原，尤其是用于治疗癌症、自身免疫性疾病和相关病症的抗原。这样的一种多价疫苗组合物可以包括前面所述的TH-1诱导佐剂。
本发明还涉及使用以下物质作为诊断试剂由本发明的多核苷酸获得的引物形式的多核苷酸以及本发明多肽特异性抗体或试剂形式的多肽。
鉴定血液或组织中使得能够检测到癌症发生过程中非常早期的变化的遗传或生化标记物有助于确定患者的最佳疗法。可以使用肿瘤监测标记如多核苷酸表达诊断不同形式和状态的癌症。鉴定本发明的多核苷酸的表达水平有助于对癌性疾病分期以及对癌性组织性质进行分级。所述分期过程监测癌症的发展，并根据在进行活组织检查的区域是否存在恶性组织而确定。本发明的多核苷酸可以通过鉴定癌症侵袭性的标记例如在身体不同部位存在所述标记而使所述分期过程更准确。所述癌症的分级描述了肿瘤与其同类型的正常组织相近程度，并通过它的细胞形态学和其它分化标记进行评估。由于本发明的多核苷酸能够帮助确定肿瘤细胞的分化状态，因此它们可以用于确定肿瘤分期。
所述诊断测定通过包含下列步骤的方法的诊断提供诊断或确定对癌症、自身免疫性疾病和相关病症的易感性的方法测定受检者样品中异常降低或升高的多肽或mRNA。该诊断方法被称为差异表达。比较特定基因在患病组织和正常组织中的表达。比较两种组织中多核苷酸相关基因、mRNA或蛋白质的差异，例如在怀疑患病的人体组织中，指示基因变化或调节所述基因的基因变化的分子量、氨基酸序列或核苷酸序列、相对丰余度差异。
可以在RNA水平上测量表达的降低或增加。首先从所述两种组织中分离polyA RNA，可以通过例如在组织切片上的原位杂交、逆转录酶-PCR、使用包含poly A+mRNA的RNA印迹或任何其它直接或间接的RNA检测方法，检测相当于差异表达的本发明多核苷酸的基因编码的mRNA。与正常组织相比，给定RNA在患病组织中的表达增强或降低提示所述转录物和/或所述表达的蛋白在疾病中具有某种作用。因此，检测到相当于SEQ ID NO1或3的mRNA相对于正常水平增高或降低说明所述患者存在癌症。
通过用样品制备表达序列标记(EST)的文库，可以确定所述样品中的mRNA表达水平。可以用EST在所述文库中的相对表现度评估所述基因转录物在起始样品中的相对表现度。然后将受试样品的EST分析与参比样品的EST分析相比较，确定目的多核苷酸的相对表达水平。
可以使用基因表达连续分析(SAGE)方法(Velculescu等人，Al.Science(1995)270484)、差异展示方法(例如US 5,776,683)或依赖于核苷酸相互作用特异性的杂交分析进行其它mRNA分析。
另一方面，可以在蛋白质水平上进行比较。在对两种组织提取出的蛋白进行的蛋白质印迹中，使用抗体检测多肽，可以比较两种组织中的蛋白大小。使用抗相应蛋白的抗体，也可以免疫学检测表达水平和亚细胞定位。可用于测定宿主样品中的蛋白(如本发明多肽)水平的其它测定技术是本领域内技术人员众所周知的。与正常组织中相同蛋白的表达水平相比，在所述患病组织中的多肽表达水平升高或降低说明所表达的蛋白质可能参与所述疾病的形成。
在本发明的测定中，通过检测至少一种SEQ ID NO1或3所示序列编码的基因产物表达水平，可以确定诊断。也可利用比较患病组织与正常组织中mRNA或蛋白质水平来跟踪疾病是恶化还是缓解。
可以使用多核苷酸阵列测量样品中大量的多核苷酸序列。可用于检测基因的差异表达以及确定基因功能。例如可利用多核苷酸序列SEQ ID NO1或3阵列确定任何一种多核苷酸是否在正常细胞和癌症细胞差异表达。在本发明的一个实施方案中，可以构造包含SEQID NO1或3核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列，有效筛选例如遗传突变。阵列技术方法是众所周知的而且具有普遍应用性，可用于阐明分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(见例如M.Chee等人，Science，第274卷，第610-613页(1996))。
本文所用的“诊断”包括确定受检者对疾病的易感性、确定受检者目前是否患病以及罹患所述疾病的患者的预后。
本发明还涉及用于进行诊断测定的诊断试剂盒，它包括(a)本发明的多核苷酸或其片段，所述多核苷酸最好是SEQ IDNO1或3的核苷酸序列；(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
(c)本发明多肽或其片段，所述多肽最好是SEQ ID NO2的多肽；或(d)抗本发明多肽的抗体，最好是抗SEQ ID NO2多肽的抗体。
本发明的核苷酸序列对于染色体定位也是有价值的。所述序列特异性靶向人类各染色体的特定位点，并可与之杂交。依照本发明将相关序列作图到染色体上，这是将那些序列与基因相关疾病联系起来的重要的第一步。一旦将序列作图到精确的染色体位点上，就可以将该序列在所述染色体上的物理位置与遗传图谱数据相联系。这样的数据可以在例如V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library在线获得)中找到。然后通过连锁分析(物理性相邻基因的共遗传)鉴定已经作图到同一染色体区的基因和疾病之间的关系。也可以测定患病个体和非患病个体之间在cDNA或基因组序列方面的差异。
本发明多肽或它们的片段或它们的类似物或表达它们的细胞也可以用作免疫原，产生对本发明多肽具有免疫特异性的抗体。术语“免疫特异性”是指所述抗体与本发明多肽的亲和力明显高于与在先技术中的其它相关多肽的亲和力。
又一方面，本发明提供对依照本发明多肽或其前面定义的免疫片段具有免疫特异性的抗体。所述抗体最好是单克隆抗体。
可以通过使用常规方法，给予动物(最好是非人类动物)本发明多肽或带有表位的片段、类似物或细胞，获得针对本发明多肽产生的抗体。为制备单克隆抗体，可以使用通过连续细胞系培养产生抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature(1975)256495-497)、trioma技术、人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor等人，Immunology Today(1983)472)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
也可以改进用于产生单链抗体的技术如美国专利第4,946,778号介绍的技术，制备抗本发明多肽的单链抗体。同时，可以使用转基因小鼠或其它生物(包括其它哺乳动物)来表达人源化抗体。
可以使用上面介绍的抗体分离或鉴定表达所述多肽的克隆，或通过亲和层析纯化所述多肽。也可使用本发明的抗体预防或治疗癌症(尤其是卵巢癌和结肠癌)、自身免疫性疾病和相关病症。
本发明的另一方面涉及诱导或调节哺乳动物免疫反应的方法，包括用本发明多肽接种所述哺乳动物，接种量足以产生抗体和/或T细胞免疫反应以保护或改善疾病的症状或进一步发展。而本发明的又一方面涉及诱导或调节哺乳动物免疫反应的方法，包括通过载体传递本发明多肽，以诱导这样的免疫反应来产生保护所述哺乳动物抵抗疾病的抗体，其中所述载体在体内控制所述多核苷酸的表达并编码所述多肽。
因此，人们知道，本发明提供治疗与CASB618多肽活性的存在、过量或者表达不足有关的异常病症的方法，所述异常病症例如癌症和自身免疫性疾病，尤其是卵巢癌和结肠癌。
本发明还提供筛选化合物以鉴定刺激或抑制CASB618多肽功能的化合物的方法。一般来说，可以使用激动剂或拮抗剂治疗或预防上文所述疾病。可以从多种来源鉴定化合物，所述来源例如细胞、无细胞制备物、化学文库和天然产物混合物。根据具体情况，如此鉴定的这样的激动剂、拮抗剂或抑制剂可以是所述多肽的天然底物或修饰底物、配体、受体、酶等；或者所述激动剂、拮抗剂或抑制剂可以是所述多肽的结构模拟物或功能模拟物(见Coligan等人，Current Protocols in Immunology 1(2)第五章(1991))。筛选方法是本领域内技术人员周知的。其它筛选方法可见于例如D.Bennett等人，JMol Recognition，852-58(1995)；和K.Johanson等人，J Biol Chem，270(16)9459-9471(1995)以及其中的参考文献。
因此，本发明提供筛选鉴定刺激或抑制本发明多肽的功能的化合物的方法，包括选自以下的方法
(a)利用与候选化合物直接或间接结合的标记，测量候选化合物与所述多肽(或带有所述多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；(b)在标记竞争物存在下，测量候选化合物与所述多肽(或带有所述多肽的细胞或膜)或其融合蛋白的结合；(c)使用适用于带有所述多肽的细胞或细胞膜的检测系统，测试所述候选化合物是否产生由于所述多肽的激活或抑制而产生的信号；(d)将候选化合物与含有权利要求1的多肽的溶液混合形成混合物，测量在所述混合物中所述多肽的活性，并将所述混合物的活性与标准品比较；或(e)使用例如ELISA测定，检测候选化合物对细胞中编码所述多肽的mRNA和所述多肽的产生的影响。
可以通过本领域已知的标准受体结合技术，使用本发明多肽鉴定膜结合受体或可溶性受体(如果有的话)。也可使用众所周知的筛选方法鉴定与本发明多肽竞争结合其受体的本发明多肽的激动剂或拮抗剂(如果有的话)。
因此，另一方面，本发明涉及鉴定本发明多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等等的筛选试剂盒；或涉及鉴定降低或增强所述多肽的产生的化合物的筛选试剂盒，它包括(a)本发明的多肽；(b)表达本发明多肽的重组细胞；(c)表达本发明多肽的细胞膜；或(d)抗本发明多肽的抗体；所述多肽最好是SEQ ID NO2的多肽。
有经验的技术人员很容易知道，本发明多肽也可用于根据结构设计所述多肽的激动剂、拮抗剂或抑制剂的方法，所述方法如下进行(a)首先测定所述多肽的三维结构；
(b)推导激动剂、拮抗剂或抑制剂的可能反应位点或结合位点的三维结构；(c)合成预期与所推导的结合位点或反应位点结合或反应的候选化合物；(d)测试所述候选化合物是否确实是激动剂、拮抗剂或抑制剂。
也可使用基因疗法使接受者的相关细胞内源性产生CASB618多肽。关于基因疗法的综述参见Human Molecular Genetics，T Strachan和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)的第20章“基因治疗和其它基于分子遗传学的治疗方法”(以及其中引用的参考文献)。
Pharmaceutical Biotechnology，第61卷“疫苗设计-亚单位和佐剂方法”，Powell和Newman编辑，Plenum Press，1995中一般性介绍了疫苗制剂。New Trends and Developmentsin Vaccines，Voller等人编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。例如Fullerton的美国专利4,235,877介绍了脂质体包囊。例如Likhite的美国专利4,372,945和Armor等人的美国专利4,474,757公开了蛋白质与大分子的缀合。
各疫苗剂量中的蛋白质量选定为诱导免疫保护性反应而不会在普通接种者引起明显副作用的量。这样的量随使用的特定免疫原而不同。一般来说，预期每剂量将包含1-1000μg蛋白、优选2-100μg蛋白、最好4-40μg蛋白。可以用包括观察接种者的抗体滴度和其它反应的标准研究确定具体疫苗的最佳量。在初次接种后，接受者可以在约4周后接受一次强化接种。
“分离”是指自然状态的“人为”改变。如果一种“分离的”组合物或物质是天然存在的，那么它的自然环境已改变、或已经从其自然环境中分离出来、或者两者兼而有之。例如作为本文使用的此术语，在活动物中天然存在的多核苷酸或多肽并不是“分离的”，但与其天然状态共存的物质分开的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是包括单链和双链区的未修饰RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。
“变异体”是指与参比多核苷酸或多肽不同但保持原有基本特性的多核苷酸或多肽。典型多核苷酸变异体的核苷酸序列与另一参比多核苷酸不同。变异体核苷酸序列变化可以改变或可以不改变参比多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所论述，核苷酸改变可能导致参比序列编码的多肽的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。典型多肽变异体的氨基酸序列与另一参比多肽不同。一般来说，差异是有限的，以便所述参比多肽和所述变异体的序列在总体上非常相似并在许多区是相同的。变异体和参比多肽可能由于任何组合的一个或多个取代、添加、缺失而在氨基酸序列上存在差异。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变异体可以是天然存在的变异体如等位基因变异体，或者所述变异体可以是未知的天然变异体。可以通过诱变技术或通过直接合成制备多核苷酸和多肽的非天然变异体。
本领域已知“同一性”是通过比较序列确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域“同一性”也是指根据情况，通过多肽或多核苷酸序列排列匹配确定的这样的序列之间的序列相关程度。用已知方法能够很容易地计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括但不限于下列文献介绍的方法Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编辑，Oxford UniversityPress，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，第I部分，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)。设计测定同一性的优选方法以获得所测试序列之间的最大匹配。测定同一性和相似性的方法可用公众可得到的计算机程序编制。用于测定两序列间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，Nucleic Acids Research 12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403-410(1990))。BLAST X程序可以从NCBI和其它来源公开得到(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)。也可以使用众所周知的Smith Waterman算法测定同一性。
优选使用的算法是FASTA。用该算法进行多肽序列或多核苷酸序列比较的优选参数包括以下参数空位罚分12空位拓展罚分4字串大小2，最大为6用其它方法进行多肽序列比较的优选参数包括以下参数1)算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比较矩阵Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8910915-10919(1992)空位罚分12空位长度罚分4可使用这些参数的程序可以作为“空位(gap)”程序从GeneticsComputer Group，Madison WI公开获得。上述参数是进行多肽比较(同时对末端空位没有罚分)的默认参数。
用于多核苷酸比较的优选参数包括下列参数1)算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比较矩阵匹配＝+10，错配＝0空位罚分50
空位长度罚分3可使用这些参数的程序可以作为“空位”程序从GeneticsComputer Group，Madison WI公开获得。上述参数是进行多核苷酸比较的默认参数。
举例来说，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO1的参比序列相同，即100％相同，或者与所述参比序列相比，它可包括高至某一整数的核苷酸改变。这样的改变可选自至少一个核苷酸缺失、取代(包括碱基转换和碱基颠换)或插入，并且所述改变可以发生在所述参比核苷酸序列的5′或3′末端位置或两个末端位置间的任何地方，或者各自单独散置于参比序列的核苷酸，或者散置于参比序列的一个或多个连续组。所述核苷酸改变的数量如下确定SEQ ID NO1核苷酸总数乘以相应同一性百分率的数字式百分数(除以100)，随后从所述SEQ ID NO1核苷酸总数减去该乘积，或nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO1核苷酸总数，y是例如0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)、0.90(90％)、0.95(95％)等等，其中将xn和y的任何非整数乘积从xn减去之前，将该乘积下舍到最近的整数。编码SEQ ID NO2多肽的多核苷酸中的改变可能在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，并因此在这样的改变后改变由所述多核苷酸编码的多肽。
同样，本发明多肽序列可以与SEQ ID NO2的参比序列相同，即100％相同，或者与所述参比序列比较，该序列可包括高至某一整数的氨基酸改变，以至同一性百分率小于100％。这样的改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，其中所述改变可以发生在所述参比多肽序列的氨基末端位置或羧基末端位置或两个末端位置间的任何地方，或者各自单独散置于参比序列的氨基酸，或者散置于参比序列中的一个或多个连续组。如下确定给定同一性百分率的氨基酸改变数目SEQ ID NO2氨基酸总数乘以相应同一性百分率的数字式百分数(除以100)，随后从所述SEQID NO2氨基酸总数减去该乘积，或na≤xa-(xa·y)其中na是氨基酸改变数目，xa是SEQ ID NO2氨基酸总数，y是例如0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)等等，其中将任何xa和y的非整数乘积从xa减去之前，将该乘积下舍到最近的整数。
“同源物”是本领域使用的遗传术语，是指多核苷酸序列或多肽序列与研究序列具有高度序列相关性。可以通过确定如上所述比较的序列之间的同一性和/或相似性水平而定量这样的相关性。属于该通用术语的有术语“直向同源物(ortholog)”和“共生同源物(paralog)”，“直向同源物”是指在另一物种为多核苷酸或多肽的功能等同物的多核苷酸或多肽，“共生同源物”是指当在同一物种内考虑时功能相似的序列。
附1图1图示CASB618在相应的正常结肠样品和肿瘤结肠样品中的表达水平。标示的数值是相当的肌动蛋白水平。N是指正常结肠，T是指结肠肿瘤。图2图2A、2B、2C和2D图示正常组织CASB618表达的实时PCR数据。其中简写代表图2ACo结肠；Ce子宫颈；Bra脑；Bo_Ma骨髓；Bl膀胱；Ao主动脉；Ad_Gl肾上腺图2BOv卵巢；Oe食管；Ly_No淋巴结；Lu肺；Li肝脏；Ki肾脏；Il回肠；心脏；HeFa_Tu输卵管图2CSp脾脏；Sm_In小肠；Sk_Mu骨骼肌；Sk皮肤；Re直肠；Pr前列腺；Pl胎盘；Pa_Thy甲状旁腺图2DTr气管；Thy甲状腺；Te睾丸；St胃；Spl脾脏图3图3图示以萘定酮酸诱导或没有用萘定酮酸诱导后，大肠杆菌AR120/pRIT15081提取物的SDS-PAGE凝胶(12.5％)；用单克隆抗体抗-NS1显示。泳道1为分子量标记；泳道2显示没有诱导3小时的大肠杆菌AR120/pRIT15081提取物；泳道3显示诱导3小时的大肠杆菌AR120/pRIT15081提取物；泳道4显示没有诱导4.5小时的大肠杆菌AR120/pRIT15081提取物；泳道5显示诱导4.5小时的大肠杆菌AR120/pRIT15081提取物。图4图4图示纯化CASB618的SDS-PAGE凝胶。
泳道1和8为分子量标记；泳道2显示裂解细胞沉淀物；泳道3显示透析前的纯化蛋白；泳道4显示纯化的透析蛋白；泳道6显示纯化的透析蛋白0.22μm。
使用TriPure试剂(Boehringer)从迅速冰冻活检组织中提取正常结肠和结肠肿瘤的总RNA。正常组织总RNA购自InVitrogen或用TriPure试剂从迅速冰冻活检组织中提取。使用寡聚dT磁珠(Dynal)从DNA酶处理后的总RNA纯化poly-A+mRNA。使用SybrII染料(MolecularProbes)，通过分光荧光测定(VersaFluor，BioRad)定量mRNA。使用Perkin-Elmer Primer Express软件，用针对TaqMan扩增条件的默认选项，设计用于实时PCR扩增的引物。
根据标准PCR方法组织实时反应，在每个反应中使用2ng纯化mRNA。实时检测时以1/75000的最终稀释度加入Sybr I染料(Molecular Probes)。用Perkin-Elmer Biosystems PE7700系统以常规仪器设置进行扩增(40个循环)和实时检测。使用PE7700序列检测器软件计算Ct值。每位患者的样品获得2个Ct值肿瘤Ct(CtT)和相应的正常结肠Ct值(CtN)。实时PCR获得的Ct值与目标模板的拷贝数成对数线性关系。由于在常规实验条件下PCR扩增的效率接近理论扩增效率，因此2(CtN-CtT)估测两种组织相对转录物水平(即mRNA在肿瘤中成倍过量表达)。用23位患者的活检组织进行实时PCR反应。部分患者的样品检测2次。如上所述计算每位患者的mRNA过量表达的水平。然后根据该数据组计算所述候选抗原mRNA过量表达的平均水平以及过量表达所述候选抗原的患者比例。以相同样品中的肌动蛋白标化各个数值(比值)，并示于图1。因此数值1表示与肌动蛋白表达水平相同。结果以对数标度表示。
还用相同方法测试了代表28个不同组织的总计81个正常组织样品。比较候选抗原的Ct值与相同组织样品获得的肌动蛋白Ct值。标化值示于图2A-D。结肠癌和正常结肠样品的实时PCR结果总结
结论相对于相邻的正常结肠组织，CASB618在大部分肿瘤中过量表达。其它正常组织尤其是一个前列腺样品中仅有少量表达。实施例2DNA微阵列使用DNA微阵列检测大批基因在多个样品中的mRNA表达分布。该信息用来补充实时PCR获得的资料，而且独立测量肿瘤和正常组织基因表达水平。
目前制备DNA微阵列的技术实例包括1)Affymetrix“GeneChip”阵列，其中用光刻蚀法(photolithographic process)经固相化学合成在芯片表面上合成寡核苷酸；2)DNA斑点技术，其中将微量DNA溶液自动点样沉积在固相(例如玻璃)表面，然后使其固定。在这两种情况下，芯片与从目的组织(例如正常组织、肿瘤等)提取而且用放射性或荧光报道分子标记的cDNA或cRNA杂交。使所述标记材料与芯片杂交，用特殊扫描器测定与芯片上各序列结合的探针量。可用单一荧光报道物(或放射性)进行实验，或者可用两种荧光报道物进行实验。在后一情况下，用报道分子之一分别标记两种样品。然后这两种标记的样品与DNA芯片上的序列竞争性杂交。测定芯片上各序列的两种荧光信号比。该比值用来计算转录物在两种样品中的相对丰余度。详细的方案可从许多来源获得，包括“DNA MicroarraysA pratical approach.Schena M.Oxford University Press 1999”和WorldWide Web(http∥cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html)、http∥arrayit.com∥DNA-Microarray-Protocals/)和专业供应商(例如Affymetrix)。
因此，大部分的结肠癌EST清楚表明，该基因在结肠癌过量表达。另外，其他肿瘤(胰腺癌、甲状腺癌)也能够表达所述基因。
当不能从所述cDNA文库直接获得全长基因时，使用RACE技术(Marathon试剂盒，ClonTech)分离缺失的序列。该方法依赖于mRNA逆转录为双链cDNA，连接接头到所述cDNA的末端，并使用基因特异性引物和一个寡核苷酸接头扩增所述cDNA的所需末端。将Marathon PCR产物克隆进质粒(pCRII-TOPO，InVitrogen)并测序。
获得的序列(SEQ ID NO1)具有259个氨基酸(SEQ ID NO2)的推定读框。使推定的蛋白序列进行细胞定位的预测算法(PSORThttp∥psort.nibb.ac.jp/和TopPredhttp∥www.biokemi.su.se/～server/toppred2/toppred_source.html)。预测具有4-5个跨膜区段；使用的2个方法中只有1个方法预测到所述信号序列。存在一个与一个预期的跨膜区段重叠的潜在亮氨酸拉链基序。存在3个潜在N-糖基化位点。亚细胞定位还不清楚，浆膜是最可能的部位。
可以在两种微生物宿主，即大肠杆菌和酵母(如啤酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达重组蛋白。这使得能够选择用于该特定抗原生产的具有最佳特性的表达系统。一般来说，所述重组抗原将在大肠杆菌中表达，而所述试剂蛋白将在酵母中表达。
表达策略首先涉及设计所述重组抗原的一级结构。一般来说，将表达融合配偶体(EFP)置于N末端以改善表达水平，所述N末端也可包括用于调节所述抗原的免疫原性特性的区，即免疫融合配偶体(IFP)。此外，在所述C末端包括用于有利于进一步纯化的亲和融合配偶体(AFP)。
当获得重组株时，通过评估表达水平和通过分析粗提取物行为进一步预测所述蛋白溶解度，从而表征所述重组产物。
在合适的培养基中培养并诱导所述重组蛋白表达后，通过SDS-PAGE分析总提取物。所述重组蛋白在染色凝胶中显现，并使用特异性抗体通过蛋白质印迹分析进行鉴定。
评估比较不同形式的表达抗原使得可以选择用于进一步纯化和免疫评估的最有潜力的候选抗原。以大肠杆菌AR120表达设计并制备以下构建物使缺失N-末端和C-末端的基因CASB618(Δ1-74；Δ247-320aa)克隆在载体pMG81(pr PL长)中，所述载体在N-末端加入了IFP(编码流感病毒NS1蛋白的N-末端1-81氨基酸的NS1 DNA序列)而且具有C-末端组氨酸尾(SEQ ID NO4)。 所获得质粒称为pRIT 15081。使用萘定酮酸诱导型宿主细胞大肠杆菌AR120。通过加入萘定酮酸使其终浓度为60ng/ml而达到对3L LB培养基+卡拉霉素中的大肠杆菌培养物的诱导。于37℃培养培养物4.5小时。
离心诱导的培养物获得沉淀物，使之重新悬浮于60ml PBS缓冲液中。然后用弗氏压碎器破碎细胞。然后以16000g离心20分钟细胞裂解液。我们在沉淀物中发现了表达蛋白(图3)。
纯化方案遵循一个传统的方法，该方法基于所述重组蛋白中存在His亲和尾。在一个典型的实验中，过滤破碎细胞，将无细胞提取物加载到特异性保留所述重组蛋白的离子金属亲和层析柱(IMAC；Ni++NTA，Qiagen)上。保留蛋白用0-500mM咪唑梯度的磷酸缓冲液(可能存在去污剂)洗脱。纯化流程详述如下
平衡缓冲液NaH2Po4100mM PH8Tris 10mMNaCl 150mMGuHCl 6M样品在GuCl 6M中的沉淀物洗涤缓冲液NaH2PO4100mM PH6,3Tris 10mM尿素 8M洗脱缓冲液NaH2PO4100mM PH4,5Tris 10mM咪唑 500mM尿素 8M
500mM咪唑+8M尿素中的洗脱蛋白
-PBSPH7.5+肌氨酰2％+6M尿素 1hrs- “ 4M尿素 1小时- “ 2M尿素 1小时- “ 0M尿素 4℃过夜
对最终纯化产物用Lowry蛋白测定法测定终浓度(1mg/ml)(见图4)。体外转录/翻译CASB618基因产物用体外联合的转录/翻译进行表征。将克隆CASB618的全长编码序列克隆入SP72载体(Promega)中，SP72载体是可以体外转录的载体。利用加入S35蛋氨酸的TNT T7偶联的网织红细胞裂解液(Promega cat.n°L4611)的体外表达显示35 Kd产物，它在犬胰腺微粒体膜(Promega cat.n°Y4041)存在下降解为30 Kd。该结果提示根据预期的47个氨基酸的信号肽加工信号肽，而且说明所述蛋白在体内是结合在膜上或者为分泌蛋白。这些实验按照Promega推荐的方案进行。7.2抗体产生和免疫组织化学可以使用小量相对纯化的蛋白制备免疫工具，目的是(a)通过正常组织或癌组织切片的免疫组织化学检测表达；(b)检测表达并在纯化过程中监测所述蛋白(ELISA/蛋白质印迹)；或(c)特征鉴定/定量所纯化的蛋白(ELISA)。7.2.1多克隆抗体免疫接种使用以佐剂3D-MPL/QS21配制的100μg蛋白，以3周间隔3次肌肉注射(I.M.)免疫接种2-3只兔。每次免疫后3周，取血液样品，使用所述蛋白作为包被抗原，根据标准方法通过ELISA检测血清抗体滴度。ELISA用5μg蛋白在4℃下包被96孔微量板(maxisorb Nunc)过夜。在37℃下用PBS NCS 1％饱和1小时后，加入连续稀释的兔血清在37℃处理1小时30分钟(开始于1/10)。用PBS Tween洗涤3次后，加入抗兔生物素化抗血清(Amersham)(1/5000)。洗板，并加入过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(1/5000)在37℃处理30分钟。洗涤后，加入50μl TMB(BioRad)7分钟，然后用0.2M H2SO4终止反应。在450nm下测量OD，并通过SoftmaxPro计算中点稀释度。7.2.2单克隆抗体