专利名称：一种含多肽链段的杂化涂层的制备方法牙种植技术被称为是20世纪牙科史上最令人瞩目的一大进展，牙种植术是在骨 结合理论的基础上发展起来的。研究表明骨整合是影响种植成功的关键因素，排除外科操 作技术和患者个体差异(种植部位骨量及其骨质的情况等)这两种因素的影响，种植体表面 形貌和化学性质对于种植体骨整合性能具有决定性的影响。人们发现具有羟基磷灰石(HA) 涂层的种植体和骨组织生物固定的速度快且长期的成功率显著高于没有HA涂层的种植 体。但是，临床上和骨组织具有良好结合的HA涂层和钛金属种植体本体的剥离，是这种具 有HA涂层的钛种植体面临的一个很严重的问题。层层自组装技术(LbL技术)是一种有效的表面改性方法。它具有操作简单，制备 条件温和，方便可控，能连续生产等特点，而且无论固体支持物形貌如何，最后均能得到物 理化学性质均一的聚电复合膜。这种聚电复合膜在干燥环境中具有很高的稳定性，研究发 现具有电荷性质的聚电解质和两性聚电解质、纳米无机粒子等都可以利用LbL技术被引入 到支持物表面。本发明公开一种LbL技术制备的含有RGD的胶原/纳米羟基磷灰石杂化涂 层的制备方法，对于体内各种硬组织修复用钛基种植体表面改性都适用。
本发明的目的是提供一种含多肽链段(RGD)的杂化涂层的制备方法，通过以下步 骤实现(1)制备多肽链段(RGD)接枝的聚电解质合成GRGDSP多肽链段(由SciLight Biotechnology, LLC公司合成)，该多肽链段为水溶性多肽。首先将GRGDSP多肽链段和聚 电解质溶解在水溶液中，配置成混合溶液，然后加入碳化二亚胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide，EDC]/N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)催 化体系，室温下反应4小时，实现聚电解质的改性，然后将所得到的产物纯净水中透析2周， 最后冻干，得到RGD接枝的聚电解质；其中所述聚电解质选用透明质酸、硫酸软骨素，得到的产物是RGD接枝的透明质酸或 RGD接枝的硫酸软骨素，透明质酸和硫酸软骨素的分子量为100-5000000D。(2)聚电解质溶液的配置将步骤(1)获得的RGD接枝的聚电解质(RGD接枝的透 明质酸或RGD接枝的硫酸软骨素)用NaCl溶液配置成溶液，作为聚阴离子电解质溶液；将 I型胶原(猪源、牛源或鼠源)配置成溶液，然后将羟基磷灰石纳米粒子分散于胶原溶液中， 作为聚阳离子电解质溶液；(3)杂化聚电解质涂层的制备利用静电自组装技术，首先将钛基种植体浸入步骤(2) 中的聚阳离子电解质溶液，沉积一定时间后，充分水洗，然后浸入到步骤(2)配置的RGD接枝的聚电解质溶液(RGD接枝的透明质酸溶液或RGD接枝的硫酸软骨素溶液)中，沉积一定 时间后，充分水洗；以上操作记为一次沉积循环，根据需要重复以上循环操作，最后得到需 要的聚电解质复合层；然后，室温下，该聚电解质复合层在戊二醛溶液或者京尼平溶液中浸 泡一段时间，取出，充分水洗，得到含RGD的杂化聚电解质复合涂层。步骤(1)中，聚电解质的溶液浓度为0. l-50mg/ml，其中最佳浓度为5mg/ml ；所述 的多肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比例为1:10000-1 :1，其中最佳浓度比率为 1 :20-50 ；所述的EDC/NHS的用量为1 1 - 20 :1，其中最佳浓度比例为10-5 1 ；EDC的用量 与多肽链段的用量的摩尔比例为1 :1 - 10 :1，其中最佳浓度比例为2-5 :1。步骤(2)中聚电解质溶液的浓度范围为0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳浓度范围为 0. 5-lmg/ml，其中聚电解质溶液中NaCl浓度为0. 1-0. 2mol/L。步骤(2)中纳米羟基磷灰石的粒径为20 rniTlOO nm。步骤(3)中聚电解质层所用的沉积时间为5mirT20min，聚电解质复合层的沉积循 环为0. 5到50次，根据实际临床用途确定最后的沉积循环数，其中口腔用牙种植体的表面 沉积最佳循环是4-10次，最外层为RGD修饰的聚电解质层。步骤(3)中聚电解质复合层在 戊二醛溶液中的浸泡时间为1-10小时，最佳时间为2-4小时，戊二醛的浓度为0. 1-5%，其中 最佳浓度为0. 5-2% ；在京尼平溶液中浸泡时间为I-M小时，最佳时间为2-6小时，京尼平 的浓度为0. 1_10%，其中最佳浓度为0. 5-5%。步骤(3)中所用的种植体表面为各种永久植入型种植体表面，可以选用经氧化性 酸处理的纯钛或者钛合金表面、非氧化型酸处理的纯钛或者钛合金种植体表面、喷砂/酸 处理的表面、各种碱热法得到的纯钛或者钛合金种植体表面、电化学得到的各种表面、各种 羟基磷灰石涂层的纯钛或者钛合金种植体表面、钛或者羟基磷灰石喷浆表面的纯钛或者钛 合金种植体表面、钛喷浆/酸处理的纯钛或者钛合金表面、离子注入的各种纯钛或者钛合 金种植体表面、或激光处理的各种纯钛或者钛合金种植体表面。本发明针对牙科种植体的应用特性，利用LbL技术，采用胶原和羟基磷灰石纳米 粒子与透明质酸或者硫酸软骨素在种植体表面构建有机/无机杂化的聚电解质涂层，由于 纳米羟基磷灰石粒子能够在体内较快的吸收，因此，涂层能够在体内显示羟基磷灰石对骨 组织再生的活性，又可在骨组织重构完成后被及时吸收；同时，这种含有RGD杂化涂层的种 植体材料，初期将会促进骨细胞在种植体表面的粘附；随后，可以促进骨细胞的分化、增殖 以及细胞外基质的产生；最后，随着活性涂层被人体吸收，达到新的骨组织在种植体表面的 重构。
图1细胞在钛片上的黏附和增殖。图2是碱性磷酸酶ALP的测定。图3是骨钙素OC的测定。图4是AKP_2mRNA表达水平。图5是Runx_2mRNA表达水平。图6是OsxmRNA表达水平。

实施例一含RGD的杂化(胶原+纳米羟基磷灰石粒子)/透明质酸聚电解质复合层的
制备
取一定量的透明质酸溶解于水中，加入GRGDSP溶解，最后加入EDC/NHS溶解，反应4小 时，反应产物透析2周，冻干RGD接枝的透明质酸。将该RGD接枝的透明质酸和胶原分别溶解于0. lmol/L的NaCl溶液中，二者浓度 都为lmg/ml，然后在胶原溶液中加入粒径为40nm的羟基磷灰石粒子进行分散，纳米羟基磷 灰石粒子的最终浓度为0. 5 mg/ml ；用机械打光的方法将医用纯钛或者钛合金表面打光， 然后浓H2SO4和浓H2O2的混合溶液浸泡一段时间，其中H2SO4 =H2O2的体积比为1.5:1 1 3浸泡时间为30min，大量去离子水冲洗干净，获得种植体表面。然后将该种植体浸泡于胶 原溶液中lOmin，去离子水洗去物理吸附胶原；然后，再浸泡与R⑶修饰的透明质酸溶液中 lOmin，去离子水洗去物理吸附的透明质酸。重复以上操作，最后得到6个沉积循环的聚电 解质复合层。将该聚电解质复合层涂层的种植体浸泡于1%戊二醛中2小时交联，随后大量 水洗，吹干，得到稳定的含RGD的杂化(胶原+纳米羟基磷灰石粒子)/透明质酸聚电解质复 合层涂层的种植体。
实施例二 含RGD的杂化(胶原+纳米羟基磷灰石粒子)/透明质酸聚电解质复合层的
制备
方法同实施例一，区别在于将1%戊二醛溶液更换为1%京尼平溶液，对涂层进行交联， 交联时间为3小时。
实施例三含RGD的杂化(胶原+纳米羟基磷灰石粒子)/硫酸软骨素聚电解质复合层 的制备
方法同实施例一，区别在于将透明质酸更换为硫酸软骨素。
实施例四含RGD的杂化(胶原+纳米羟基磷灰石粒子)/硫酸软骨素聚电解质复合层 的制备
方法同实施例三，区别在于将1%戊二醛溶液更换为1%京尼平溶液，对涂层进行交联， 交联时间为3小时。
实施例五体外生物学评价
使用小鼠成骨前体细胞细胞系MC3T3-E1 (中国科学院细胞库)来评测该涂层的体外生 物学性能。对照组为纯钛片组(cp-Ti)，试验组为(胶原+纳米羟基磷灰石)/RGD改性的透明质酸交联的杂化聚电解质涂层组(cross 1 inked coating)。a.成骨细胞在钛片上黏附(attachment)、增殖(proliferation)能力的检测参见 图1。b.成骨前体细胞在钛片上分化能力的检测 碱性磷酸酶活性的检测(ALP)参见图2。细胞培养基中骨钙素含量的检测(OC)参见图3。c.成骨相关基因表达的检测
本实验采用实时定量RT-PCR的方法来分析成骨相关基因的表达变化。分别检测碱性 磷酸酶(AKP-2 mRNA)(参见图4)，Osx mRNA (参见图5)及Runx2 mRNA (参见图6)的表 达。1)细胞总RNA的提取
本实验采用能提取高质量RNA的专用试剂盒(RNeasy Mini kit, Qiagen, German)。
该试剂盒包含以下几部分
a.RNeasy Mini Spin Columns (pink)50
b.Collection Tubes (1. 5ml)50
c.Collection Tubes (2ml)50
d.Buffer RLT45ml
e.Buffer Rffl45ml
f.Buffer RPE(5 X)Ilml
g.RNase — Free Water10ml
h.Handbook1
为了去除总RNA中残留的微量DNA，可以用试剂盒(RNase — free DNase Set)，包含 Buffer RDD 禾口 DNase I stock solution 两部分。RNA提取前的准备
1.每毫升BufferRLT使用前最好加10 μ 1巯基丙醇(β — ME)
2.1体积的Buffer RPE加4体积的无水酒精配成工作液 具体操作步骤
1.收集细胞，不超过10*7个细胞。在规定的时间点，将装有钛片的细胞培养板从培养 箱中取出，倒掉培养基，将钛片在PBS里冲洗2遍，并转移到新的细胞培养板中。接着每片钛 片表面加Buffer RLT 200 μ 1 (平行样本3片共600 μ 1)，摇床处理数分钟，收集到RNA-free EP管中(可-80度长期保存)。2.加一体积的70%乙醇(DEPC水配)，混勻，勿离心。3.取700μ 1置于柱子中，盖上，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。4.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。5. 10 μ 1 Dnase原液+70μ1 Buffer RDD共80 μ 1加在柱子中的硅胶膜上，室温 静置15min。6.取350 μ 1 Buffer RWl置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。7.取500 μ 1 Buffer RPE置于柱子中，IOOOOrpm离心15s，倒掉流出液。8.取 500 μ 1 Buffer RPE 置于柱子中，IOOOOrpm 离心 2min，弃管。
9.将柱子放置于1. 5ml RNA-free EP新管中，将30 μ 1 RNA-free水加在柱子中 的硅胶膜上，盖上，IOOOOrpm离心Imin以洗脱RNA。刚提取的总RNA马上置于冰上，接着行RNA纯度及浓度检测(用紫外分光光度计)。 当RNA的A260/A280介于1. 8 2. 0之间，说明提取的RNA质量好，可用于下一步实验。2 )总RNA逆转录成cDNA
所用试剂盒逆转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit, Code DRR037A, TAKARA,大连宝生物工程有限公司)。该试剂盒推荐一个反应体系为10 μ 1。具体的步骤为
5 X primescript buffer2 μ 1
Primescript TR Emyne Mix I0. 5 μ 1
Random 6 mer(IOOum)0. 5 μ 1
Oligo dT prime(50um)0. 5 μ 1
Total RNA500ng
+ Rnase freeH20至 10 μ 1
37° 水浴 15min 85°水浴IOS cDNA -20° 保存 3)引物的设计和合成
Realtime RT-PCR所用引物由大连宝生Takara公司设计合成，具体见表1。表1:目的基因的正向和反向引物


本发明提供一种含多肽链段的杂化涂层的制备方法，通过制备多肽链段接枝的聚电解质，配置聚电解质溶液，利用LbL技术，采用胶原和羟基磷灰石纳米粒子与透明质酸或硫酸软骨素在种植体表面构建有机/无机杂化的聚电解质涂层，得到含RGD的杂化聚电解质复合涂层。由于纳米羟基磷灰石粒子能够在体内较快的吸收，因此，涂层能够在体内显示羟基磷灰石对骨组织再生的活性，又可在骨组织重构完成后被及时吸收；同时，这种含有RGD杂化涂层的种植体材料，初期将会促进骨细胞在种植体表面的粘附；随后，可以促进骨细胞的分化、增殖以及细胞外基质的产生；最后，随着活性涂层被人体吸收，达到新的骨组织在种植体表面的重构。